Summary
Die in diesem Beitrag beschriebenen Methoden zeigen, wie ein Handels Tintenstrahldrucker in eine Bioprinter mit gleichzeitiger UV-Polymerisation zu konvertieren. Der Drucker ist in der Lage, 3D-Konstruktion von Gewebestruktur mit Zellen und Biomaterialien. Die Studie zeigte hier konstruierte eine 3D neocartilage.
Abstract
Bioprinting, die auf thermische Tintenstrahldruck basiert, ist einer der attraktivsten Technologien auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Mit digitalen Kontrollzellen, Gerüste und Wachstumsfaktoren genau auf die gewünschte zweidimensionale (2D) aufgebracht werden und dreidimensionale (3D) Stellen schnell. Daher ist diese Technologie ein idealer Ansatz, um Gewebe imitiert ihre Mutter anatomischen Strukturen herzustellen. Um mit nativen Knorpel zonale Organisation, Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM), und die mechanischen Eigenschaften zu konstruieren, entwickelten wir eine Bioprinting Plattform mit einem handelsüblichen Tintenstrahldrucker mit gleichzeitiger Photopolymerisation Lage für 3D-Knorpel Tissue Engineering. Menschlichen Chondrozyten in Poly (ethylenglykol) diacrylat (PEGDA) suspendiert wurden für 3D neocartilage Konstruktion über Schicht-für-Schicht-Anordnung gedruckt. Die gedruckten Zellen wurden bei ihrer ursprünglichen hinterlegt Positionen fixiert, durch die Surro unterstütztunding Gerüst gleichzeitige Photopolymerisation. Die mechanischen Eigenschaften des Gewebes gedruckt waren ähnlich dem nativen Knorpel. Im Vergleich zu herkömmlichen Herstellungsgewebe, die längere UV-Belichtung erfordert, die Lebensfähigkeit der Zellen bei gleichzeitiger gedruckt Photopolymerisation war signifikant höher. Gedruckt neocartilage zeigte eine hervorragende Glykosaminoglykan (GAG) und Kollagen-Typ-II-Produktion, die im Einklang mit Gen-Expression war. Daher ist diese ideale Plattform für die genaue Zellverteilung und Anordnung zur anatomischen Tissue Engineering.
Introduction
Basierend auf Thermo-Inkjet-Druck Bioprinting ist eine der aussichtsreichsten Schlüsseltechnologien auf dem Gebiet des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin. Mit Digitalsteuerung und einen hohen Durchsatz Druckköpfe Zellen, Gerüste und Wachstumsfaktoren kann präzise auf die gewünschte zweidimensionale (2D) aufgebracht werden und dreidimensionale (3D-) Positionen schnell. Viele erfolgreiche Anwendungen wurden mit dieser Technologie in Tissue Engineering und der regenerativen Medizin 9.1 erreicht. In dieser Arbeit wurde ein Bioprinting Plattform mit einer modifizierten Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 thermische Tintenstrahldrucker und einer gleichzeitigen Photopolymerisation System. Synthetische Hydrogele aus Poly (Ethylenglycol) (PEG) formuliert haben, die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung und Förderung der Lebensfähigkeit von Chondrozyten chondrogene ECM Produktion 10,11 gezeigt. Darüber hinaus ist photovernetzbares PEG in Wasser mit niedriger Viskosität, die es ideal für die gleichzeitige Polyme macht sehr gut löslichrization während der 3D-Bioprinting. In diesem Papier, humanen Chondrozyten in Poly (Ethylen) Glykoldiacrylat (PEGDA; 3.400 MW) suspendiert wurden gedruckt, um genau neocartilage Schicht-für-Schicht mit 1.400 dpi Auflösung in 3D zu konstruieren. Homogene Verteilung der abgeschiedenen Zellen in einem 3D-Gerüst beobachtet, die Knorpelgewebe mit ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften und verbesserter ECM Produktion erzeugt. Hingegen in der manuellen Fertigung der Zellen am Boden des Gels statt ihrer anfänglich abgeschiedenen Positionen aufgrund langsamer Gerüst Polymerisation, die zu inhomogenen Knorpelbildung nach der Kultur akkumuliert 2,3 führte.
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Protocol
1. Bioprinting Platform Gründung
Der Drucker Modifikation wurde auf einem HP Deskjet 500 Thermo-Inkjet-Drucker und HP 51626A schwarz Tintenpatrone basiert.
- Entfernen Sie die obere Plastikabdeckung des Druckers und vorsichtig lösen das Bedienfeld aus dem Cover.
- Lösen Sie die drei Kabelverbindungen zwischen Drucker oberen Teil und Basis. Entfernen Sie die Drucker oberen Teil von der Basis.
- Auf dem oberen Teil Drucker, entfernen Sie den kleinen Kunststoff-und Gummi Zubehör (Druckkopfreinigung) auf der rechten Seite unter der Tintenpatrone.
- Entfernen Sie die Basis des Papierkassette mit Federn.
- Entfernen Sie die Metallplatte, die die Kunststoffpapierzufuhr-Bar.
- Schneiden Sie den Kunststoff-Papierzufuhr-Bar in der Mitte Zuführungsrad Position mit einer Handsäge oder andere Schneidwerkzeug.
- Entfernen Sie die 2 Papiereinzugsräder nach dem vorherigen Schritt ausgesetzt. Die Kunststoffscheibe ist sehr hart und eine elektronischeSäge wird hilfreich sein.
- Reinigen Sie den Staub und Schmutz mit Pressluft und Ethanol Tücher.
- Bringen Sie den Drucker oberen Teil an der Basis.
- UV die modifizierte Drucker für mindestens 2 Stunden in einer Steril vor der Verwendung zu sterilisieren.
- Schneiden Sie die Kappe eines HP 51626A Tintenpatrone mit einer Handsäge oder andere Schneidwerkzeug.
- Leeren Sie die Tinte und die Filter, die den Boden gut Reservoir der Knorpel bedeckt entfernen.
- Spülen Sie die Patrone gründlich mit fließendem Leitungswasser.
- Ultrasonicate die Kassette in deionisiertem (DI) Wasser für 10 min, um die restliche Tinte zu entfernen.
- Untersuchen Sie die Patrone, um sicherzustellen, dass alle die Tinte entfernt wurde. Spülen oder Spray die Patrone gründlich mit 70% Ethanol für die Sterilisation, gefolgt von DI-Wasser sterilisiert.
- Richten Sie eine langwelligen UV-Lampe über die Druckplattform, um die gleichzeitige Photopolymerisation Kapazität bereitzustellen.
- Messen UV-Intensität an der Druckplattform unter Verwendung eines UV-LichtMeter. Den Abstand zwischen der UV-Lampe und der Druckerplattform, so dass die Intensität an dem Druckgegenstand zwischen 4-8 mW / cm 2 (etwa 25 cm von der Lampe zu der Druckerplattform).
2. Bioink Vorbereitung
- Monolayer Chondrozyten-Erweiterung
- Platte 5 Millionen humanen Chondrozyten in jeder T175 Gewebekulturflasche für Zellexpansion in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum und 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) ergänzt. Kulturzellen bei 37 ° C mit befeuchteter Luft mit 5% CO 2. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage, bis der Kolben beträgt 85% Zusammenfluss. Verwenden Sie Zellen aus der gleichen Passage.
- Auflösen PEGDA in PBS auf eine Endkonzentration von 10% w / v. Hinzufügen Photoinitiator I-2959 in einer Endkonzentration von 0,05% w / v. Filter sterilisieren die Lösung.
- Aussetzen kultivierten menschlichen Chondrozyten in dem hergestellten PEGDA Lösung bei 5 x 10 6 Zellen /ml.
3. Knorpelgewebe Printing
- Schalten Sie den Drucker und Laptop.
- Erstellen Sie ein Druckmuster aus einem festen Kreis mit 4 mm Durchmesser unter Verwendung von Microsoft Word oder Adobe Photoshop.
- Stellen Sie die Position des Musters und sicherzustellen, dass es genau in die Kunststoffform drucken.
- Berechnen der Anzahl der Drucke, um die gewünschte Dicke der Gerüst erreichen. Für 4 mm in der Höhe, 220 Drucke sind erforderlich, um die gewünschte Gerüst erstellen.
- Laden Sie die bioink in die Tintenpatrone. Decken Sie die Patrone mit Aluminiumfolie aus der direkten UV-Exposition während des Druckvorgangs zu schützen.
- Druckbefehl an den Drucker senden. Ziehen Sie den Papiersensor, wenn der Drucker zu drucken beginnt. Der gesamte Druckprozess weniger als 4 min für ein Gerüst mit 4 mm Durchmesser und 4 mm in der Höhe zu nehmen.
- Über gedruckt neocartilage zu einem 24-Well-Platte und fügen 1,5 ml Kulturmedium in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die gedruckte neocartilage in LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Arbeitslösung bei Raumtemperatur für 15 min im Dunkeln.
- Schneiden Sie die Zelle beladene Hydrogel in der Mitte und nehmen Fluoreszenzbilder von den Schneidbereich.
- Graf Live-(grün) und toten (rot) Zellen durch einen verblindeten Beobachter bei fünf zufällig aufgenommenen Bilder. Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen, indem die Anzahl von lebenden Zellen durch die Gesamtzahl an lebenden und toten Zellen.
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Representative Results
Die modifizierte Thermo-Inkjet-Drucker der Lage war, für Zell-und Gerüst-Abscheidung bei hohem Durchsatz und exzellente Lebensfähigkeit der Zellen. Kombination mit gleichzeitiger Photopolymerisation und empfindlichen Biomaterialien, ist diese Technologie in der Lage, um die Zellen und andere Druck Substanzen zu den anfänglich abgeschiedenen Orten zu fixieren. Gemäß den Eigenschaften des modifizierten thermischer Tintenstrahldrucker der 2D Druckauflösung von 300 dpi mit einer einzigen Tintentropfenvolumen von 130 pl. Es gibt 50 Brenn Düsen in jeder Druckkopf mit 3,6 kHz Feuerfrequenz 12,13. Daher für eine repräsentative Konstruktion von 4 mm Durchmesser und 4 mm Höhe, das Volumen und die Dicke jeder Schicht während der gedruckten Schicht-für-Schicht-Aufbau wurden 0,23 &mgr; l und 18 &mgr; m. Der gesamte Druckprozeß dauerte weniger als 4 Minuten, um den Knorpelgewebe (1) zu konstruieren.
2A zeigt eine noch Zellverteilung von printed Chondrozyten in 3D-Gerüst durch gleichzeitiges Photopolymerisation der umgebenden Gerüst während der Zellabscheidung. Dagegen ohne gleichzeitige Photopolymerisation (polymerisierten Gerüst nach Zellaussaat) sank die abgeschiedenen Zellen an der Unterseite oder zonale Schnittstelle anstelle der anfänglich abgeschiedenen Orten aufgrund der Schwerkraft (Fig. 2B). Diese Zellanreicherung wurde auch in früheren Berichten der manuellen Herstellung von Knorpelgewebe 14,15 beobachtet. Die gedruckten menschlichen Chondrozyten in 3D PEG Hydrogel gewonnen chondrogenen Phänotyp zeigten allmählich erhöht Proteoglykanproduktion während der Kultivierung (3) 3.
Abbildung 1. Gedruckt neocartilage Gewebe. A) Schematische Darstellung der Knorpel Bioprinting mit gleichzeitiger Photopolymerisation und lagER-für-Schicht-Anordnung. B) Eine gedruckte neocartilage Gewebe mit 4 mm Durchmesser und 4 mm in der Höhe. Maßstabsbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Chondrozyten mit grün und orange Fluoreszenzfarbstoffen markiert demonstriert die zonale Knorpel Bioprinting Machbarkeit. A) bedruckt Zellen behielten ihre anfänglich abgeschiedenen Positionen im 3D-Hydrogel. Das Druck-und Photopolymerisationsverfahren in 4 min mit Zelllebensfähigkeit von 90% (n = 3). B) Zellen auf den Boden oder die Schnittstelle angesammelt aufgrund der Schwerkraft ohne gleichzeitige Photopolymerisation abgeschlossen. Es dauerte 10 min UV-Bestrahlung, um das Konstrukt mit der gleichen Größe von A mit einer Lebensfähigkeit der Zellen von Gel63% (n = 3). Maßstabsbalken = 100 &mgr; m.
Abbildung 3. Safranin-O-Färbung von gedruckten Chondrozyten in PEG-Hydrogel zeigt erhöhte Proteoglykanproduktion während der Kultur. Maßstabsbalken = 100 um.
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Discussion
Diese 3D-Bioprinting System mit gleichzeitiger Photopolymerisation Kapazität bietet eine deutlich größere Druckauflösung als die besten zuvor berichtet Verfahren der In-situ Druck von osteochondralen Defekten mit Spritze extrudiert eine zelluläre Alginat-Hydrogel-16. Höhere Druckauflösung ist für die Knorpelgewebetechnik besonders wichtig, um die anatomischen Knorpel zonale Organisation wiederherzustellen. Gleichzeitige Photopolymerisation in Schicht-für-Schicht-Anordnung ist entscheidend, um genaue Ablagerung von Zellen und Biomaterial Gerüste für 3D-Konstruktion zu erhalten. Mikrofabrikation mit jedem gedruckten Schicht führte auch fließende Übergänge zwischen zonalen Schichten, minimiert das Potenzial für den Abbau durch Delamination. Durch die exakte Anpassung der Parameter und Komponenten Bioprinting der bioink, werden wir in der Lage, die erforderlich ist, um eine Vielzahl von Knorpelschäden heilen komplexe 3D-Strukturen herzustellen.
Mit synergistic Wachstumsfaktor-Stimulation, hatte die bioprinted neocartilage die besten chondrogenen Phänotyp und die meisten Zellproliferation 3. Daher ist die Zellaussaatdichte in dieser Studie verwendet, die denkbar Bioprinting ist, ist auch für die Knorpelregeneration, wenn sie mit geeigneten Wachstumsfaktoren behandelt. Knorpelreparatur autologe Chondrozyten stark in klinischen Anwendungen aufgrund der begrenzten Anzahl von Chondrozyten in Biopsie geerntet beschränkt. Die Implantation der autologen Chondrozyten direkt geerntet oder mesenchymalen Stammzellen (MSCs), zusammen mit Biomaterialien für die Knorpelreparatur ohne Mono Erweiterung ist überaus attraktiv. Daher ist es wichtig, die gedruckt Zellzahlen die optimale Zelldichte für die Knorpelbildung, ohne die Qualität der Knorpelmatrix angesichts der begrenzten Zellzahlen erforderlich erweitern. Auch die Begrenzung Anfangszelldichte wird erheblich optimieren und maximieren die Bioprinting Auflösung. Somit ist die bioprinhier beschriebenen ting Verfahren ist vollständig kompatibel mit den Zahlen geringen Zell in klinischen Einstellung und hat das Potenzial, für Knorpel Tissue Engineering verwendet werden.
Im Ergebnis zeigt unsere Arbeit die Machbarkeit der Herstellung anatomischer Knorpelstrukturen durch die Bereitstellung von Chondrozyten und Biomaterial-Gerüstmaterialien präzise gezielt Positionen. Eine PEG-Hydrogel mit humanen Chondrozyten wurde kontinuierlich über Schicht-für-Schicht-Montage bioprinted. Gleichzeitige Photopolymerisation erhalten Sie die gedruckten Zellen in ihrer ursprünglichen Depotpositionen und geringere Phototoxizität. Die Zellen in der gedruckten neocartilage gehalten chondrogenen Phänotyp mit konsistenten Gen-Expression und biochemische Analyse 2. Daher ist diese Technik eine vielversprechende Voraus für anatomische Knorpelgewebetechnik.
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Disclosures
Die Autoren haben kein finanzielles Interesse an dieser Studie.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung von der New York Capital Region Research Alliance Grants anzuerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
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