Summary
I metodi descritti in questo documento mostrano come convertire una stampante a getto d'inchiostro di commercio in un bioprinter con polimerizzazione UV simultanea. La stampante è in grado di costruire la struttura del tessuto 3D con cellule e biomateriali. Lo studio ha dimostrato qui costruito un neocartilage 3D.
Abstract
Bioprinting, che si basa sulla stampa a getto d'inchiostro termico, è una delle tecnologie abilitanti più interessanti nel campo dell'ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Con cellule di controllo digitale, ponteggi e fattori di crescita possono essere depositati esattamente alla desiderata bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) riprese rapidamente. Pertanto, questa tecnologia è un approccio ideale per fabbricare tessuti mimano loro strutture anatomiche native. Al fine di progettare la cartilagine con l'organizzazione nativo zonale, composizione della matrice extracellulare (ECM), e le proprietà meccaniche, abbiamo sviluppato una piattaforma bioprinting utilizzando una stampante a getto d'inchiostro commerciale con fotopolimerizzazione contemporanea capace per 3D cartilagine ingegneria dei tessuti. Condrociti umani sospesi in poli (glicole etilenico) diacrilato (PEGDA) sono stati stampati per la costruzione neocartilage 3D via assemblaggio layer-by-layer. Le cellule stampati sono stati fissati sui loro posizioni originali depositati, sostenuto dal ampliata daFINANZIAMENTO impalcatura in fotopolimerizzazione simultanea. Le proprietà meccaniche del tessuto stampato erano simili alla cartilagine nativa. Rispetto alla fabbricazione tessuto convenzionale, che richiede l'esposizione UV più, la vitalità delle cellule stampati con fotopolimerizzazione simultanea era significativamente maggiore. Neocartilage Stampato dimostrato eccellente glicosaminoglicani (GAG) e la produzione di collagene di tipo II, che era coerente con l'espressione genica. Pertanto, questa piattaforma è ideale per la distribuzione delle cellule accurate e arrangiamento per l'ingegneria tissutale anatomica.
Introduction
Bioprinting basata sulla stampa a getto d'inchiostro termico è una delle tecnologie abilitanti più promettenti nel campo dell'ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa. Con controllo digitale e high throughput testine fattori cellule, scaffold, e crescita possono essere depositati esattamente alla desiderata bidimensionale (2D) e (3D) posizioni tridimensionali rapidamente. Molte applicazioni di successo sono stati realizzati con questa tecnologia in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa 1-9. In questo lavoro, una piattaforma bioprinting è stato istituito con una Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 stampante a getto d'inchiostro termico modificato e un sistema di fotopolimerizzazione simultanea. Idrogel sintetici formulati da poli (glicole etilenico) (PEG), hanno dimostrato la capacità di mantenere la vitalità dei condrociti e promuovere la produzione ECM condrogenico 10,11. Inoltre, photocrosslinkable PEG è altamente solubile in acqua a bassa viscosità, che lo rende ideale per polyme simultanearizzazione durante bioprinting 3D. In questo lavoro, condrociti umani sospesi in poli (etilene) diacrilato glicole (PEGDA; MW 3.400) sono stati stampati proprio per costruire neocartilage layer-by-layer con 1.400 dpi risoluzione 3D. È stata osservata una distribuzione omogenea di cellule depositate in un ponteggio 3D, che ha generato tessuto cartilagineo con eccellenti proprietà meccaniche e produzione ECM migliorata. Per contro, nella fabbricazione manuale cellule accumulate sul fondo del gel invece delle loro posizioni inizialmente depositati causa del rallentamento della polimerizzazione ponteggio, che ha portato alla formazione di cartilagine disomogenea dopo coltura 2,3.
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Protocol
1. Bioprinting Platform Establishment
La modifica stampante è basata su una stampante a getto d'inchiostro termico HP Deskjet 500 e HP 51626a cartuccia di inchiostro nero.
- Rimuovere il coperchio di plastica superiore della stampante e con attenzione rimuovere il pannello di controllo dal coperchio.
- Staccare i 3 cavi di collegamento tra la parte superiore della stampante e base. Rimuovere la parte superiore della stampante dalla base.
- Sulla parte superiore della stampante, rimuovere la piccola plastica e gomma accessori (sistema di pulizia delle testine di stampa) a destra sotto la cartuccia di inchiostro.
- Rimuovere la base del vassoio carta con le molle.
- Rimuovere la piastra metallica che copre la barra di alimentazione della carta plastica.
- Tagliare la barra di alimentazione della carta plastica alla posizione della ruota di alimentazione centrale con una sega a mano o altro utensile da taglio.
- Rimuovere le 2 ruote alimentazione della carta esposti dopo il passaggio precedente. La plastica ruota è molto duro e un sistema elettronicosega sarà utile.
- Pulire la polvere e detriti utilizzando salviette di aria e di etanolo in scatola.
- Fissare la parte superiore della stampante alla base.
- UV sterilizzare la stampante modificata per almeno 2 ore in una cappa a flusso laminare prima dell'uso.
- Tagliare il tappo di una cartuccia d'inchiostro HP 51626a con una sega a mano o altro utensile da taglio.
- Svuotare l'inchiostro e rimuovere il filtro che copre il serbatoio ben inferiore della cartilagine.
- Sciacquare la cartuccia accuratamente con acqua corrente.
- Ultrasonicate la cartuccia in deionizzata (DI) per 10 minuti per rimuovere l'inchiostro residuo.
- Esaminare la cartuccia per assicurarsi che tutto l'inchiostro è stato rimosso. Risciacquare o spruzzare la cartuccia accuratamente con etanolo al 70% per la sterilizzazione, seguita da acqua deionizzata sterile.
- Impostare una lampada a raggi ultravioletti lunghezza d'onda sulla piattaforma di stampa per fornire capacità di fotopolimerizzazione simultanea.
- Misurare l'intensità UV alla piattaforma di stampa con una luce UVmeter. Regolare la distanza tra la lampada UV e la piattaforma stampante così l'intensità verso il soggetto di stampa è tra 4-8 mW / cm 2 (circa 25 cm dalla lampada alla piattaforma stampante).
2. Bioink Preparazione
- Espansione Monolayer condrociti
- Piatto 5 milioni di condrociti umani in ogni T175 tessuto pallone di coltura per l'espansione di cellule in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) supplementato con siero di vitello del 10% e 1x penicillina-streptomicina-glutammina (PSG). Cellule di coltura a 37 ° C con aria umidificata contenente il 5% di CO 2. Cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni fino a quando il pallone è 85% di confluenza. Utilizzare le cellule dello stesso brano.
- Sciogliere PEGDA in PBS ad una concentrazione finale del 10% w / v Aggiungere fotoiniziatore I-2959 ad una concentrazione finale di 0,05% w / v Filtrare sterilizzare la soluzione.
- Sospendere coltivate condrociti umani nella soluzione PEGDA preparata a 5 x 10 6 cellule /ml.
3. Cartilagine Tessuto di stampa
- Accendere la stampante e il computer portatile.
- Creare un modello di stampa di un solido cerchio con 4 mm di diametro utilizzando Microsoft Word o Adobe Photoshop.
- Regolare la posizione del modello e assicurarsi che stamperà esattamente nello stampo di plastica.
- Calcolare il numero di stampe necessari per raggiungere lo spessore desiderato del ponteggio. Per 4 mm di altezza, 220 stampe sono necessari per creare l'impalcatura desiderato.
- Caricare il bioink nella cartuccia di inchiostro. Coprire la cartuccia con un foglio di alluminio per proteggerlo dall'esposizione diretta ai raggi UV durante la stampa.
- Inviare il comando di stampa alla stampante. Estrarre il sensore della carta quando la stampante inizia a stampare. L'intero processo di stampa dovrebbe richiedere meno di 4 minuti per un ponteggio di 4 mm di diametro e 4 mm.
- Trasferimento stampato neocartilage ad una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 1,5 ml di mezzo di coltura di ogni pozzetto.
- Incubare la neocartilage stampata in soluzione LIVE / DEAD Viabilità / citotossicità lavorare a temperatura ambiente per 15 minuti nel buio.
- Tagliare l'idrogel cellulare carico a metà e prendere le immagini fluorescenti della zona di taglio.
- Conte dal vivo (verde) e (rosso) le cellule morte da un osservatore cieco a cinque immagini scattate in modo casuale. Calcolo della vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vive per il numero totale di cellule vive e morte.
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Representative Results
La stampante a getto d'inchiostro termico modificato era capace di cellule e scaffold deposizione ad alta velocità e la vitalità delle cellule eccellente. Unendo con fotopolimerizzazione simultanea e biomateriali fotosensibili, questa tecnologia è in grado di fissare le cellule e altre sostanze stampati nelle posizioni inizialmente depositati. Secondo le proprietà della stampante a getto d'inchiostro termica modificato, la risoluzione di stampa 2D era 300 dpi con un unico volume goccia d'inchiostro di 130 pl. Ci sono 50 ugelli di cottura in ciascuna testina di stampa con frequenza di 3,6 kHz cottura 12,13. Pertanto un costrutto rappresentativo di 4 mm di diametro e 4 mm di altezza, il volume e lo spessore di ogni strato stampato durante la costruzione layer-by-layer erano 0,23 microlitri e 18 micron rispettivamente. L'intero processo di stampa ha richiesto meno di 4 minuti per costruire il tessuto cartilagineo (Figura 1).
La Figura 2A mostra una distribuzione uniforme delle cellule di prinTED condrociti in scaffold 3D grazie alla fotopolimerizzazione simultanea del ponteggio circostante durante la deposizione delle cellule. Al contrario, senza fotopolimerizzazione simultanea (scaffold polimerizzato dopo la semina cellulare), le cellule depositate affondò al fondo o interfaccia zonale invece delle loro posizioni inizialmente depositati a causa della gravità (Figura 2B). Questo accumulo di cellule è stata anche osservata in precedenti relazioni di taglio manuale di cartilagine 14,15 tessuto. I condrociti umani stampate in 3D idrogel PEG recuperati fenotipo condrogenico e dimostrato gradualmente aumentata produzione di proteoglicani durante la coltura (Figura 3) 3.
Figura 1. Stampato tessuto neocartilage. A) Schema di cartilagine bioprinting con fotopolimerizzazione simultanea e laicitessuto neocartilage montaggio ER-by-layer. B) Un stampata con 4 mm di diametro e 4 mm. Barra di scala = 2 mm. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Condrociti marcati con coloranti fluorescenti verde e arancione ha dimostrato la zonale cartilagine bioprinting fattibilità. A) le cellule stampati mantenuto le loro posizioni inizialmente depositati in idrogel 3D. Il processo di stampa e fotopolimerizzazione completata in 4 min con vitalità cellulare del 90% (n = 3). B) Cellule accumulati sul fondo o interfaccia per gravità senza fotopolimerizzazione simultanea. Ci sono voluti 10 minuti di esposizione UV a gel costrutto con le stesse dimensioni di A con una vitalità cellulare dei63% (n = 3). Barre di scala = 100 micron.
Figura 3. Safranina-O colorazione dei condrociti stampate in PEG spettacoli idrogel aumento della produzione di proteoglicani durante la coltura. Bar scala = 100 micron.
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Discussion
Questo sistema bioprinting 3D con capacità di fotopolimerizzazione simultaneo offre una risoluzione di stampa significativamente maggiore rispetto il miglior metodo precedentemente riportato nella stampa situ dei difetti osteocondrali con siringa estruso un idrogel alginato cellulare 16. Maggiore risoluzione di stampa è particolarmente critico per l'ingegneria tissutale della cartilagine per ripristinare il anatomico cartilagine organizzazione zonale. Fotopolimerizzazione simultanea durante l'assemblaggio layer-by-layer è fondamentale mantenere deposizione precisa di cellule e scaffold di biomateriali per la costruzione 3D. Microfabrication con ogni strato stampato anche comportato transizioni uniformi tra gli strati zonali, riducendo al minimo il rischio di degrado dovuto alla delaminazione. Regolando con precisione i parametri bioprinting ei componenti del bioink, saremo in grado di fabbricare le strutture 3D complesse necessarie per curare una vasta gamma di lesioni cartilaginee.
Con synestimolazione del fattore di crescita rgistic, il neocartilage bioprinted aveva il miglior fenotipo condrogenico e la maggior parte proliferazione cellulare 3. Pertanto, la densità di semina cellulare utilizzato in questo studio, che è fattibile per bioprinting, è anche ideale per la rigenerazione della cartilagine quando trattati con opportuni fattori di crescita. Riparazione della cartilagine utilizzando condrociti autologhi è fortemente limitato in applicazioni cliniche a causa del numero limitato di condrociti raccolti nella biopsia. L'impianto di condrociti autologhi direttamente raccolti o cellule staminali mesenchimali (MSC) insieme con biomateriali per la riparazione della cartilagine senza espansione monostrato è estremamente interessante. Pertanto, è fondamentale per espandere il numero di cellule stampati alla densità cellulare ottimale necessaria per la formazione della cartilagine senza compromettere la qualità della matrice cartilaginea dato il numero di cellule limitato. Inoltre, limitando densità iniziale delle cellule notevolmente ottimizzare e massimizzare la risoluzione bioprinting. Così, il bioprinting metodo qui descritto è completamente compatibile con il numero di cellule basse in ambito clinico e ha il potenziale per essere utilizzato per l'ingegneria tissutale della cartilagine.
In conclusione, il nostro lavoro dimostra la fattibilità di fabbricare strutture cartilaginee anatomiche, fornendo condrociti e materiali biomateriale scaffold a precise posizioni mirate. Un idrogel PEG con condrociti umani è stata continuamente bioprinted tramite assemblaggio layer-by-layer. Fotopolimerizzazione simultanea mantenuto le cellule stampati nelle loro posizioni depositati iniziali e ridotto fototossicità. Le cellule del neocartilage stampata mantenuto fenotipo condrogenico con l'espressione genica coerente e analisi biochimiche 2. Pertanto, questa tecnologia è un avanzamento promettente per anatomico ingegneria tissutale della cartilagine.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun interesse finanziario in questo studio.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno da parte del New York Capital Region Research Alliance Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HP Deskjet 500 thermal inkjet printer | Hewlett-Packard | C2106a | Discontinued. Purchased refurbished from internet vendor. |
| HP black ink cartridge | Hewlett-Packard | 51626a | |
| Ultraviolet lamp | UVP | B-100AP | |
| UV light meter | General Tools | UV513AB | |
| Zeiss LSM 510 laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin-glutamine (PSG) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Live/Dead viability/cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 | |
| Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) | Glycosan Biosystems | GS700 | |
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | I-2959 | |
| Human articular chondrocytes | Lonza | CC-2550 |
References
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
- Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
- Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
- Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
- Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
- Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
- Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
- Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
- Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).
