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तीन आयामी संस्कृति: स्तन कोशिकाओं की घातक परिवर्तन बनाम सामान्य कोष्ठकी संरचना का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण

Published: April 25, 2014 doi: 10.3791/51311
Automatic Translation
1, 2
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pathology, University of Michigan Comprehensive Cancer Center

Summary

एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति सौम्य स्तन के vivo वास्तुकला पुनरावृत्ति करना, और सौम्य स्तन फेनोटाइप से घातक phenotype अंतर करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के अन्य ऊतकों में आक्रामक कार्सिनोमा अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा metastasize करने के लिए आसन्न ऊतकों और प्रवृत्ति के आक्रमण के द्वारा होती घातक उपकला ट्यूमर का एक समूह है. कैंसर की कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच संकेतों के परस्पर क्रिया में स्तन कैंसर के विकास और जैविक व्यवहार 1 पर एक शक्तिशाली प्रभाव डाल रही है. हालांकि, बाह्य मैट्रिक्स से इन संकेतों के सबसे खो रहे हैं या कोशिकाओं एक monolayer के रूप में दो आयामी संस्कृति (2 डी) में बड़े हो रहे हैं जब उनकी प्रासंगिकता understudied है. हाल के वर्षों में, एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर तीन आयामी (3 डी) संस्कृति सौम्य और घातक स्तन कोशिकाओं के ऊतक वास्तुकला पुनरावृत्ति करना पसंद के एक तरीके के रूप में उभरा है. 3 डी में विकसित कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स से महत्वपूर्ण संकेतो को बनाए रखने और एक physiologically प्रासंगिक पूर्व vivo प्रणाली 2,3 प्रदान करते हैं. ध्यान से, 2 डी 4 की तुलना में 3 डी में उगाई जब कोशिकाओं को अलग ढंग से व्यवहार करते हैं, सुझाव है कि वहाँ बढ़ती सबूत है. 3D संस्कृतिप्रभावी ढंग से 3 शामिल सौम्य स्तन फेनोटाइप से घातक phenotype अंतर करने के लिए एक साधन के रूप में और सेलुलर और आणविक संकेत दे underpinning के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सौम्य उपकला कोशिकाओं के विशिष्ठ विशेषताओं में से एक शिखर कोशिका द्रव्य लुमेन की ओर है और बेसल कोशिका द्रव्य तहखाने झिल्ली पर टिकी हुई है, ताकि वे polarized रहे हैं. इस apico बेसल ध्रुवता सेलुलर विप्लव और संयोग से आसपास के स्ट्रोमा पैठ कि नलिकाओं anastomosing और शाखाओं में बंटी के गठन की विशेषता है जो आक्रामक स्तन कार्सिनोमा, में खो जाता है. सौम्य ग्रंथि और आक्रामक कार्सिनोमा के बीच ये histopathological मतभेद 3D 6,7 में reproduced किया जा सकता है. अन्य आणविक और कोशिका जीव विज्ञान तकनीक, 3 डी संस्कृतियों के साथ संयोजन में सेल प्रसार, polarity और apoptosis के लिए मान्य आणविक मार्कर की अभिव्यक्ति अंतर है, एक दौर कोष्ठकी संरचनाओं के quantitation तरह उपयुक्त पढ़ें बहिष्कार या का उपयोगई बेहतर घातक परिवर्तन के दौरान और जिम्मेदार संकेतन delineating के लिए सेलुलर परिवर्तन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान कर सकते हैं.

Introduction

पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति (3 डी) जटिल phenotype और सामान्य स्तन और स्तन कैंसर 2,3 के जुड़े संकेतन अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है. स्तन की कार्यात्मक इकाई acini में जो शाखाओं एक छोटे वाहिनी के होते हैं, जो टर्मिनल वाहिनी lobular इकाई (TDLU) है. acini एक तहखाने झिल्ली 5 से घिरे हैं जो दो सेल परतों, उपकला और myoepithelial कोशिकाओं से बना अत्यधिक संगठित संरचनाओं, कर रहे हैं. सामान्य acini की सबसे ख़ास सुविधाओं सेलुलर ध्रुवीकरण, अंतर्निहित तहखाने झिल्ली को लगाव और विशेष सेल सेल संपर्क कर रहे हैं. इस जटिल संगठन आक्रामक कार्सिनोमा में बाधित है. कोशिकाओं monolayers के रूप में बड़े हो रहे हैं, जहां व्यापक रूप से इस्तेमाल 2D संस्कृतियों, acini के गठन के लिए अनुमति नहीं देते हैं. इस प्रकार, monolayer संस्कृति उपकला कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधों पर कब्जा करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करने में कमी हैसामान्य स्तन और स्तन कैंसर में उनकी ढील में. स्तन कोशिकाओं के कार्यात्मक monotypic उपकला संस्कृतियों कई प्रयोगशालाओं 2,3 में विकसित किया गया है. 3D संस्कृति Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक solubilized निकालने है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जो Matrigel, पर स्तन कोशिकाओं के विकास शामिल है. कोलेजन की तरह अन्य 3 डी substrata मैं भी उपयोग किया जाता है. स्तन कोशिकाओं कोशिकाओं Matrigel 2 में एम्बेडेड सुसंस्कृत हैं जहां 3 डी एम्बेडेड परख, 3 डी में संवर्धित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को भी यह Matrigel की कम मात्रा की आवश्यकता होती है, और चरण विपरीत इमेजिंग द्वारा कॉलोनी गठन के समय चूक निगरानी की सुविधा और सीटू इमेजिंग 2 में लिए आदर्श है के रूप में लागत प्रभावी है जो 3 डी ओवरले परख, कहा जाता है, शीर्ष परख पर 3 डी द्वारा संवर्धित किया जा सकता है -3. शीर्ष परख पर 3 डी कोष्ठकी phenotype और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल 7 के बीच के संबंध को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

3D संस्कृति प्रभावी ढंग से किया जा सकता हैइली आक्रामक कार्सिनोमा से सामान्य और सौम्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सामान्य और सौम्य स्तन कोशिकाओं आक्रामक कार्सिनोमा कोशिकाओं लुमेन का कोई समाशोधन साथ prolifically और संयोग से बढ़ने जबकि विकास Matrigel पर केंद्र में एक अच्छी तरह से परिभाषित लुमेन साथ ध्रुवीकृत संरचनाओं गिरफ्तार फार्म. E6/E7 मानव स्तन उपकला कोशिकाओं और fibrocystic परिवर्तन के साथ एक 36 वर्षीय रोगी से अलग एक अनायास अमर सेल लाइन, सफलतापूर्वक 3 डी 3,8 में सौम्य स्तन फेनोटाइप हटा देना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और के रूप में सेवा की है जो MCF10A सेल लाइन, अमर कई अणु 8,9 के oncogenic और ट्यूमर शमन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली. इन कोशिकाओं सौम्य lentivirus / रेट्रोवायरस के लागू होने से ब्याज की जीन (ओं) में हेरफेर करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. ब्याज की जीन (एस) एक ट्यूमर शमन है तो ब्याज की जीन सौम्य कोशिकाओं में एक ओंकोजीन overexpression है, तो shRNA मध्यस्थता पछाड़ना जबकि एक घातक परिवर्तन को बढ़ावा मिलेगाएक घातक phenotype दिखाना चाहिए. दोनों ही मामलों में 3 डी में गठित कोष्ठकी संरचनाओं घातक परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं.

3 डी में चढ़ाया सौम्य एकल कक्षों गोलाकार संरचना पैदा करना और गोल बनाने के लिए शुरू करते हैं. दिन 5-8 से कोशिकाओं की इस गोलाकार कुल Matrigel के साथ संपर्क में है कि कोशिकाओं के आसपास ध्रुवीकृत परत, और Matrigel के साथ संपर्क का अभाव है जो कम ध्रुवीकृत कोशिकाओं, के एक भीतरी मास में अलग होगा. अगले 10-15 दिनों में इनर कोशिकाओं apoptosis एक स्पष्ट लुमेन के गठन से मरने के लिए शुरू कर देंगे. घातक कोशिकाओं संयोग से उनके polarity खोने बढ़ेगा. अत्यधिक घातक कोशिकाओं आमतौर पर संरचनाओं शाखाओं में फार्म. Phenotype में इन मतभेदों को समय चूक चरण विपरीत इमेजिंग द्वारा और बगल में प्रासंगिक आणविक मार्कर के साथ immunostaining द्वारा कब्जा किया जा सकता है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया मार्करों प्रसार मार्कर phospho-histone 3 और apoptot साथ संयोजन में, अल्फा 6 integrin, एक बेसल ध्रुवता मार्कर हैंआईसी मार्कर कस्पासे -3 cleaved. उत्तरार्द्ध acini के केंद्र, सामान्य और सौम्य स्तन कोशिकाओं की एक विशेषता में लुमेन गठन है कि क्या वहाँ निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. अन्य polarity और सेल सेल संपर्क मार्करों GM130, laminin, एर्म, ई cadherin शामिल हैं. वैकल्पिक रूप से स्तन कैंसर कोशिका लाइनों ब्याज की जीन में हेरफेर करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. गिरफ्तार एक और अधिक वृद्धि करने के लिए इस मामले प्रत्यावर्तन में सौम्य phenotype के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक कैंसर फेनोटाइप से अलग करने के लिए पढ़ा.

3D संस्कृति भी ध्यान से घातक परिवर्तन 10-11 में शामिल संकेत दे रास्ते को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. का उपयोग करके उपरोक्त पढ़ने के बहिष्कार, औषधीय inhibitors, अवरुद्ध एंटीबॉडी या पुनः संयोजक प्रोटीन उल्लेख घातक परिवर्तन के लिए अग्रणी आणविक संकेतन में तुच्छ किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न प्रयोगशालाओं से निरंतर प्रयासों के साथ यह शाही सेना को अलग और भी immunoblotting और immu के लिए lysates तैयार करने के लिए 3 डी से कोशिकाओं को निकालने के लिए संभव हैnoprecipitation. इन रणनीतियों प्रोटोकॉल में एक stepwise और विस्तृत रूप में वर्णित हैं.

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Protocol

1. सामग्री तैयार करने और संस्कृति मीडिया

  1. 4 डिग्री सीओ / एन में (जीएफआर) Matrigel कम पिघलना वृद्धि कारक
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक सेल लाइन के लिए पूरा मीडिया वार्म अप MCF10A-ATCC मीडिया निर्दिष्ट; HME हैम के एफ 12 मध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 ग्राम / एमएल hydrocortisone, 5 ग्राम / एमएल इंसुलिन, 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक है, और 100 एनजी / एमएल हैजा विष के साथ पूरक; 5% FBS, 2 ग्राम / एमएल hydrocortisone और 5 ग्राम / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक SUM149 हैम के एफ 12 मीडिया; और एमडीए MB-231-10% FBS-DMEM
  3. बर्फ पर एक 8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड Precool.
  4. टिशू कल्चर हुड और आपूर्ति तैयार करें.

8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड में 2. तीन आयामी संस्कृति

  1. कोट प्रत्येक GFR Matrigel की 40 μl के साथ 8 अच्छी तरह से स्लाइड की अच्छी तरह से. स्लाइड के केंद्र में Matrigel जोड़ें और फिर एक P200 विंदुक टिप का उपयोग फैल गया. बुलबुले से बचने और नेतृत्व करने के लिए कर सकते हैं जो overspreading, के रूप में समान रूप से संभव के रूप में फैलाने की कोशिश करोmeniscus गठन.
  2. 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स सेते हैं. Matrigel solidifying है, जबकि कोशिकाओं trypsinize इकट्ठा करने और 4 मिनट के लिए टिशू कल्चर अपकेंद्रित्र में 150 XG पर स्पिन.
  3. कक्षों की गणना और संबंधित सेल लाइन का पूरा मीडिया में 12,500 कोशिकाओं / एमएल पतला. 2% से GFR Matrigel जोड़ें और एक Matrigel precoated चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 400 μl जोड़ें.
  4. सीओ 2 इनक्यूबेटर में स्लाइड्स सेते हैं. 15 दिनों तक हर 4 वें दिन ताजा पूरा मीडिया परिवर्तन दीजिए.
  5. GFR Matrigel पर कोशिकाओं से बढ़ रही है, जबकि अवरोध करनेवाला पढ़ाई हर तीन दिन inhibitors के साथ पूरक ताजा मीडिया परिवर्तन द्वारा पीछा चढ़ाना के समय पर पूरा मीडिया के लिए छोटे अणु inhibitors जोड़ने के लिए: pharmacologic inhibitors के साथ इलाज.
  6. शुद्ध प्रोटीन के साथ उपचार:
    1. कोशिकाओं प्लेट निम्नलिखित 2.1-2.3 कदम. संस्कृतियों सीरम starvati द्वारा पीछा 4 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति16 घंटे के लिए पर.
    2. सुबह 5 से कम, FBS सीरम भूखे कोशिकाओं को मीडिया पूरक 0.1% में शुद्ध प्रोटीन की उचित एकाग्रता के साथ कोशिकाओं का इलाज. 2 दिनों के बाद शुद्ध प्रोटीन के साथ ताजा मीडिया बदल दे.
    3. 10 दिन में पूरा HME मीडिया के साथ वातानुकूलित मीडिया की जगह. संस्कृतियों और 5 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति.
  7. Matrigel पर हो कोष्ठकी संरचनाओं के immunofluorescence धुंधला:
    1. 2% paraformaldehyde, 0.5% ट्राइटन X-100 और 1x पीबीएस, 7.4 पीएच में 100 मिमी ग्लाइसिन तैयार करें. 0.1% गोजातीय सीरम albumin, 0.2% ट्राइटन X-100, 0.05% बीच 20 युक्त 1x पीबीएस के शामिल है कि immunofluorescence बफर (बफर यदि) तैयार करें.
    2. ध्यान से वातानुकूलित मीडिया aspirate के लिए एक P200 विंदुक टिप का उपयोग करें.
    3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में 2% हौसले से तैयार paraformaldehyde के साथ कोष्ठकी संरचनाओं को ठीक करें.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं permeabilize
    5. संस्कृति धो लेंतीन 100 मिमी ग्लाइसिन, प्रत्येक धोने के लिए 10-15 मिनट के साथ कई बार.
    6. आरटी पर 1 घंटे के लिए प्राथमिक ब्लॉक कहा जाता है बफर में 10% बकरी सीरम, साथ कोशिकाओं को ब्लॉक.
    7. एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल बकरी विरोधी माउस एफ (एबी ') 30 मिनट के लिए प्राथमिक ब्लॉक बफर में 2 टुकड़ा के साथ संस्कृतियों सेते हैं. यह कदम Matrigel में immunoreactive माउस आईजीजी प्रजातियों को ब्लॉक करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    8. दूसरी अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते 4 डिग्री सेल्सियस पर (प्राथमिक ब्लॉक 20 माइक्रोग्राम / एमएल बकरी विरोधी माउस एफ (एबी ') 2 टुकड़ा) ओ / एन
    9. 10-15 मिनट कोमल कमाल के साथ प्रत्येक के लिए यदि बफर के साथ तीन बार धोएं.
    10. 45 मिनट के लिए यदि बफर में फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
    11. 10 मिनट के लिए 3X धो कोमल कमाल के साथ अगर बफर के साथ प्रत्येक.
    12. नाभिक कल्पना करने के लिए DAPI युक्त विरोधी फीका अभिकर्मक के साथ स्लाइड माउंट.
    13. स्लाइड आर टी ओ / एन सूखे की अनुमति दें.
    14. छवि अधिग्रहण: कॉलोनी मील में confocal छवियों मोलMatrigel के शीर्ष पर विकसित कोशिकाओं का dsection. अधिक जानकारी के लिए जेड stacking द्वारा कोष्ठकी संरचना की पूरी लंबाई भर में ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला के अधिग्रहण.

3. Immunoblotting के लिए 2 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में तीन आयामी संस्कृति

  1. बर्फ पर एक 2 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड Precool. चरणों का पालन करें 2.1-2.4 Matrigel के 160 μl के साथ 2-अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड जैसे कोट के लिए अभिकर्मकों ऊपर स्केलिंग और सेल / Matrigel के 1.6 मिलीलीटर 2 अच्छी तरह से स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण जोड़ें.
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3D संस्कृति सेल कटाई किट का उपयोग कर Matrigel से कोष्ठकी संरचनाओं हार्वेस्ट.
  3. 1x और 4 डिग्री सेल्सियस तक precool को सेल धोने और सेल कटाई बफ़र्स पतला Matrigel की धुलाई और dislodging बर्फ पर बाहर किया जाना चाहिए.
  4. सेल धोने बफर का उपयोग 3x कोष्ठकी संरचनाओं धो लें.
  5. सेल कटाई बू का उपयोग कर 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में acini लीजिएffer 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घुमाव पर 30 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ अच्छी तरह से निलंबन मिलाएं. इस छोटे से टुकड़े में Matrigel तोड़ने और सेल कटाई बफर में कोशिकाओं की सबसे रिलीज होगी.
  6. एक संस्कृति अपकेंद्रित्र में 200 XG पर गोली कोशिकाओं. एक P200 विंदुक टिप के साथ pelleted कोशिकाओं से हाइड्रोजेल की चल परत निकालें.
  7. किट के साथ प्रदान एसडीएस नमूना बफर में lysates Resuspend. RIPA lysis बफर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

घातक बनाम सौम्य स्तन phenotype के 4. मात्रा

  1. कदम 2.1-2.4 निम्नलिखित प्रत्येक उपचार सेट के लिए triplicates में कोशिकाओं को विकसित.
  2. 5X या एक स्लाइड मज़दूर और एक कंप्यूटर से जुड़ा एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग 10X संकल्प पर प्रत्येक अच्छी तरह से कोष्ठकी संरचनाओं के चरण विपरीत छवियों ले लो. एक और एक फ्रेम से स्लाइड चलती है और इस प्रकार संभाग स्लाइड के पूरे अच्छी तरह से कवर द्वारा छवियों ले लो.
  3. कोष्ठकी संरचनाओं की कुल संख्या की गणना,एक दौर फ्लैट acini और multiacinar संरचना या संगठन की कमी संयोग से बढ़ रही संरचनाओं की संख्या की और से चलाई शाखाओं में प्रक्रियाओं के साथ संख्या.
  4. एक दौर फ्लैट कोष्ठकी संरचनाओं बनाम घातक संरचनाओं का प्रतिशत और स्तंभ ग्राफ के रूप में साजिश की गणना. विद्यार्थी t-परीक्षण से महत्व की गणना.

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Representative Results

3D संस्कृति प्रभावी रूप से सौम्य स्तन से मानव स्तन उपकला कोशिकाओं की घातक phenotype अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Matrigel पर चढ़ाया एकल सौम्य कोशिकाओं को आसानी से चरण विपरीत इमेजिंग का उपयोग एक विमान में एक दौर फ्लैट acini के रूप में imaged किया जा सकता है कि आयोजन गोलाकार संरचना के रूप में विकसित. Matrigel पर चढ़ाया एकल घातक कोशिकाओं, संयोग से बढ़ने बहुत उच्च अपवर्तनांक दिखाने के लिए और एक विमान में छवि के लिए मुश्किल हैं. चित्र 1 में दिखाया गया है अत्यधिक metastatic स्तन सेल लाइनों SUM149 और एमडीए MB-231 उनमें से चलाई प्रक्रियाओं के साथ ट्यूबलर संरचना शाखाओं में बंटी के रूप में विकसित है, जबकि सौम्य HME और MCF10A कोशिकाओं गोलाकार देख acini के रूप में. सौम्य फेनोटाइप से इस तरह के एक विचलन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक घातक परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए बाहर पढ़ने के लिए और एक ट्यूमर शमन के रूप में या एक ट्यूमर प्रवर्तक के रूप में एक अणु के समारोह को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2, ट्यूमर शमन जीन CCN6 टी के पछाड़ना (केडी) में दिखाया गया हैएक घातक परिवर्तन riggers. नीचे lentivirus मध्यस्थता अभिकर्मक द्वारा CCN6 के स्तर को विनियमित है इंजीनियर HME कोशिकाओं पर बहुत जल्दी से उनके संगठन खो देते हैं. CCN6 केडी कोशिकाओं एक बेतरतीब फेनोटाइप दिखा जबकि दिन 5 में सौम्य नियंत्रण कक्षों के रूप में सही गोलाकार संरचना बढ़ रहे थे. 15 दिन तक सौम्य नियंत्रण कोशिकाओं के विकास को गिरफ्तार कर लिया और केडी कोशिकाओं (चित्रा 2) यदि अनुमति दी हो जाना जारी है जो अव्यवस्थित बड़े ट्यूबलर संरचना के लिए फार्म prolifically बढ़ने जबकि एक अच्छी तरह से परिभाषित केंद्रीय लुमेन आसपास की कोशिकाओं की एक polarized परत शो बन जाते हैं.

कई आणविक मार्करों घातक स्तन फेनोटाइप बनाम सौम्य के बीच अंतर करने के लिए लाभ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सौम्य स्तन एक विभेदित विकास 3D संस्कृति में सुबह 15 से फेनोटाइप गिरफ्तार दिखाता है. acini स्पष्ट रूप से 3 चित्र में नियंत्रण कक्षों में दिखाया गया है laminin वी के साथ immunostaining द्वारा देखे जा सकते हैं कि तहखाने झिल्ली का एक बयान है (चित्रा 3) के लिए प्रतिबंधित नहीं किया जा सकता है.

घातक परिवर्तन में शामिल संकेत दे रास्ते औषधीय inhibitors और शुद्ध पुनः संयोजक मानव (आरएच) प्रोटीन का एक संयोजन का उपयोग चित्रित किया जा सकता है. चित्रा 4 malignan में दिखाया गया हैCCN6 केडी HME कोशिकाओं की टी फेनोटाइप rhCCN6 प्रोटीन के साथ एक्सोजेनस उपचार द्वारा एकल दौर कोष्ठकी संरचनाओं को वापस सौंप दिया जा सकता है. DAPI दाग कोष्ठकी संरचनाओं के मध्य भाग में confocal इमेजिंग स्पष्ट रूप से rhCCN6 साथ इलाज CCN6 केडी कोशिकाओं में केंद्रीय लुमेन साथ ध्रुवीकृत acini दिखा. इसी आक्रामक SUM149 और p38 एमएपी kinase अवरोध के साथ इलाज एमडीए MB-231 कोशिकाओं घातक phenotype (चित्रा 5A) में कमी को दर्शाता है. phenotype की तरह एक सौम्य को प्रत्यावर्तन घातक संरचनाओं की तुलना में एक दौर कोष्ठकी संरचनाओं के प्रतिशत की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. inhibitors की विशिष्टता AKT inhibitors एमएपी kinase अवरोध PD98059 साथ उपचार एकल दौर कोष्ठकी संरचनाओं (चित्रा 5 ब) के लिए एक उल्लेखनीय प्रत्यावर्तन से पता चलता है, जबकि CCN6 केडी कोशिकाओं पर कोई प्रभाव दिखाने के लिए असफल कि इस तथ्य से समझा जा सकता है.

चित्रा 1 10 दिनों के लिए Matrigel पर हो घातक स्तन कोशिकाओं बनाम सौम्य चित्रा 1. चरण विपरीत छवियाँ. सौम्य अमर मानव स्तन उपकला कोशिकाओं (HME) और अनायास अमर MCF10A कोशिकाओं किसी भी फलाव से रहित एक दौर फ्लैट acini के रूप में विकसित. घातक मानव स्तन सेल लाइनों SUM149 और एमडीए MB-231 के रूप में अत्यधिक अव्यवस्थित संरचनाओं बढ़ने जबकि. स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. HME नियंत्रण और Matrigel पर हो CCN6 केडी कोशिकाओं के confocal इमेजिंग बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. Confocal इमेजिंग बेनी में आणविक मार्कर के अंतर अभिव्यक्ति से पता चलता हैजीएन बनाम घातक स्तन कोशिकाओं. CCN6 केडी HME कोशिकाओं polarity और सेल सेल संपर्क मार्कर ई cadherin के नुकसान के नुकसान का संकेत, बेसल ध्रुवता मार्कर अल्फा 6 integrin के तहखाने झिल्ली, हानि के विघटन का प्रतिनिधित्व laminin वी के नुकसान दिखाने . हालांकि नियंत्रण कक्षों तहखाने झिल्ली के बयान (acini चारों ओर एक अक्षुण्ण laminin परत), अल्फा 6 integrin के बेसल अभिव्यक्ति, GM130 के शिखर अभिव्यक्ति और सेल सेल जंक्शन पर ई cadherin की उपस्थिति दिखाते हैं. स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
शुद्ध पुनः संयोजक मानव CCN6 prot साथ एक्सोजेनस उपचार द्वारा CCN6 केडी HME कोशिकाओं की घातक phenotype की चित्रा 4. उलटाEin. CCN6 केडी कोशिकाओं 3D संस्कृति में ही अव्यवस्थित, आक्रामक कोष्ठकी संरचनाओं हो जाना. हालांकि, CCN6 केडी कोशिकाओं 500 phenotype की तरह एक अधिक सौम्य, यह दर्शाता है लुमेन के समाशोधन के साथ एक दौर कोष्ठकी फेनोटाइप को rhCCN6 शो प्रत्यावर्तन की / एमएल एनजी के साथ इलाज किया. काले पैमाने बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पीला पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
छोटे अणु inhibitors के साथ चित्रा 5. इलाज कम घातक या phenotype जैसे सौम्य लिए घातक phenotype लौट जाते. ए P38 एमएपी kinase inhibitors SB203850 (5 माइक्रोन) और SB202190 (10 माइक्रोन) के साथ 2 अत्यधिक metastatic स्तन सेल लाइनों SUM149 और एमडीए MB-231 का उपचार कम कर देता है उनकेके रूप में घातक व्यवहार 3 डी पर एक दौर कोष्ठकी phenotype में परिलक्षित होता है. AKT inhibitors LY294002 (7.5 माइक्रोन) के साथ इलाज बी CCN6 केडी HME कोशिकाओं, Wortamannin (2 एनएम) कोई प्रभाव दिखाता है, लेकिन एमएपी kinase अवरोध PD98059 (10 माइक्रोन) के साथ इलाज कोष्ठकी संरचनाओं का आयोजन एक दौर के लिए phenotype बदल जाती है. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें छवि.

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Discussion

हम यहाँ एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति और घातक बनाम सौम्य स्तन phenotype के बीच अंतर करने के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का वर्णन किया है. इस प्रणाली को भी अन्य ग्रंथियों के ऊतकों से संस्कृति विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सफलतापूर्वक कुछ 12-14 नाम करने के लिए, संस्कृति प्रोस्टेट उपकला, ब्रोन्कियल उपकला, और थायराइड उपकला कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया है करने के लिए सूचित किया गया है. 3D संस्कृति का महत्व यह एक physiologically प्रासंगिक मॉडल है कि इस तथ्य में निहित है. 3D संस्कृति घातक परिवर्तन के दौरान ग्रंथियों वास्तुकला के विघटन की ओर जाता है कि आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक साधन प्रदान करता है. यह भी कैंसर के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य जांच में सहायक हो सकता है कि एक काम कर मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. 2D संस्कृति में प्रभावी होना पाया जाता है जो कई दवाओं अक्सर प्रयोगात्मक और नैदानिक ​​applictai में खास असर नहींऑन्स 15. ऐसी 3 डी संस्कृति के रूप में vivo में यौगिकों के प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए एक महत्वपूर्ण preclinical उपकरण प्रदान कर सकते हैं.

3D संस्कृति एक चुनौतीपूर्ण तकनीक है और सावधानी से किया जाना चाहिए. GFR Matrigel 3 डी में संवर्धन कोशिकाओं के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया substrata है. यह 4 डिग्री सीओ / एन में thawed aliquoted और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया जा सकता है. दोहराया फ्रीज विगलन से बचा जाना चाहिए. GFR Matrigel 4 डिग्री सेल्सियस पर तरल है लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस पर solidifies और ताजा मीडिया के साथ वातानुकूलित मीडिया बदल रहा है जब या immunocytochemistry के लिए कोशिकाओं को संसाधित करते समय हैंडल करने के लिए बेहद मुश्किल हो सकता है. यह हमेशा Matrigel के साथ साथ पूरे कोष्ठकी संस्कृतियों का नुकसान होता है के रूप में वातानुकूलित मीडिया को दूर करने के लिए एक निर्वात चूषित्र का उपयोग न करें. यह बहुत शाखाओं नेटवर्क के रूप में जो एमडीए MB-231 कोशिकाओं की तरह कुछ आक्रामक कैंसर कोशिका लाइनों के मामले में संरचनाओं की तरह Matrigel सुर से अलग कर सकते हैं कि मनाया जाता हैसामना करना है और अक्सर चल गुना है. केयर मीडिया को दूर करते हुए अन्यथा वे नष्ट हो जाएंगे इन संस्कृतियों के बाहर मीडिया चूसना करने के लिए लिया जाना चाहिए.

समान रूप से महत्वपूर्ण है, खासकर HME और MCF10A जैसे सौम्य कोशिकाओं के लिए monolayer संस्कृतियों के रूप में बढ़ कोशिकाओं की देखभाल और मार्ग है. निर्धारित मीडिया से संगम या विचलन से अधिक 3 डी में कोष्ठकी गठन को प्रभावित कर सकते हैं.

यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3D संस्कृति सेल कटाई किट का उपयोग शाही सेना या प्रोटीन अलगाव के लिए प्रक्रिया करने के लिए 3 डी संस्कृतियों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है. वैकल्पिक रूप से तीन आयामी संस्कृतियों सीधे RIPA बफर के रूप में डिटर्जेंट आधारित lysis बफर का उपयोग lysed जा सकता है (1% Nonidet P-40, 0.2% एसडीएस, 0.5% सोडियम deoxycholate, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, 50 मिमी Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच, 10 मिमी सोडियम फ्लोराइड, 1 मिमी सोडियम orthovanadate, 10 मिमी बी glycerophosphate, 5 ग्राम / एमएल apoprotinin, 5 ग्राम / एमएल leupeptin, और 100 माइक्रोन phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड). हालांकि प्रोटीन quantifiकटियन क्योंकि Matrigel में प्रोटीन बहुतायत से इस मामले में संभव नहीं है. इस प्रकार प्रोटीन lysates स्थिर साइटोसोलिक ऐसे लैक्टोज डिहाइड्रोजनेज (LDH) के रूप में एंजाइमों, और blots की गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया वर्णमिति assays actin या ट्यूबिलिन या GAPDH 3 की तरह एक गृह व्यवस्था जीन के लिए reprobed किया जाना चाहिए साथ सामान्यीकृत किया जाना चाहिए.

हालांकि Matrigel प्रक्रिया से सेल कटाई 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि ऊष्मायन की आवश्यकता इस कोशिका की सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रभावित कर सकते हैं और सीटू immunostaining में जैसे कोशिका की सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक अधिक उपयुक्त तरीका है. एक सज्जन घुमाव पर एंटीबॉडी ऊष्मायन immunostaining के लिए समान रूप से acini लेकिन इष्टतम गति धुंधला करने में सहायक है और यह भी Matrigel की dislodging की जा सकती घुमाव तरह गंभीर है. एंटीबॉडी एकाग्रता अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है लेकिन सबसे एंटीबॉडी 1:100 एकाग्रता में कुशल होना पाया गया है. एक morएंटीबॉडी के ई विशिष्ट सूची तालिका में प्रदान की जाती है. उनकी विशिष्टताओं के साथ एंटीबॉडी की एक विस्तृत सूची देबनाथ में पाया जा सकता है एट अल. चूहे, खरगोश और चूहे की तरह विभिन्न जानवरों से प्राप्त एक से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 2 एक साथ ऊष्मायन से बाहर किया जा सकता है लेकिन किसी भी पार जेट से इनकार करने के शुरू में अनुकूलित किया जाना चाहिए .

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच अनुदान R01 CA107469, R01 CA125577, और तटरक्षक Kleer, मिशिगन कैंसर केंद्र सहायता करने के लिए विश्वविद्यालय U01CA154224 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth Factor Reduced Matrigel BD Biosciences 354230 Avoid repeat freeze thaw 
Lab-Tek glass hamber slides 8-well Thermo Fisher Scientific 177402 Precool on ice 
Lab-Tek glass chamber slides 2-well  Thermo Fisher Scientific 177380 Precool on ice 
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment Jackson Immunoresearch 115-006-006
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies Molecular Probes Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI Molecular Probes P36935
3D Culture Cell Harvesting kit Trevigen 3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin Fisher Scientific MAB1378 1:100 dilution for IF
Anti-GM130 BD Biosciences 610822 1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated Fisher Scientific 16-222 1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) Cell Signaling 9661s 1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin BD Biosciences 610181 1:200 dilution for IF

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References

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चिकित्सा अंक 86 रोग की स्थिति संकेत और लक्षण अर्बुद तीन आयामी संस्कृतियों Matrigel स्तन कोशिकाओं घातक phenotype संकेत
तीन आयामी संस्कृति: स्तन कोशिकाओं की घातक परिवर्तन बनाम सामान्य कोष्ठकी संरचना का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण
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Pal, A., Kleer, C. G. Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells. J. Vis. Exp. (86), e51311, doi:10.3791/51311 (2014).

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