Nanopodia - Tynde, skrøbelige Membran Fremskrivninger med roller i Cell Bevægelse og intercellulære interaktioner
Summary
Nanopodia er tynde, men skrøbelige membran-kanaler, der når op til 100 um fra en celle førende forreste eller bageste bagfra og fornemmer det cellulære miljø. Direkte fiksering ved 37 ° C, blid vask, og undgåelse af organiske opløsningsmidler som ethanol, methanol eller acetone og af højere Triton X-100-koncentrationer er forpligtet til at overholde disse cellulære strukturer.
Abstract
Adhærente celler i kultur opretholde en polariseret tilstand til at understøtte bevægelse og intercellulære interaktioner. Nanopodia er tynde, aflange, hovedsagelig F-actin-negative prognoser membran i endotel-og kræftceller, der kan visualiseres gennem TM4SF1 (transmembrane-4-L-seks-familie-1) immunofluorescensfarvning. TM4SF1 klynger i 100-300 um diameter TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro D omains) indeholdende 3 til så mange som 14 individuelle TM4SF1 molekyler. TMED er arrangeret med mellemrum langs nanopodia på en regelmæssig afstand på 1 til 3 Tmed pr μ m og forankre nanopodia til matrix. Dette gør det muligt nanopodia at udvide mere end 100 μ m fra førende forreste eller bageste bagsiden af polariserede endotel eller tumorceller, og forårsager rester membran at blive efterladt på matrix når cellen bevæger sig væk. TMED og nanopodia er blevet overset på grund af deres ekstreme skrøbelighed og følsomhed over for temperatur. Rutinemæssig vask og fiksering forstyrre strukturen. Nanopodia bevares ved direkte fiksering i paraformaldehyd (PFA) ved 37 ° C, efterfulgt af kortvarig eksponering til 0,01% Triton X-100 før farvning. Nanopodia åbne nye perspektiver i cellebiologi: de lover at omforme vores forståelse af, hvordan celler fornemmer deres omgivelser, opdage og identificere andre celler på afstand, indlede intercellulære interaktioner ved tæt kontakt, og signalsystemerne mekanismer involveret i bevægelsen, proliferation og celle -celle kommunikation. De metoder, der er udviklet for at studere TM4SF1-afledt nanopodia kan være nyttigt for studier af nanopodia, der danner i andre celletyper gennem formidlingen af klassiske tetraspanins, navnlig allestedsnærværende udtrykt CD9, CD81 og CD151.
Introduction
Under polarisering bevægelse, dyreceller udvide en række dynamiske, membran fremspring fra deres overflader, herunder filopodia, lamellipodia, retraktionsindstillingen fibre og flæser 1. For nylig føjet til denne liste var nanopodia, en nyligt anerkendt type tynde (100-300 um i diameter), aflang (op til 50-100 um lange) membran projektion, der giver membran kanaler til udvidelse af F-actin strukturer såsom filopodia og tilbagetrækning fiber, og at pletten positivt med TM4SF1 (transmembrane-4-L-seks-familie-1) i dyrkede endotel og tumorceller 2,3.
TM4SF1 er et protein med tetraspanin-lignende topologi, der oprindeligt var kendt som en tumorcelleantigen 4 inden opdagelsen af, at molekylet er et endotelcelle biomarkør, der spiller en væsentlig rolle i endotelcelleproliferation og migration 2,3. Immunfluorescensfarvning viste, at TM4SF1 er lokaliseret til perinucLear vesikler og til plasmamembranen, og er beriget i TM 4SF1 e nriched Mikro D omains (Tmed). TMED anker nanopodia til matrix og til stede i en regelmæssige mellemrum stribet mønster på 1-3 TMED / mM længde nanopodia. Nanopodia strækker sig typisk fra en celle førende forreste og bageste bag under cellepolarisering bevægelse. På grund af den fast adhærerende art TMED, nanopodia er i stand til at trække tilbage i cellen, da det bevæger sig væk; forladte nanopodia rester dermed spore stien cellulære bevægelse. Nanopodia give membran kanaler til F-actin udskudssekvens, og er steder af intercellulære interaktioner og kommunikation 2,3. Disse egenskaber betyder, at nanopodia giver en unik mulighed for at studere de mekanismer, der ligger til grund F-actin samling under cellulært polarisering, cellulær sansning af miljøet, bestemmelse af stien og retning af celle bevægelse, og intercellulære interaktioner ennd kommunikation.
På grund af den meget hydrofobe natur TMED og den tynde og skrøbelige membranøs natur nanopodia, der skal tages for at bevare TMED og nanopodia særlig pleje. Ødelæggelsen af nanopodia og fjernelse af TMED af fælles laboratoriemetoder er en mulig årsag til, at der kun treogtres publikationer har optrådt på TM4SF1 siden sin første opdagelse i 1986 1, og for den fuldstændige mangel på viden om TM4SF1 berigelse i 100-300 um mikrodomæner på celleoverfladen indtil rapporten fra TM4SF1 i endotelceller i 2009 2.
Konventionelle immunfarvning metoder almindeligt brug organiske opløsningsmidler som ethanol, methanol, acetone eller lignende til løse celler og bruge 0,1% eller højere Triton X-100 koncentrationen permeabilisere celler 5.. Studier beskrevet her gennemført tre større ændringer i den konventionelle metode til at afsløre TMED og nanopodia: (i) at anvende 37 ° C 4% PFA og løse celler i et 3776; C inkubator, (ii) anvende blid stuetemperatur PBS vask, og (iii) at anvende mindre end 0,03% Triton X-100 kun kortvarigt at permeabilisere celler før tilsætning af primært antistof, Triton X-100 er højere end 0,03%, vil udtrække TM4SF1.
Alle tetraspanins danner mikrodomæner på cellemembranen 6 og nogle colocalize med TMED i endotelceller og tumorceller 2,3. Som tetraspanins som CD9, CD81 og CD151 allestedsnærværende er udtrykt, kan farvningsprotokol beskrevet her udvides til mange forskellige celletyper, der mangler TM4SF1 for studier af nanopodia funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia er tynde cellulære membran kanaler, der fast lægger til matrix gennem TMED og kan strække sig mere end 100 um fra et polariseret mobil celle til at fornemme miljøet og mægle intercellulære interaktioner 2,3. Nanopodia overholde matrix så fast, at rester efterladt som celle bevæger sig væk (fig. 1 og 2). Nanopodia derfor tillade os at studere, hvordan celler fornemmer deres omgivelser og bestemme stien celle bevægelse, og hvordan genekspression eller narkot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Dr. Harold Dvorak for nyttige drøftelser, herunder forslaget om at prøve fiksering i 37 ° C PFA. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P01 CA92644 og af en kontrakt fra National Foundation for Cancer Research.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
