Summary

Nanopodia - Dünne, Zerbrechlich Membran Projektionen mit Rollen in der Zellbewegung und interzelluläre Wechselwirkungen

Published: April 03, 2014
doi:

Summary

Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.

Abstract

Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.

Introduction

Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen 2,3.

TM4SF1 ist ein Protein mit tetraspanin artige Topologie, das ursprünglich als ein Tumorzellantigen 4 vor der Entdeckung, dass das Molekül ein Endothelzellen-Biomarker, die eine wesentliche Rolle bei der Endothelzellenproliferation und-migration 2,3 spielt bekannt war. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass TM4SF1 wird lokalisiert, um perinucLear Vesikel mit der Plasmamembran und in TM 4SF1 e nriched Mikro d omains (TMED) angereichert. TMED Anker nanopodia zu Matrix und in regelmäßigen Abständen von 1-3 gebändert Muster TMED / um Länge nanopodia vorhanden. Nanopodia erstrecken sich typischerweise von führenden vor einer Zelle und Nachlauf während der Zellpolarisation für Bewegung. Aufgrund der Natur der Firma haft TMED sind nanopodia nicht wieder in die Zelle zurückziehen, wie es sich bewegt; aufgegeben nanopodia Rückstände so verfolgen den Weg der Zellbewegung. Nanopodia Membrankanäle für die F-Aktin-und Ausfahren zu schaffen, und sind Websites der interzellulären Interaktion und Kommunikation 2,3. Diese Eigenschaften bedeuten, dass nanopodia eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen F-Actin-Montage während der Zellpolarisation, Zellerkundung der Umwelt, die Bestimmung der Weg und die Richtung der Zellbewegung und interzellulären Interaktionen zugrunde liegenden Studie liefern einnd-Kommunikation.

Aufgrund der stark hydrophoben Natur TMED und der dünnen und zerbrechlichen Natur des häutigen nanopodia, braucht besondere Pflege, um TMED und nanopodia bewahren genommen werden. Die Zerstörung und Entfernung von nanopodia TMED durch gemeinsame Labormethoden ist ein möglicher Grund, warum nur dreiundsechzig Publikationen auf TM4SF1 seit seiner ersten Entdeckung im Jahr 1986 ein und für den kompletten Mangel an Wissen über TM4SF1 Bereicherung in 100-300 um auf Mikrodomänen erschienen der Zelloberfläche, bis der Bericht der TM4SF1 in Endothelzellen in 2009 2.

Konventionelle Methoden verwenden Immunfärbung häufig organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Aceton, um Zellen zu reparieren und zu verwenden 0,1% oder höher Triton X-100-Konzentration auf Zellen permeabilisieren 5. Hier beschriebenen Studien implementiert drei wichtige Änderungen der herkömmlichen Methode zu zeigen, TMED und nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA und fixieren Zellen in einer 3776, C-Inkubator, (ii) gelten sanfte Raumtemperatur PBS waschen, und (iii) weniger als 0,03% Triton X-100 nur kurz, um Zellen permeabilisieren vor der Zugabe des primären Antikörpers, wie Triton X-100 höher als 0,03% wird extrahiert TM4SF1.

Alle Tetraspaninen bilden Mikrodomänen auf der Zellmembran 6 und einige kolokalisiert mit TMED in Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. Wie Tetraspaninen wie CD9, CD81 und CD151 sind ubiquitär exprimiert, kann die hier beschriebenen Färbungsprotokoll zu vielen verschiedenen Zelltypen, die TM4SF1 fehlt für die Studien von nanopodia Funktion erweitert werden.

Protocol

1. Zellkultur auf Collagen Beschichtete Glasplatten Platz Glasplatten (12 mm Durchmesser) in einem Glas (4 oz) und Autoklav, um die Scheiben zu sterilisieren. Setzen Sie 25 ml 70% Ethanol in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und legen Sie sie in einer Zellkultur Kapuze. Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden, bis der Pegel der Lösung auf 20 ml sinkt. Legen Sie ein scharfe Zange mit einer extra feinen Spitze in der 70% Ethanol für 5 Minuten, bevor Sie es auf die Glasscheibe zu beha…

Representative Results

Für Schritt 1: Wenn Zellen (wie HUVEC und PC3 in dieser Studie verwendet) sind in der Lage, normal zu wachsen, werden Zellen, die mit Kollagen beschichteten Platte innerhalb von 30 min zu befestigen, nachdem sie ausgesät sind, zu polarisieren und zu mobilen bald danach, und erstrecken sich nanopodia vor ihrem Weg Bewegungs. Fig. 1A und 1B jeweils eine polarisierte oder proliferierende HUVEC. 2A zeigt polarisierten PC3-Zellen in einem mobilen …

Discussion

Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen 2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Harold Dvorak für hilfreiche Diskussionen einschließlich der Vorschlag, Fixierung in 37 ° C PFA versuchen. Diese Arbeit wurde vom NIH P01 CA92644 und durch einen Vertrag von der Nationalen Stiftung für Krebsforschung unterstützt.

Materials

glass discs  Fisher Scientific 12-545-82  12-mm diameter
glass jar Fisher Scientific 02-912-310 Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz.
glass slide Fisher Scientific 12-544-1 Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50-ml falcon tube  BD Falcon 352070 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15-ml falcon tube with Styrofoam rack Corning 430790 Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps  Fisher Scientific 13-812-42 Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
24-well cell culture plate BD Bioscience 353047 24-well Cell Culture Plate
150-mm cell culture plate  BD Bioscience 353025 150-mm cell culture plate 
19G 1 ½ syringe needle  BD Bioscience 309635 19G 1 ½
Name of Reagent
ethanol Decon Laboratories, Inc. 2701 Decon's Pure Ethanol 200 Proof
collagen solution  BD Bioscience 354249 Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
trypsin/EDTA Cellgro 25-053-CI 0.25% Trypsin-EDTA 1X
DMEM Life Technologies 11965-092 DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10X PBS Affymetrix 75889 5 LT PBS, 10X Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde) Affymetrix 19943 1 LT 4% in PBS
FBS Sigma-Aldrich F4135-500ML Fetal Bovine Serum
EGM2-MV Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Triton X-100
NaN3 Sigma-Aldrich S2002-25G solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
mouse anti-human TM4SF1 antibody  Millipore MAB3127 Epitope is located in extracellular domain
mouse anti-human CD9 antibody  BD Bioscience 555370 Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody Life Technologies A-21202 Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin Chemicon 90324 Rhodamine-conjugated Phalloidin
anti-fade mounting media  Life Technologies P-36931 ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
Buffers and solutions
70% ethanol  17.5 ml of ethanol (200 proof)
7.5 ml of double deionized water
10X PBS (make 200 ml)
20 ml of 10X PBS
180 ml of double deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml) 
4 ml
16 ml double deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)
1 g of NaN3
25 ml of double deionized water
50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)
Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml)
830 μl of Collage I (3 mg)
50 ml PBS 
ICC Blocking Buffer (50 ml)
49 ml PBS
2% FBS (add 1 ml)
0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)
50 ml of ICC Blocking Buffer 
25 μl of 20% Triton X-100
Name of Cell
HUVEC  Lonza  C2517A http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx
PC3 ATCC CRL-1435 http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7
Name of Equipment
cell culture hood NuAIRE Nu-425-600 NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET 
37 °C, 5% CO2 cell culture incubator  CellStar QWJ300DABA  Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
heating pad  K&H Manufacturing 1020 K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y)
centrifuge Sorvall  T6000B  Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 Bright-Line Hemacytometer

References

  1. Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
  2. Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
  3. Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
  4. Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
  5. Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
  6. Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
  7. Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
  8. Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
  9. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
  10. Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
  11. Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
  12. Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
  13. Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).

Play Video

Cite This Article
Lin, C., Lau, C., Li, D., Jaminet, S. Nanopodia – Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions. J. Vis. Exp. (86), e51320, doi:10.3791/51320 (2014).

View Video