Nanopodia - Dünne, Zerbrechlich Membran Projektionen mit Rollen in der Zellbewegung und interzelluläre Wechselwirkungen
Summary
Nanopodia sind dünn, aber empfindlichen Membrankanäle, die sich bis 100 um von führenden Vorder-oder Hinter Rückseite einer Zelle und spüren die zelluläre Umgebung. Direktbefestigung auf 37 ° C, sanftes Waschen und Vermeidung von organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol oder Aceton und höherer Triton X-100-Konzentrationen sind erforderlich, um diese Zellstrukturen zu beobachten.
Abstract
Adhärenten Zellen in Kultur pflegen einen Polarisationszustand, um Bewegung und interzellulären Interaktionen unterstützen. Nanopodia sind dünne, längliche, weitgehend F-Actin-negative Membran Projektionen in Endothel-und Krebszellen, die durch TM4SF1 (Transmembrane-4-L-Sechsfamilien-1) Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden kann. TM4SF1 Cluster in 100-300 &mgr; m Durchmesser TMED (TM 4SF1 e nriched Mikro omains d), die 3 bis zu 14 einzelne TM4SF1 Molekülen. TMED intermittierend entlang nanopodia in einem regelmäßigen Abstand von 1 bis 3 μ m pro TMED und fest zu verankern, um nanopodia Matrix angeordnet sind. Dies ermöglicht nanopodia mehr als 100 μ m von der Vorderfront oder Nachlauf polarisierten Endothelzellen oder Tumorzellen erstrecken, und bewirkt Membranreste hinter auf matr überlassenix, wenn die Zelle sich bewegt. TMED nanopodia und wurden aufgrund ihrer extremen Zerbrechlichkeit und Empfindlichkeit gegenüber Temperaturübersehen worden. Routine Waschen und Fixierung stören die Struktur. Nanopodia durch direkte Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) bei 37 º C aufbewahrt, gefolgt durch kurze Exposition gegenüber 0,01% Triton X-100 vor der Färbung. Nanopodia neue Perspektiven zu öffnen in der Zellbiologie: sie versprechen, unser Verständnis, wie Zellen ihre Umwelt wahr neu zu gestalten, zu erkennen und zu identifizieren anderen Zellen in einem Abstand, initiieren interzellulären Wechselwirkungen an engen Kontakt, und der Signalmechanismen in Bewegung, Proliferation und Zell -Zell-Kommunikation. Die, die für das Studium TM4SF1 abgeleitete nanopodia entwickelt werden Verfahren kann für die Studien von nanopodia, die in anderen Zelltypen durch die Vermittlung von klassischen Tetraspaninen, insbesondere des ubiquitär exprimiert CD9, CD81 und CD151 zu bilden.
Introduction
Während Polarisation für Bewegung, Tierzellen erstrecken sich über eine Vielzahl von dynamischen, Membran Vorsprünge von ihren Oberflächen, einschließlich Filopodien, Lamellipodien, Rückzug Fasern und Rüschen ein. Kürzlich zu dieser Liste hinzugefügt nanopodia eine neu erkannte Art von dünnen (100-300 um Durchmesser), längliche (bis zu 50-100 um lang) Membran Projektion, die Membrankanäle für die Erweiterung der F-Aktin Strukturen wie Filopodien stellen waren und Zurückziehen Faser, und das Flecken positiv mit TM4SF1 (Transmembran-4-L-sechs-Familie-1) in kultivierten Endothelzellen und Tumorzellen 2,3.
TM4SF1 ist ein Protein mit tetraspanin artige Topologie, das ursprünglich als ein Tumorzellantigen 4 vor der Entdeckung, dass das Molekül ein Endothelzellen-Biomarker, die eine wesentliche Rolle bei der Endothelzellenproliferation und-migration 2,3 spielt bekannt war. Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass TM4SF1 wird lokalisiert, um perinucLear Vesikel mit der Plasmamembran und in TM 4SF1 e nriched Mikro d omains (TMED) angereichert. TMED Anker nanopodia zu Matrix und in regelmäßigen Abständen von 1-3 gebändert Muster TMED / um Länge nanopodia vorhanden. Nanopodia erstrecken sich typischerweise von führenden vor einer Zelle und Nachlauf während der Zellpolarisation für Bewegung. Aufgrund der Natur der Firma haft TMED sind nanopodia nicht wieder in die Zelle zurückziehen, wie es sich bewegt; aufgegeben nanopodia Rückstände so verfolgen den Weg der Zellbewegung. Nanopodia Membrankanäle für die F-Aktin-und Ausfahren zu schaffen, und sind Websites der interzellulären Interaktion und Kommunikation 2,3. Diese Eigenschaften bedeuten, dass nanopodia eine einzigartige Gelegenheit, um die Mechanismen F-Actin-Montage während der Zellpolarisation, Zellerkundung der Umwelt, die Bestimmung der Weg und die Richtung der Zellbewegung und interzellulären Interaktionen zugrunde liegenden Studie liefern einnd-Kommunikation.
Aufgrund der stark hydrophoben Natur TMED und der dünnen und zerbrechlichen Natur des häutigen nanopodia, braucht besondere Pflege, um TMED und nanopodia bewahren genommen werden. Die Zerstörung und Entfernung von nanopodia TMED durch gemeinsame Labormethoden ist ein möglicher Grund, warum nur dreiundsechzig Publikationen auf TM4SF1 seit seiner ersten Entdeckung im Jahr 1986 ein und für den kompletten Mangel an Wissen über TM4SF1 Bereicherung in 100-300 um auf Mikrodomänen erschienen der Zelloberfläche, bis der Bericht der TM4SF1 in Endothelzellen in 2009 2.
Konventionelle Methoden verwenden Immunfärbung häufig organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Aceton, um Zellen zu reparieren und zu verwenden 0,1% oder höher Triton X-100-Konzentration auf Zellen permeabilisieren 5. Hier beschriebenen Studien implementiert drei wichtige Änderungen der herkömmlichen Methode zu zeigen, TMED und nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA und fixieren Zellen in einer 3776, C-Inkubator, (ii) gelten sanfte Raumtemperatur PBS waschen, und (iii) weniger als 0,03% Triton X-100 nur kurz, um Zellen permeabilisieren vor der Zugabe des primären Antikörpers, wie Triton X-100 höher als 0,03% wird extrahiert TM4SF1.
Alle Tetraspaninen bilden Mikrodomänen auf der Zellmembran 6 und einige kolokalisiert mit TMED in Endothelzellen und Tumorzellen 2,3. Wie Tetraspaninen wie CD9, CD81 und CD151 sind ubiquitär exprimiert, kann die hier beschriebenen Färbungsprotokoll zu vielen verschiedenen Zelltypen, die TM4SF1 fehlt für die Studien von nanopodia Funktion erweitert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia sind dünne Zellmembran Kanäle, die fest an, um durch TMED Matrix und kann mehr als 100 um aus einer mobilen Zelle polarisiert, um die Umwelt zu erfassen und zu vermitteln interzellulären Wechselwirkungen 2,3 verlängern. Nanopodia haften so fest, dass die Rückstände hinter wie die Zelle bewegt sich nach links Matrix (Abbildungen 1 und 2). Nanopodia damit es uns ermöglichen, zu untersuchen, wie Zellen ihre Umwelt spüren und bestimmen den Weg der Zellbewegung, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Harold Dvorak für hilfreiche Diskussionen einschließlich der Vorschlag, Fixierung in 37 ° C PFA versuchen. Diese Arbeit wurde vom NIH P01 CA92644 und durch einen Vertrag von der Nationalen Stiftung für Krebsforschung unterstützt.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
References
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