Nanopodia тонкие, но хрупкие мембранные каналы, которые простираются до 100 мкм от переднего фронта или задней задней ячейки и чувств сотовой среды. Прямая фиксация при 37 ° С, нежной стирки, и избежания органических растворителей, таких как этанол, метанол или ацетон и более высоких концентраций Тритон Х-100, должны соблюдать эти клеточные структуры.
Приверженец клетки в культуре поддерживать поляризованное состояние, чтобы поддержать движение и межклеточных взаимодействий. Nanopodia тонкие, удлиненные, в значительной степени F-актин-отрицательных мембранные выступы в эндотелиальных и раковых клеток, которые могут быть визуализированы с помощью TM4SF1 (Трансмембранное-4-L-шесть-семья-1) окрашивания иммунофлюоресценции. TM4SF1 кластеры в 100-300 диаметром мкм Tmed (ТМ 4SF1 е nriched микро D omains), содержащий от 3 до целых 14 отдельных TM4SF1 молекул. Tmed расположены прерывисто вдоль nanopodia на очередной интервал от 1 до 3 Tmed за μ м и прочно закрепить nanopodia в матрице. Это позволяет nanopodia расширить более 100 μ м от переднего фронта или задней задней поляризованных эндотелиальных или опухолевых клеток, и вызывает мембранные остатки, чтобы их оставили позади на MATRIX, когда клетка отходит. Tmed и nanopodia были упущены из-за их крайней хрупкости и чувствительности к температуре. Регулярное мытье и фиксация нарушают структуру. Nanopodia сохраняются путем непосредственного фиксации в параформальдегида (PFA) при 37 ° С с последующим короткой инкубации в 0,01% Triton X-100 перед окрашиванием. Nanopodia открыть новые перспективы в области клеточной биологии: они обещают, чтобы изменить наше понимание того, как клетки воспринимают окружающую их среду, обнаруживать и идентифицировать другие клетки на расстоянии, инициировать межклеточных взаимодействий в тесном контакте, и из сигнальных механизмов, участвующих в движении, пролиферации и клеточной -клеточные коммуникации. Методы, разработанные для изучения TM4SF1 производный nanopodia могут быть полезны для изучения nanopodia, которые образуют в других типах клеток посредством классических tetraspanins, в частности с повсеместно выражается CD9, CD81, CD151 и.
Во время поляризации для движения, клетки животных расширить разнообразные динамические, мембранные выступы из их поверхности, в том числе филоподий, ламеллиподий, отвода волокон, и оборками 1. Недавно добавленные в этот список были nanopodia, недавно признанным тип тонкий (100-300 мкм в диаметре), удлиненные (длиной до 50-100 мкм) мембраны проекция, которые обеспечивают мембранные каналы для расширения F-актиновых структур, таких как филоподий и отвод волокна, и что пятно положительно с TM4SF1 (трансмембранного-4-L-шесть семьи-1) в культивируемых эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3.
TM4SF1 представляет собой белок с tetraspanin, как топологии, который был первоначально известен как антигеном опухолевых клеток 4 до открытия, что молекула эндотелиальных биомаркеров клеток, что играет существенную роль в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции 2,3. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что TM4SF1 локализуется в perinucLear пузырьки и в плазматическую мембрану, и обогащен ТМ 4SF1 электронных nriched микро г omains (Tmed). Tmed якорь nanopodia к матрице и присутствует в регулярно расположенные Banded рисунком 1-3 длины Tmed / мкм из nanopodia. Nanopodia обычно простираются от переднего фронта клетки и конце задней течение поляризации клеток для движения. В связи с твердым приверженцем природы Tmed, nanopodia не в состоянии отказаться обратно в камеру, как она движется в сторону; брошенные остатки nanopodia таким образом проследить путь сотовой движения. Nanopodia обеспечить мембранные каналы для F-актина выдвижения и втягивания, и являются местами межклеточных взаимодействий и коммуникаций 2,3. Эти характеристики означают, что nanopodia предоставляют уникальную возможность для изучения механизмов, лежащих F-сборку актина во время клеточного поляризации, клеточном зондирования окружающей среды, определения пути и направления движения клеток и межклеточных взаимодействийй коммуникации.
В связи с высокой гидрофобной природы Tmed и тонкой и хрупкой мембранного природы nanopodia, особое внимание должно быть принято в целях сохранения Tmed и nanopodia. Разрушение nanopodia и удаления Tmed по распространенных методов лабораторных является возможная причина, почему только шестьдесят три публикации появились на TM4SF1 с момента своего первого открытия в 1986 1 и для полного незнания TM4SF1 обогащения в 100-300 мкм микродоменов на клеточной поверхности до доклада TM4SF1 в эндотелиальных клетках в 2009 году 2.
Обычные методы иммунным окрашиванием обычно используют органические растворители, как этанол, метанола, ацетона или исправить клетки и используют 0,1% или более высокую концентрацию Triton X-100 в проницаемыми клеткам 5. Исследования, описанные здесь реализуется три основных изменения с обычным способом выявить Tmed и nanopodia: (я) использовать 37 ° C 4% PFA и исправить клеток в 3776; C инкубатор, (II) нежный комнатной температуры стирки PBS, и (III) используют менее 0,03% Triton X-100 только кратко проницаемыми клетки перед добавлением первичного антитела, как Triton X-100 выше, чем 0,03% извлечет TM4SF1.
Все tetraspanins образуют микродомены на клеточной мембране 6 и некоторые локализуются с Tmed в эндотелиальных и опухолевых клеток 2,3. Как tetraspanins как CD9, CD81, CD151 и экспрессируются повсеместно, протокол окрашивания описанный здесь, может быть продлен до многих различных типов клеток, которые не имеют TM4SF1 для исследований функции nanopodia.
Nanopodia тонкие клеточной мембраны каналы, которые прочно прикрепить к матрице через Tmed и может расширить более 100 мкм от поляризованного мобильного клетки ощутить окружающую среду и посредником межклеточные взаимодействия 2,3. Nanopodia придерживаться матрицы так прочно, что остатки ос…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем, Д-р Гарольд Дворжака за полезные обсуждения в том числе по предложению попробовать фиксацию в 37 ° C PFA. Эта работа была поддержана NIH грант P01 CA92644 и договором с Национальным фондом по исследованию рака.
glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
Name of Reagent | |||
ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
Buffers and solutions | |||
70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
10X PBS (make 200 ml) | |||
20 ml of 10X PBS | |||
180 ml of double deionized water | |||
20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
4 ml | |||
16 ml double deionized water | |||
4% NaN3 (make 25 ml) | |||
1 g of NaN3 | |||
25 ml of double deionized water | |||
50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
830 μl of Collage I (3 mg) | |||
50 ml PBS | |||
ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
49 ml PBS | |||
2% FBS (add 1 ml) | |||
0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
25 μl of 20% Triton X-100 | |||
Name of Cell | |||
HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
Name of Equipment | |||
cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |