الأنسجة المهندسة والمستمدة من الخلايا الليفية مصفوفة الأصلي هو أداة لتوليد الناشئة ركيزة اللحمية التي تدعم انتشار الخلايا الظهارية والتمايز. هنا يتم تقديم بروتوكول تطبيق هذه المنهجية لتقييم تأثير مختلف أنواع الخلايا اللحمية في بيولوجيا الخلايا السرطانية.
وتستخدم على نطاق واسع الثقافات عضوي النمط 3D من الخلايا الظهارية على المصفوفة المضمنة مع خلايا اللحمة المتوسطة لدراسة تمايز الخلايا الظهارية والغزو. نوع ذيل فأر الأول من الكولاجين و / أو مصفوفة المستمدة من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما وقد استخدمت تقليديا باعتبارها ركائز لنموذج مصفوفة أو اللحمية المكروية في التي يتم ملؤها خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية عادة). على الرغم من التجارب باستخدام مثل هذه المصفوفات هي مفيدة للغاية، فإنه يمكن القول أنه نظرا لوجود الغالب من بروتين واحد (كما هو الحال في النوع الأول الكولاجين) أو على نسبة عالية من مكونات الغشاء القاعدي وعوامل النمو (مثل في مصفوفة المستمدة من الماوس خلايا ساركوما)، وهذه ركائز لا تعكس أفضل مساهمة لتكوين مصفوفة التي أدلى بها الخلايا اللحمية نفسها. لدراسة المصفوفات الأم التي تنتجها الخلايا الليفية الجلدية الأولية المعزولة من المرضى الذين يعانون من ورم عرضة، اضطراب وراثي عنيفا (التصنع المتنحيةانحلال البشرة الفقاعي)، ونحن تكيفت بروتوكول مصفوفة الأصلية الموجودة لدراسة غزو الخلايا السرطانية. وبفعل الخلايا الليفية لإنتاج مصفوفة خاصة بهم على مدى فترة طويلة في الثقافة. ثم يتم فصل هذه المصفوفة الأم من الطبق الثقافة والمصنف الخلايا الظهارية على ذلك قبل أن يتم رفع coculture كامل إلى واجهة الهواء السائل. ومن ثم يمكن تقييم التمايز الخلوي و / أو الغزو على مر الزمن. توفر هذه التقنية القدرة على تقييم التفاعلات الخلية الظهارية الوسيطة في وضع 3D دون الحاجة إلى مصفوفة الاصطناعية أو الخارجية مع العيب الوحيد هو فترة طويلة من الوقت المطلوب لإنتاج المصفوفة الأصلية. نحن هنا وصف تطبيق هذه التقنية لتقييم قدرة جزيء واحد التي أعربت عنها الخلايا الليفية، نوع السابع الكولاجين، لمنع غزو الخلايا السرطانية.
وقد مكن استخدام مادة بيولوجية في زراعة الأنسجة 3D الباحثين لدراسة سلوك الخلية في المختبر تحت ظروف فسيولوجية أقرب إلى بيئة في الجسم الحي من أن واحدة لخص مع 2D التصاق وركيزة من البلاستيك. على وجه الخصوص، إلى الأمام قد خطت خطوات كبيرة في نمذجة ظهائر طبقية مع اعتماد أساليب الثقافة 3D في واجهة الهواء السائل 1-4. هذه التقنيات تقليد بأمانة التمايز القرنية وغزو الخلايا السرطانية مما يتيح قدرا أكبر من المرونة والإخلاص للباحثين دراسة هذه العمليات. اختيار الركيزة مادة بيولوجية لتقليد البيئة اللحمية قد تشارك في المقام الأول على استخدام النوع الأول من الكولاجين، Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة والأدمة دي epidermized. على سبيل المثال، وقد ثبت أن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في المساهمة نحو غزو سرطان 5، بدء، وتطور عبر انسجة-الظهارية التفاعلات 6،7 عرجنمت ن في مثل هذه ركائز.
المعيار الذهبي لمحاكاة البيئة في انسجة الجلد، أكبر وأهم درس على نطاق واسع ظهائر طبقية باستخدام هذه التقنيات، ويعتبر أن يكون دي epidermized-الأدمة الإنسان (دائرة التنمية الاقتصادية). إعداد دائرة التنمية الاقتصادية ينطوي على إزالة البشرة عبر trypsinization أو تفارق المادية من جيفة الإنسان 3،4 الجلد. ومع ذلك، يمكن الحصول على مثل هذه البشرة يكون من الصعب للغاية بالنسبة للمختبرات التي لا ترتبط مع المؤسسات السريرية، والأدمة المريضة هو شبه مستحيل الحصول عليها. كبديل، والمختبرات في كثير من الأحيان استخدام مزيج من النوع الأول من الكولاجين (معزولة عن ذيول الفئران) و / أو Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة.
بعد اكتشاف في 1927 من قبل ناجوت 8 الكولاجين التي يمكن بسهولة أن تكون معزولة باستخدام حمض الخليك وهطول الأمطار والملح، وكان رائدا تطبيقه على زراعة الأنسجة في وقت لاحق من قبل Huzelلا وزملاؤه 9. أثبتت الكولاجين طلاء لتكون متفوقة على الزجاج للثقافة خلية من 29 سلالات وإإكسبلنتس الأنسجة كما استجوابه من قبل ارمان وGey 9. حاليا، يتم عزل نوع رئيسي من الكولاجين المستخدمة في زراعة الأنسجة من الأوتار ذيل فأر، وعادة ما يتم شراؤها من مصادر تجارية. ومع ذلك، فإن العيب عن المؤمنين الركيزة خلاصة هو أن الكولاجين ذيل فأر ليست مطابقة لالكولاجين الإنسان، أو الأدمة الإنسان، حيث من النوع الأول والثالث الكولاجين موجودة بوصفها مكونات رئيسية، ومعزولة الكولاجين ذيل فأر مجزأة دائما.
Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة هو خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما مثقف 10. المكونات الرئيسية هي laminin، النوع الرابع الكولاجين، والهيبارين كبريتات بروتيوغليكان، entactin وnidogen وسوف نسب الدقيق لهذه البروتينات تختلف من دفعة لدفعة واحدة. وبصرف النظر عن المؤيد الهيكليةالبروتينات، هذه المصفوفة يحتوي أيضا على مستويات عالية من عوامل النمو مثل عامل النمو تحويل β، عامل نمو البشرة، الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 والأبقار عامل نمو الخلايا الليفية، وعامل النمو المشتق من الصفيحات التي من شأنها تغيير السلوك الخلوية 11،12. لافتا نحو التعقيد الهائل من Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة، تم تحديد ما مجموعه 1،851 البروتينات في دراسة البروتين الأخيرة 13. في ضوء الطبيعة الغنية والمعقدة لهذه المصفوفة، وقد نصحت الحذر عند تفسير ومقارنة تجارب مختلفة مع استخدام تكنولوجيا المعلومات 11.
مختبرات لدينا اهتماما كبيرا في الأمراض الجلدية الوراثية، خاصة تلك التي لديها الاستعداد لتطوير سرطان الخلايا الحرشفية الجلدي (CSCC) 14. في حالة المتنحية الفقاعي التصنع البشرة (RDEB)، وهو مرض تقرحات شديدة مع الطفرات سلالة الجرثومية في الجينات COL7A1 <sتصل> 15-17، فقد قررنا أن المكروية الجلد في هؤلاء المرضى هو ورم تعزيز 18. خلال هذه الدراسة لم نتمكن من تقييم الورم تعزيز خصائص الخلايا الليفية الجلدية جزءا لا يتجزأ من داخل الكولاجين I / Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة والتحقيق سبل تقييم الخاصة، مصفوفة الخلايا الأم. لتحقيق هذا، فإننا تعديل تقنية السابقة من مختبر لوسي جيرمان تعمل على جلد الإنسان مكافئات 19،20. كان أسلوب جيرمان قادرة على إعادة بناء الجلد البشري مع الغشاء القاعدي منظمة تنظيما جيدا باستخدام القرنية والليفية الإنسان الثقافات الأولية في غياب سقالة الاصطناعية أو جثي.
في هذه الورقة الخطوات المستخدمة لألخص الجلدي المكروية ورم اللحمية (مصفوفة الأم) مشتقة مباشرة من الخلايا الليفية اللحمية الأولية في المختبر وصفها 18. المصفوفات الأصلية صالعمليات roduced الثقافة على المدى الطويل من الخلايا الليفية استخدمت بوصفها الجلد يعادل مقايسة لغزو الخلايا CSCC. نقدم البيانات باستخدام مصفوفة الأصلية المستمدة إما من المصفوفة خارج الخلية التي يفرزها الخلايا الليفية RDEB (نقص في نوع الكولاجين السابع (C7)) أو من الخلايا الليفية RDEB transduced retrovirally مع نوع الكولاجين السابع معربا عن بناء وإظهار تأثير عميق من الكولاجين واحدة على الورم غزو الخلية.
ويرجع ذلك إلى طبيعة هذه التجربة، يمكن أن إجمالي الوقت اللازم لإنجاز أن تصل إلى شهرين. طوال هذا الوقت، يجب أن يوظف الممارسات قصوى ثقافة الرعاية والأنسجة عقيمة لمنع التلوث الميكروبي.
وبصرف النظ…
The authors have nothing to disclose.
معتمد من قبل وكالة الأنباء الجزائرية ديبرا الدولية ومؤسسة الجلد البريطانية. ويدعم YZN بواسطة A * ستار – جامعة دندي برنامج دكتوراه الشراكة.
L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |