Summary
Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is een opkomende hulpmiddel om een stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.
Abstract
3D organotypische kweken van epitheliale cellen op een matrix ingebed met mesenchymale cellen worden veel gebruikt voor epitheliale celdifferentiatie en invasie bestuderen. Soort rat staart I collageen en / of matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen zijn van oudsher gebruikt als de substraten het modelleren van de matrix of stromale micromilieu waarin mesenchymale cellen (meestal fibroblasten) worden bevolkt. Hoewel experimenten met dergelijke matrices zijn zeer informatief, kan worden gesteld dat door een dwingende aanwezigheid van een enkel eiwit (zoals type I collageen) of een hoog gehalte aan basale membraan componenten en groeifactoren (zoals matrix afgeleid uit muis sarcoom cellen), deze substraten niet de beste bijdrage matrixsamenstelling door de stromale cellen zelf weerspiegelen. Om inheemse matrices geproduceerd door primaire dermale fibroblasten geïsoleerd van patiënten met een tumor gevoelig, genetische blaarvorming stoornis (recessief Dystrofe studerenepidermolysis bullosa), hebben we een bestaande natief matrix protocol tumorcelinvasie studie aangepast. Fibroblasten worden geïnduceerd om hun eigen matrix produceren gedurende langere tijd in kweek. Deze inheemse matrix wordt dan losgemaakt van de cultuur schotel en epitheliale cellen worden gezaaid op het voordat het gehele co-cultuur wordt verhoogd tot het lucht-water grensvlak. Celdifferentiatie en / of invasie kan vervolgens worden beoordeeld in de tijd. Deze techniek biedt de mogelijkheid om epitheliale-mesenchymale cel interacties in een 3D-omgeving beoordelen zonder een synthetisch of buitenlandse matrix met als enige nadeel dat het lange tijd nodig om de natieve matrix produceren. De toepassing van deze techniek Hier beschrijven we het vermogen van een molecuul van fibroblasten type VII collageen, tumorcel invasie te remmen te beoordelen.
Introduction
Het gebruik van biomateriaal in 3D weefselkweek heeft onderzoekers in staat gesteld celgedrag te bestuderen in het laboratorium onder fysiologische omstandigheden meer verwant is aan een in vivo omgeving dan een samengevat met 2D hechting en kunststof. In het bijzonder, naar voren hebben grote vooruitgang geboekt in het modelleren van gelaagde epitheel met de goedkeuring van 3D kweekmethoden bij de lucht-water grensvlak 1-4. Dergelijke technieken getrouw na te bootsen keratinocytdifferentiatie en tumorcelinvasie waardoor meer flexibiliteit en trouw voor onderzoekers bestuderen deze processen. De keuze van biomateriaal substraat aan de stromale omgeving nabootsen heeft vooral betrekking op het gebruik van type I collageen, Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en de-epidermized dermis. Bijvoorbeeld zijn kanker-geassocieerde fibroblasten aangetoond bijdragen aan kankerinvasie 5, initiatie en progressie via stroma-epitheliale interacties 6,7 when gekweekt in dergelijke substraten.
De gouden standaard voor het nabootsen van de stromale omgeving in de huid, het grootste en meest bestudeerde gelaagde epitheel gebruik van dergelijke technieken is te de-epidermized humane dermis (DED) beschouwd. Bereiding van DED betreft het verwijderen van de epidermis via trypsine of fysische dissociatie van menselijke kadaver huid 3,4. Niettemin kan de toegang tot dergelijke huid zeer moeilijk zijn voor laboratoria niet geassocieerd met klinische instellingen, en zieke dermis is bijna onmogelijk te verkrijgen. Als alternatief, laboratoria gebruiken vaak een combinatie van type I collageen (geïsoleerd uit staarten rat) en / of Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix.
Na de ontdekking in 1927 door Nageotte 8 dat collageen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd met behulp van azijnzuur en zout neerslag, werd de toepassing ervan op weefselkweek vervolgens ontwikkeld door huzella en collega's 9. Collageen coating bleek superieur aan glas voor celkweek van 29 stammen en weefselexplantaten als ondervraagd door Ehrmann en Gey 9 te zijn. Momenteel is de belangrijkste soort collageen in weefselcultuur van rat-staart pezen en wordt meestal gekocht van commerciële bronnen. Echter, het nadeel voor een getrouwe substraat recapitulatie is dat de rattenstaart collageen is niet identiek aan menselijk collageen, of de menselijke dermis, waar type I en III collageen aanwezig als belangrijkste bestanddelen zijn, en geïsoleerde rattenstaart collageen is altijd gefragmenteerd.
Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix is een geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door gekweekte Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoomcellen 10. De belangrijkste bestanddelen zijn laminin, type IV collageen, heparine sulfaat proteoglycanen, entactine en nidogen en de precieze verhoudingen van deze eiwitten zal variëren van partij tot partij. Naast structurele proeiwitten, deze matrix bevat ook aanzienlijke niveaus van groeifactoren zoals transformerende groeifactor β, epidermale groeifactor, insuline-achtige groeifactor 1, runder fibroblast groeifactor en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor die celgedrag 11,12 zou veranderen. De richting van de enorme complexiteit van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix, een totaal van 1851 eiwitten werden geïdentificeerd in een recente proteomics onderzoek 13. In het licht van de rijke en complexe aard van deze matrix, is voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren en vergelijken van verschillende experimenten met het gebruik van het 11.
Onze laboratoria hebben een grote interesse in genetische huidziekten, met name die met een aanleg voor het ontwikkelen van plaveiselcelcarcinoom van de huid (CSCC) 14. Bij recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB), ernstige blaarvorming ziekte met kiembaanmutaties in COL7A1 gen
In dit artikel worden de stappen die gebruikt worden om de cutane tumor stromale micro-omgeving (native matrix) recapituleren direct afgeleid uit primaire stromale fibroblasten in vitro worden beschreven 18. Inheemse matrices produced door langdurige kweek van fibroblasten werden als een dermale equivalent aan assay voor CSCC celinvasie. We presenteren gegevens met behulp natieve matrix verkregen uit de extracellulaire matrix afgescheiden door RDEB fibroblasten (tekort bij type VII collageen (C7)) of RDEB fibroblasten retroviraal getransduceerde met type VII collageen expressie construct en tonen de grote invloed van een collageen op tumor celinvasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki Principes en werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies.
1. Voorbereiding van de media en reagentia
- Bereiding van 200x van L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock
- Los 29 mg L-ascorbinezuur 2-fosfaat per 5 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) oplossing en filtreer door 0,22 urn membraanfilter. Vastleggen als 0,25 ml steriel fracties in -20 ° C.
- Voeg 0,25 ml van 200x L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock elk 50 ml fibroblast medium (DMEM met 1% L-glutamine en 10% foetaal runderserum) op de dag vereist, voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM L -ascorbinezuur 2-fosfaat.
- Bereiding van keratinocyt groeimedia
- Isolatie en kweek van primair SCC keratinocyten zijn eerder 21 beschreven. Bereiding van keratinocyten groeimedia wordt beschrevendaarin ook.
- Kortom, bereid de media als volgt:
300 ml DMEM en 100 ml Ham's F-12 aangevuld met 10% FBS
0,4 mg / ml hydrocortison
5 mg / ml insuline
10 ng / ml EGF
5 mg / ml transferrine
8.4 ng / ml cholera toxine
13 ng / ml liothyronine
1x penicilline-streptomycine oplossing
2. In Vitro Bouw van fibroblast-afgeleide Inheemse Matrix in L-ascorbinezuur 2-Fosfaat aangevuld medium
- Zaad 200.000 fibroblasten per putje in 6-well platen (20.000 cellen / cm 2) in fibroblast medium aangevuld met L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Opnieuw ingevoerd om de 2-3 dagen met 2-5 ml van de media. (Opmerking: Refeeding frequentie en het volume kan worden aangepast aan de individuele behoeften van verschillende cellen passen Zie "Discussies".).
- Een dikke laag van cellen ingebed in de extracellulaire matrix aan het eind van 6 weken, zichtbaar voor het blote oog (formulier
- Laat de inheemse matrix vlotter en verbouwen voor 5 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen. Door treksterkte en intrinsieke remodeling in matrix, de matrix sterk samentrekt en wordt gereduceerd tot een kleinere, maar dikker inheemse matrix, en is klaar om te worden gebruikt voor invasie assay.
3. Invasieanalyse met Tumor SCC Keratinocyten
- Pak de inheemse matrix voorzichtig met stompe tang en over te dragen aan nylon net. Eenmaal op de nylon net, verspreid de matrix zacht zo plat mogelijk liggen met een 1 ml micropipettip en stompe tang.
- Bereid de steriele klonale cilinders door smeren een kleine hoeveelheid steriele vaseline aan een uiteinde.
- Plaats de klonale cilinders op de inheemse matrix, met de vaseline naar beneden. Dit is om een afdichting tussen de natieve matrix en klonale ringen waarborgen.
- Voeg CSCC cellen aan de klonale cilinders (250.000 cellen in 100 ul keratinocyt groeimedium).
- Verwijder de klonale cilinders na 6 uur wanneer de CSCC cellen neer op de inheemse matrix hebben gevestigd.
- Til de nylon net met de inheemse matrix en CSCC cellen aan de lucht-water grensvlak op gebogen roestvrij staal gaas steun.
- Voeg keratinocytengroeifactor medium aangevuld met ascorbinezuur tot de media level de bodem raakt van de oorspronkelijke matrix.
- Verander media om de 2-3 dagen en de oogst op 7 en 14 dagen na het zaaien van CSCC cellen.
4. Oogsten van 3D Culturen en voorbereiding voor histologie
- Fix in 4% paraformaldehyde overnacht bij kamertemperatuur.
- Bisect de monsters en embed in was voor formaline gefixeerde in paraffine ingebedde blokken, met het snijvlak naar buiten.
- Als alternatief insluiten de doorsneden monsters in oktober en snap-vries onmiddellijk in vloeibare stikstof voor vers ingevroren weefsel blokken.
- Snijd 4 micrometer secties over microtoom en dewax (indien nodig). Vlekken met behulp van standaard hematoxyline en eosine. De CSCC cellen te visualiseren, monoklonaal antilichaam tegen keratine 14 (LL001, in-house) kan worden gebruikt in immunohistochemische kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze techniek opent de mogelijkheid van onderzoek en vergelijking van de invasieve gedrag van tumorcellen (in dit geval CSCC) onder verschillende 3D stromale omgevingen. Met deze techniek kan niet alleen C7-deficiënte natieve matrices die de RDEB dermale milieu samengevat gegenereerd, maar ook andere matrices die genetisch gemanipuleerd tot overexpressie C7 18. Zoals gezien in figuur 2, invasie van RDEB CSCC keratinocyten was significant vertraagd in C7-overexpressie natief matrices opzichte C7-deficiënte RDEB control. Deze invasie wordt gevisualiseerd via standaard histologische methoden, waar de gels zijn vastgesteld, ingebed in paraffine blokken en vervolgens doorgesneden en immunologisch. Voorgestelde antilichamen te gebruiken voor het kleuren anti-keratine 14 (LL001) voor CSCC cellen en anti-vimentine (V9) voor fibroblasten.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Workflow van generatie-fibroblast afgeleide inheemse matrix en de tumor invasieanalyse. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Keratine 14 (LL001) kleuring van de CSCC invasie in de inheemse matrix afgeleid van controle RDEB fibroblast tekort aan C7 (ai & bi), of in RDEB fibroblasten overexpressie volledige lengte C7 expressie (aii en bii), toont duidelijk aan dat de re-expressie van C7 in extracellulaire matrix kan CSCC keratinocyten invasie te vertragen. Kernen werden gekleurd met DAPI (in blauw) en fibroblasten met vimentine (in het groen) in bi en bii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de aard van dit experiment, kan de totale tijd van uitvoering maximaal twee maanden. Gedurende deze tijd moeten uiterste zorg en steriele weefselkweek methoden worden toegepast om microbiële contaminatie te voorkomen.
Naast zijn rol als cofactor bij de synthese van hydroxyproline en hydroxylysine van collagenen, ascorbinezuur stimuleert collageen mRNA expressie in fibroblasten 22. Het ascorbinezuur keuze hier is het stabieler L-ascorbinezuur 2-fosfaat 23. Bijvoeding driemaal per week aangeraden maar dit zal altijd afhankelijk cellen bestudeerd worden. De eerste fibroblastculturen zullen meer voedingsstoffen verbruikt als de weken voorbij, en meer frequente bijvoeding met grotere media volumes kan raadzaam zijn. Het is belangrijk om zacht bij veranderende media en zorg moet worden genomen om verstoringen minimalisering cellaag tijdens natieve matrixproductie.
De matrix moet zichtbaar worden meestal na 2 weken, vooral rond de omtrek van de put. Zelden zal de matrix zelf bevrijden zonder mechanische verstoring. Dit weerspiegelt de intrinsieke remodelleren van de matrix en treksterkte, waarbij de matrix naar binnen trekt, maar kan ook een teken dat de omtrek van de oorspronkelijke matrix werd verstoord in media veranderingen.
Bij het loslaten en het vrijmaken van de matrix cellaag van de plaat, moet men oppassen niet om gaten steken door de matrix. Kleine stompe cel schraper kan ook worden gebruikt in plaats van 1 ml micropipet tips. Plaatsing van de vrijgegeven inheemse matrix op een Nylon netwerk eerste (en zorg ervoor dat de inheemse matrix plat) zorgt voor veel gemakkelijker te hanteren en weer opheffen van de lucht-water grensvlak.
Dit protocol is de eerste te beschrijvenhet gebruik van natieve fibroblast matrix als dermale substraat te modelleren het micromilieu in tumorcel assays om nauwkeuriger en fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
APS wordt ondersteund door Debra International en de Britse Skin Foundation. YZN wordt ondersteund door A * STAR - University of Dundee Partnership PhD-programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
