Summary
Doku mühendisliği fibroblast türevli doğal matris epitel hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyen bir stromal alt-tabakayı üretmek için gelişmekte olan bir araçtır. Burada tümör hücre biyolojisi farklı stromal hücre tiplerinin etkisini değerlendirmek için bu yöntemi uygulayarak bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Mezenkimal hücreler ile gömülü bir matriks üzerinde, epitel hücrelerinin 3 boyutlu Organotipik kültürler geniş epitelyal hücre farklılaşması ve işgali incelemek için kullanılır. I kolajen ve / veya Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinden elde edilen matris geleneksel mezenkimal hücreler (genellikle fibroblastları) doldurulur içine matris ya da stromal mikro modellemek için alt-tabakalar olarak kullanılmıştır sıçan kuyruğu tip. Bu matrisler kullanılarak deneyler çok bilgilendirici olmakla birlikte, bu iddia edilebilir nedeniyle (örneğin tip I kolajen gibi) tek bir protein ya da temel zar bileşenlerinin ve bu tür fareden türetilen matriks olarak büyüme faktörleri (içeriği yüksek bir baskın varlığı sarkom hücreleri), bu alt-tabakalar en stromal hücreleri tarafından yapılan matris bileşime katkı yansıtmamaktadır. Bir tümör eğilimli, genetik kabarma bozukluğu (resesif distrofik olan hastalardan izole edilen primer dermal fibroblastlar tarafından üretilen ana matrisler incelemekepidermolisis bülloza), biz tümör hücre işgali incelemek için varolan yerli matris protokolü adapte var. Fibroblastlar kültürde uzun bir süre boyunca kendi matrisi üretmek üzere uyarılmaktadır. Bu yerli matrisi daha sonra kültür çanağı ayrılır ve tüm kokültürü hava-sıvı arayüzü yükseltilmektedir önce epitel hücreleri bunun üzerine tohumlanır. Hücresel farklılaşma ve / veya istila ardından zaman içinde değerlendirilebilir. Bu teknik, tek dezavantajı yerel matrisi üretmek için gereken zaman uzun süre olmak üzere, bir sentetik ya da yabancı bir matris için gerek kalmadan bir 3 boyutlu bir ortamda epitel-mezenkimal hücre etkileşiminin belirlenmesi olanağı sağlar. Burada tümör hücre istilasını inhibe etmek için fibroblastlar tarafından ifade edilen tek bir molekülün yeteneği, tip kolajen VII, değerlendirmek için bu tekniğin uygulanmasını tarif eder.
Introduction
3 boyutlu doku kültüründe biyo materyalin kullanılması 2B yapışma ve bir plastik alt-tabaka ile bir değinmeyecek daha fazla bir in vivo ortamda daha fazla benzer fizyolojik koşullar altında laboratuarda hücre davranışını incelemek için araştırmacılar sağladı. Özellikle, büyük adımlar ileriye hava-sıvı arayüzü 1-4 3D kültür yöntemlerinin benimsenmesi ile tabakalı epitel modelleme yapılmıştır. Bu tür teknikler sadakatle keratinosit farklılaşması ve bu süreçleri inceleyen araştırmacılar için daha fazla esneklik ve sadakat sağlayarak tümör hücresi istilasını taklit. Stromal ortamı taklit etmek için biyo-malzeme alt-tabaka seçimi temel olarak tip I kollajenin, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom matris ve de-epidermized dermişin kullanımı dahil oldu. Örneğin, kanser ile ilgili fibroblastlar stromal-epitelial etkileşimleri 6,7 ile kanser istilası 5, başlatma ve progresyon doğru katkıda gösterilmiştir when, alt tabakalar yetiştirilir.
Deride stromal çevreyi taklit için altın standart, bu tür teknikler kullanılarak en büyük ve en çok çalışılan tabakalı epitel, insan dermis (DED) de-epidermized edilmesi kabul edilir. DED hazırlanması insan kadavra derisi 3,4 ikinci tripsinizasyon veya fiziksel ayrışması ile epidermisin kaldırılmasını içerir. Ancak, bu tür cilt için erişim klinik kurumları ile ilişkili olmayan laboratuarlar için çok zor olabilir, ve hastalıklı dermis elde yakınında mümkün değildir. Bir alternatif olarak, laboratuarlar sık I kollajen (sıçan kuyrukları izole) ve / veya Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu matris tipi bir arada kullanın.
Bu kollajen 8 Nageotte tarafından 1927 yılında keşif kolayca asetik asit ve tuz çökelmesini kullanılarak izole edilebilir sonra, doku kültürü için uygulanması, daha sonra Huzel öncüleridirla ve arkadaşları 9. Kolajen kaplama Ehrmann ve Gey'de 9 tarafından sorgulanan olarak 29 suşları ve doku eksplantlarında hücre kültürü için cama göre daha üstün olduğu kanıtlanmıştır. Şu anda, doku kültüründe kullanılan kolajen önemli bir tipi, fare kuyruk tendon izole edilir ve genellikle ticari kaynaklardan satın alınır. Bununla birlikte, alt-tabaka sadık tekrarlama için dezavantajı, fare kuyruk kolajeni insan kolajen, tür I ve III kollajen ana bileşenler olarak mevcut olan insan dermiş, özdeş değildir ve izole edilmiş fare kuyruk kolajeni her zaman bölünmüş olmasıdır.
Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu matris kültüre Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkoma hücreleri 10 tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein karışımıdır. Ana bileşen laminin, tip IV kolajen, heparin sülfat proteoglikan, Entactin ve nidogen ve bu proteinlerin kesin oranları partiden partiye değişecektir. Kenara yapısal Proproteinlerden, bu matris, aynı zamanda, bir büyüme faktörü β, epidermal büyüme faktörü, insüline benzer büyüme faktörü, 1 sığır fibroblast büyüme faktörü ve hücre davranışını değiştirecek 11,12 trombosit türevli transforme edici büyüme faktörü gibi büyüme faktörlerinin önemli düzeyde içerir. Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom matris sırf karmaşıklığı dönük, 1.851 proteinlerin toplam yeni proteomik çalışmada 13 tespit edilmiştir. Yorumlanması ve bunun 11 kullanımı ile, farklı deneyler karşılaştırırken Bu matrisin zengin ve karmaşık doğası ışığında, dikkatli tavsiye edilmiştir.
Bizim laboratuvarları genetik deri hastalıkları, kutanöz skuamöz hücreli karsinom (CSCC) 14 gelişmekte olan bir yatkınlığı olan özellikle bir ilgi var. Resesif distrofık epidermoliz bullosa (RDEB), COL7A1 gen mutasyonu germline ile ciddi bir kabarma hastalık durumunda
Bu yazıda kutanöz tümör stromal mikroortam (yerli matris) özetlemek için kullanılan adımlar in vitro birincil stromal fibroblastlar doğrudan elde 18 açıklanmıştır. Native matrisler pfibroblast uzun süreli kültüründen roduced CSCC hücre istilası için tahlil eşdeğer bir dermal olarak kullanılmıştır. Biz, (VII tipi kolajen (C7) in eksik) RDEB fibroblastlar veya retroviral olarak tümör ile ilgili tek bir kolajen derin bir etki oluşturmak ve göstermek ifade eden bir tür VII kollajen ile transduse RDEB fibroblastlar salgılanan dışı matris ya da türetilmiş doğal matrisi kullanılarak veri mevcut hücre işgali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Helsinki İlkeler Bildirgesine göre yapılmıştır ve uygun Etik Komiteleri tarafından onaylandı.
1.. Medya ve Reaktifler hazırlanması
- L-askorbik asit 2-fosfat stoklar 200x hazırlanması
- Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) çözeltisi, 5 ml başına L-askorbik asit 2-fosfat 29 mg çözülür ve 0.22 um'lik bir membran filtresinden filtre. Mağaza -20 ° C de 0.25 mi steril olarak alikotları
- L, 0.1 mM'lik bir son konsantrasyon için, gerekli olan günde fibroblast ortamı (% 1 L-glutamin ve% 10 fetal sığır serumu ile DMEM) içinde her 50 ml 200x L-askorbik asit 2-fosfat stok 0.25 ml'lik bir şişe ekleme -askorbik asit 2-fosfat.
- Keratinosit büyüme ortamının hazırlanması
- Birinci SCC keratinositlerin izolasyonu ve kültürü, daha önce 21 tarif edilmiştir. Keratinosit büyüme ortamının hazırlanması tarif edilmektedirhususda.
- Kısaca, medya hazırlar:
300 ml DMEM ve% 10 FBS ile takviye edilmiş Ham F-12 ve 100 mi
0.4 mg / ml hidrokortizon
5 mg / ml insulin
10 ng / ml EGF
5 mg / ml transferrin
8.4 ng / ml, kolera toksini
13 ng / ml liothyronine
1x penisilin-streptomisin solüsyonu
2.. L-Askorbik Asit 2-Fosfat Tümlenmiş Medya fibroblast-türevli Yerli Matrix Vitro İnşaat
- 6-delikli plakalardaki L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmiş ortam içinde fibroblast (20,000 hücre / cm 2) iyi tohum başına 200,000 fibroblastlar. Ortam 2-5 ml her 2-3 günde Tekrar beslemeli. (Not: Refeeding frekans ve hacim farklı hücrelerin bireysel ihtiyaçlarına uygun şekilde ayarlanabilir "Tartışmalar" bölümüne bakın.).
- Hücre dışı matris içine gömülü hücrelerin kalın bir tabaka, çıplak gözle görülebilir 6 hafta, (sonunda oluşturacak
- Yerli matris şamandıra edelim ve her 2-3 gün medya değişiyor, 5 gün boyunca pişmanlık. Nedeniyle gerilme mukavemeti ve matris içinde içsel yeniden için, matris ölçüde sözleşme ve daha küçük, ama daha kalın yerel matrise düşük hale gelir ve işgal tahlil için kullanılmak üzere hazırdır.
3. Tümör SCC Keratinositler ile Invasion Deneyi
- Künt forseps ile yavaşça yerli matrisi Pick up ve Naylon net transfer. Bir kez Naylon net, 1 ml mikropipet kullanarak mümkün olduğunca düz yalan yavaşça matris yayıldıucu ve künt forseps.
- Bir ucunda steril vazelin küçük bir miktar lekelenme ile steril klonal silindirleri hazırlayın.
- Vazelin aşağı yüzü, yerel matrisi üzerinde klonal silindirleri yerleştirin. Bu yerli matrisi ile klonal halkaları arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için.
- Klonal silindir (keratinosit büyüme ortamı içinde 100 ul 250,000 hücre) için CSCC hücreleri ekleyin.
- CSCC hücreler yerli matris üzerinde yerleşmiş zaman 6 saat sonra klonal silindirleri çıkartın.
- Bükülmüş paslanmaz çelik tel örgü destek üzerine hava-sıvı arayüzü yerli matris ve CSCC hücreleri ile Naylon net kaldırın.
- Ortam seviyesi yerli matrisin alt temas edene kadar askorbik asit ile takviye edilmiş keratinosit büyüme ortam ekleyin.
- 7 her 2-3 gün ve hasat ortamı değiştirmek ve CSCC hücrelerin 14 gün sonrası tohumlama.
4. 3D Kültürlerin Hasat ve Histoloji Hazırlık
- % 4 par saptamakOda sıcaklığında gece boyunca aformaldehyde.
- Kesim yüzeyi dışa bakacak şekilde formalin fikse parafin bloklar için balmumu örnekleri ve embed, ikiye bölmek.
- Alternatif olarak, OCT bisected örnekleri embed ve snap-donma hemen taze dondurulmuş doku blokları için sıvı azot içinde.
- Mikrotom ve mumunun 4 mikron bölümleri (gerekirse) kesin. Standart hematoksilen ve eozin ile Leke. CSCC hücreleri görselleştirmek için, keratin 14 karşı fare monoklonal antikoru (LL001, in-house) immünohistoloji lekeleme kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknik, incelenmesi ve farklı 3D stromal ortamlarda (bu durumda CSCC olarak) tümör hücrelerinin invaziv davranışlarını karşılaştırmak olasılığını açar. Bu tekniği kullanarak, RDEB dermal çevre değinmeyecek C7-eksikli yerel matrisler sadece üretilen, aynı zamanda genetik olarak aşırı ifade C7 18 için tasarlanmış olan ek matrisler olabilir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, RDEB CSCC keratinositlerin istilası C7-eksikli RDEB kontrol ile karşılaştırıldığında C7-aşırı ifade yerli matrisler önemli derecede geri oldu. Bu işgal jeller, sabit parafin bloklara gömülü ve sonra kesitler ve immunohistokimyasal standart histolojik yöntemler aracılığıyla görüntülenmiştir. Boyama için kullanımı önerilen antikorlar CSCC hücreleri ve fibroblastlar için anti-vimentin (V9), anti-keratin 14 (LL001) bulunmaktadır.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1. Fibroblast türevli yerli matris ve tümör işgali testinin nesil iş akışı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. C7 fibroblast eksikliği kontrol RDEB türetilen doğal matrisine CSCC istilasının Keratin 14 (LL001) boyama (ai ve bi) veya RDEB fibroblastlarda aşırı eksprese eden tam uzunlukta C7 ifade (aii ve bii), açık bir şekilde göstermektedir ki yeniden ifade hücre dışı matriks içinde C7 CSCC keratinosit işgali geciktirebilir. Çekirdekleri (mavi) DAPI ile lekeli ve bi ve BII içinde (yeşil) vimentin ile fibroblastlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu nedenle deney doğası gereği, tamamlanması için gereken toplam süre, iki aya kadar olabilir. Bu süre boyunca, son derece dikkatli ve steril doku kültürü uygulamaları mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için istihdam edilmelidir.
Yanı sıra hidroksiprolin ve kolajenlerin hidroksilizin sentezinde bir kofaktör olarak rolünden, askorbik asit, fibroblastlar 22 kollagen özel mRNA ifadesini uyarır. Burada tercih edilen askorbik asit daha kararlı L-askorbik asit 2-fosfat 23'tür. Refeeding haftada üç kez tavsiye edilir, ancak bu her zaman çalışılan hücre bağımlı olacaktır. Haftalar geçtikçe ilk fibroblast kültürleri daha fazla besin tüketir ve daha büyük medya hacimleri ile daha sık Refeeding tavsiye edilebilir. Bu değişen medya ve bakım yerli matris üretimi sırasında hücre tabakası bozuklukları en aza indirmek için alınması gereken zaman nazik olmak önemlidir.
Matris, özellikle kuyunun çevresi etrafında genellikle 2 hafta sonra gözle görülür hale gelmelidir. Nadiren, matris herhangi bir mekanik bozulma olmadan kendini özgür olacaktır. Bu içeriye matrisi çeker matris ve çekme mukavemeti, içsel yeniden bir yansıması değil, aynı zamanda yerli matris çevresi medya değişiklikleri sırasında rahatsız olduğuna dair bir işaret olabilir.
Serbest ve plaka matris hücre tabakasını azat olduğunda, bir matriks delikler karıştırmak için dikkatli olmalısınız. Küçük künt hücre kazıyıcı da 1 ml mikropipet ipuçları yerine kullanılabilir. Bir naylon üzerine yayımlanan yerli matris yerleştirme (düz yerli matrisi koymak için emin olmak) hava-sıvı arayüzü çok daha kolay kullanım ve daha sonraki kaldırılması için yapar ilk örgü.
Bu protokol tanımlamak için ilkdaha doğru ve fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için tümör hücresi tahlillerinde mikro modellemek için bir dermal tabaka olarak yerel fibroblast matrisin kullanılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
APS Debra International ve İngiliz Cilt Vakfı tarafından desteklenmektedir. Dundee Ortaklık Doktora Programı Üniversitesi - Yzn A * STAR tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
