Summary
De ingeniería tisular matriz nativa derivado de fibroblastos es un nuevo instrumento para generar un sustrato del estroma que apoya la proliferación de células epiteliales y la diferenciación. Aquí se presenta un protocolo de aplicación de esta metodología para evaluar el impacto de los diferentes tipos de células del estroma en la biología de las células tumorales.
Abstract
Cultivos organotípicos 3D de células epiteliales en una matriz incrustada con células mesenquimales son ampliamente utilizados para estudiar la diferenciación de las células epiteliales y la invasión. Tipo de cola de rata colágeno I y / o una matriz derivada de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón han sido empleado tradicionalmente como los sustratos para modelar la matriz o estroma microambiente en el que se llenan las células mesenquimales (generalmente fibroblastos). Aunque los experimentos utilizando tales matrices son muy informativo, se puede argumentar que, debido a una presencia dominante de una sola proteína (como en el colágeno tipo I) o un alto contenido de componentes de la membrana basal y factores de crecimiento (tales como en la matriz derivada de ratón Las células del sarcoma), estos sustratos no reflejan mejor la contribución a la composición de la matriz de las propias células del estroma. Para estudiar las matrices nativas producidas por los fibroblastos dérmicos primarios aislados de pacientes con un tumor propensos, trastorno de formación de ampollas genética (distrófica recesivaepidermolisis bullosa), hemos adaptado un protocolo de matriz nativa existente para estudiar la invasión de las células tumorales. Los fibroblastos son inducidas a producir su propia matriz durante un período prolongado en cultivo. Esta matriz nativa se separa entonces de la placa de cultivo y las células epiteliales se siembran en que antes de todo el cocultivo se eleva a la interfaz aire-líquido. Diferenciación y / o la invasión celular se puede evaluar en el tiempo. Esta técnica proporciona la capacidad para evaluar la interacción de células epiteliales mesenquimales en un entorno 3D sin la necesidad de una matriz sintética o extranjera con la única desventaja es el período de tiempo prolongado requerido para producir la matriz nativa. Aquí se describe la aplicación de esta técnica para evaluar la capacidad de una sola molécula expresada por los fibroblastos, colágeno de tipo VII, para inhibir la invasión de células tumorales.
Introduction
El uso de biomaterial en cultivo de tejido 3D ha permitido a los investigadores a estudiar el comportamiento de células en el laboratorio bajo condiciones fisiológicas más similares a un entorno in vivo que el de uno recapitulado con la adhesión 2D y un sustrato de plástico. En particular, los grandes avances se han hecho en el modelado de epitelio estratificado con la adopción de métodos de cultivo en 3D en la interfase aire-líquido 1-4. Dichas técnicas fielmente imitan la diferenciación de los queratinocitos y la invasión de las células tumorales que permite una mayor flexibilidad y fidelidad para los investigadores que estudian estos procesos. La elección de sustrato biomaterial para imitar el entorno del estroma ha implicado principalmente el uso de colágeno de tipo I, de Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón y la dermis-epidermized DE. Por ejemplo, se ha demostrado que los fibroblastos asociados con el cáncer de contribuir hacia la invasión del cáncer 5, la iniciación y la progresión a través de interacciones estroma epitelial 6,7 wheN crecido en tales sustratos.
El estándar de oro para imitar el entorno del estroma en la piel, las mayores y más ampliamente estudiados epitelios estratificados utilizando estas técnicas, se considera que se des-epidermized dermis humana (DED). Preparación de la DED implica la eliminación de la epidermis a través de tripsinización o disociación física a partir de 3,4 piel de cadáver humano. Sin embargo, el acceso a dicha piel puede ser muy difícil para los laboratorios no asociados con instituciones clínicas y dermis enfermas es casi imposible de obtener. Como alternativa, los laboratorios utilizan con frecuencia una combinación de colágeno de tipo I (aislado de colas de rata) y / o matriz de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón.
Después de que el descubrimiento en 1927 por Nageotte 8 que el colágeno puede ser fácilmente aislado utilizando ácido acético y la precipitación de sales, su aplicación al cultivo de tejidos fue posteriormente iniciado por Huzella y colegas 9. Recubrimiento de colágeno resultó ser superior al vidrio para cultivo de células de 29 cepas y explantes de tejido como interrogados por Ehrmann y Gey 9. En la actualidad, el principal tipo de colágeno utilizado en el cultivo de tejidos se aísla de los tendones de cola de rata, y por lo general se compra a partir de fuentes comerciales. Sin embargo, el inconveniente de recapitulación sustrato fieles es que el colágeno de cola de rata no es idéntico al colágeno humano o la dermis humana, en los que están presentes como constituyentes principales de tipo I y III colágeno, y aislado de colágeno de cola de rata es invariablemente fragmentado.
Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón es una mezcla de proteína gelatinosa secretada por cultivos de células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm 10. Los principales constituyentes son laminina, colágeno tipo IV, proteoglicanos de sulfato de heparina, entactina y nidogen y las proporciones exactas de estas proteínas pueden variar de lote a lote. Aparte de pro estructuralproteínas, esta matriz también contiene niveles significativos de factores de crecimiento tales como la transformación de β factor de crecimiento, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina 1, factor de crecimiento de fibroblastos bovino, y factor de crecimiento derivado de plaquetas que pudieran alterar el comportamiento celular 11,12. Apuntando hacia la gran complejidad de Engelbreth-Holm-Swarm matriz de sarcoma de ratón, se identificaron un total de 1.851 proteínas en un estudio proteómico reciente 13. A la luz de la naturaleza rica y compleja de esta matriz, la precaución ha sido advertido en la interpretación y comparación de diferentes experimentos con el uso de la misma 11.
Nuestros laboratorios tienen un gran interés en enfermedades de la piel genéticos, particularmente aquellos con una predisposición a desarrollar cutánea de carcinoma de células escamosas (CSCC) 14. En el caso de epidermolisis bullosa distrófica recesiva (RDEB), una enfermedad grave con ampollas germinal mutaciones en el gen COL7A1
En este trabajo los pasos utilizados para recapitular el microambiente del estroma del tumor cutáneo (matriz nativa) derivan directamente de los fibroblastos del estroma primarias in vitro se describen 18. Matrices nativos produced por cultivo a largo plazo de los fibroblastos fueron utilizados como un equivalente dérmico a ensayo para la invasión de células CSCC. Se presentan los datos utilizando la matriz nativa derivada ya sea de la matriz extracelular secretada por los fibroblastos RDEB (deficiencia de colágeno tipo VII (C7)) o de los fibroblastos RDEB retroviralmente transducidas con un colágeno tipo VII expresando construir y demostrar el profundo efecto de una sola colágeno de tumor la invasión de células.
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Protocol
Este estudio se realizó de acuerdo a la Declaración de Principios de Helsinki y fue aprobado por los Comités de Ética apropiados.
1. Preparación de Medios y Reactivos
- Preparación de 200x de ácido L-ascórbico 2-fosfato de stock
- Disolver 29 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato por 5 ml de medio de Eagle modificado (DMEM) solución de Dulbecco y filtrar a través de 0,22 micras filtro de membrana. Tienda como 0,25 ml alícuotas estériles en -20 ° C.
- Añadir 0,25 ml de alícuota de ácido L-ascórbico de stock 200x 2-fosfato a cada 50 ml de medio de fibroblastos (DMEM con 1% de L-glutamina y suero bovino fetal al 10%) en el día requerido, para una concentración final de 0,1 mM de L ácido ascórbico-2-fosfato.
- Preparación de medio de crecimiento de queratinocitos
- Aislamiento y cultivo de queratinocitos primarios SCC se han descrito previamente 21. Preparación de medio de crecimiento de queratinocitos se describeen él también.
- En pocas palabras, la preparación de los medios de comunicación de la siguiente manera:
300 ml de DMEM y 100 ml de medio de Ham F-12 suplementado con 10% de FBS
0,4 mg / ml de hidrocortisona
5 mg / ml de insulina
10 ng / ml de EGF
5 mg / ml de transferrina
8,4 ng / ml de toxina del cólera
13 ng / ml liothyronine
Solución de penicilina-estreptomicina 1x
2. In Vitro La construcción de la Matriz Nativo derivados de fibroblastos en ácido L-ascórbico 2-fosfato suplementado Medios
- Seed 200.000 fibroblastos por pocillo en placas de 6 pocillos (20.000 células / cm 2) en medios suplementados con fibroblastos de ácido L-ascórbico 2-fosfato. Vuelva a introducir cada 2-3 días con 2-5 ml de medio. (Nota: Realimentación frecuencia y el volumen se pueden ajustar para adaptarse a las necesidades individuales de las diferentes células Ver "discusiones".).
- Una gruesa capa de células embebidas en la matriz extracelular se forma al final de las 6 semanas, visibles a simple vista (
- Deje que el flotador matriz nativa y remodelar por 5 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. Debido a la resistencia a la tracción y la remodelación intrínseca dentro de la matriz, la matriz se contraerá drásticamente reducida y se convierten a una matriz nativa más pequeño, pero más grueso, y está listo para ser utilizado para el ensayo de invasión.
3. Ensayo de invasión tumoral SCC con queratinocitos
- Recoge la matriz nativa suavemente con unas pinzas romas y traslado al Nylon red. Una vez en la red de nylon, se extendió la matriz suavemente para estar lo más plana posible utilizando una micropipeta 1 mlpunta y fórceps romos.
- Preparar los cilindros clonales estériles untando una pequeña cantidad de vaselina estéril en un extremo.
- Coloque los cilindros clonales en la matriz nativa, con la cara hacia abajo vaselina. Esto es para asegurar un sello hermético entre la matriz nativa y los anillos clonales.
- Añadir células CSCC a los cilindros clonales (250.000 células en 100 l de medio de crecimiento de queratinocitos).
- Retire los cilindros clonales después de 6 horas cuando las células CSCC se han establecido en la matriz materna.
- Levante la red de nylon con la matriz nativa y células CSCC para interfase aire-líquido sobre soporte de malla de alambre de acero inoxidable doblado.
- Añadir medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con ácido ascórbico hasta que el nivel de los medios de comunicación toca la parte inferior de la matriz nativa.
- Cambie medios cada 2-3 días y la cosecha a las 7 y 14 días después de la siembra de células CSCC.
4. La recolección de las Culturas en 3D y Preparación para Histología
- Fijar en el 4% nominaldurante la noche aformaldehyde a temperatura ambiente.
- Biseccionar las muestras y de inserción en la cera de parafina para fijado en formol e incrustados bloques, con la superficie cortada hacia el exterior.
- Alternativamente, incrustar las muestras bisectados en octubre y snap-congelado inmediatamente en nitrógeno líquido para bloques frescas de tejido congelado.
- Cortar 4 micras secciones de microtomo y desparafinado (si es necesario). Teñir utilizando hematoxilina y eosina estándar. Para visualizar las células CSCC, anticuerpo monoclonal de ratón contra la queratina 14 (LL001, en-casa) se puede utilizar en la tinción inmunohistología.
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Representative Results
Esta técnica abre la posibilidad de examinar y comparar el comportamiento invasivo de las células tumorales (en este caso CSCC) bajo diferentes ambientes estromales 3D. Usando esta técnica, no sólo las matrices nativas C7-deficientes que recapitulados el medio ambiente dérmica EADR se pueden generar, sino también matrices adicionales que han sido modificados genéticamente para sobreexpresar C7 18. Como se ve en la Figura 2, la invasión de los queratinocitos EADR CSCC fue significativamente retrasados en C7-sobreexpresan matrices nativas en comparación con el control EADR C7-deficientes. Esta invasión se visualiza a través de métodos histológicos estándar, donde los geles se fijaron, incrustados en bloques de parafina y luego seccionados y immunostained. Anticuerpos sugiere utilizar para la tinción son anti-queratina 14 (LL001) para células CSCC y anti-vimentina (V9) para los fibroblastos.
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Figura 1. Flujo de trabajo de la generación de la matriz nativa derivado de fibroblastos y el ensayo de invasión del tumor. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Queratina 14 (LL001) tinción de la invasión CSCC en la matriz nativa derivada del control EADR de fibroblastos deficientes en C7 (AI y BI), o en los fibroblastos RDEB sobre-expresión de expresión C7 de longitud completa (AII y BII), demuestra claramente que el reexpresión de C7 en la matriz extracelular puede retrasar la invasión de queratinocitos CSCC. Los núcleos se tiñeron con DAPI (en azul) y los fibroblastos con vimentina (en verde) en bi y bii.
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Discussion
Debido a la naturaleza de este experimento, el tiempo total requerido para la terminación puede ser de hasta dos meses. A lo largo de este tiempo, se deben emplear las prácticas de cuidado de cultivo y del tejido estéril todo lo posible para evitar la contaminación microbiana.
Aparte de su papel como un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina de colágenos, ácido ascórbico estimula el colágeno específica la expresión del ARNm en los fibroblastos 22. El ácido ascórbico de opción aquí es la más estable de ácido L-ascórbico 2-fosfato 23. Realimentación se recomienda tres veces a la semana, pero esto será invariablemente depende de las células que están siendo estudiadas. Los cultivos iniciales de fibroblastos se consumen más nutrientes que las semanas pasan, y la realimentación más frecuente con volúmenes de medios más grandes pueden ser aconsejable. Es importante tener cuidado cuando se deben tomar cambiantes medios de comunicación y el cuidado para minimizar las perturbaciones a la capa de células en la producción de matriz nativa.
La matriz debe ser visible por lo general después de 2 semanas, especialmente alrededor de la circunferencia del pozo. Con poca frecuencia, la matriz se liberará sin ninguna interrupción mecánica. Esto es un reflejo de la remodelación intrínseca de la matriz y la resistencia a la tracción, que tira hacia el interior de la matriz, pero también puede ser una señal de que la circunferencia de la matriz nativa fue perturbado durante los cambios de los medios de comunicación.
Al soltar y liberar la capa de células de la matriz de la placa, se debe tener cuidado de no hacer agujeros a través de la matriz. Pequeñas raspadores de células romos también se pueden usar en lugar de 1 ml punta de la micropipeta. La colocación de la matriz nativa lanzado sobre una malla de nylon primero (asegurándose de poner la matriz nativa plano) hace para un manejo más fácil y el levantamiento posterior a la interfase aire-líquido.
Este protocolo es el primero en describirel uso de la matriz de fibroblastos nativa como un sustrato dérmico para modelar el microambiente en ensayos de células tumorales con el fin de obtener datos más precisos y fisiológicamente relevantes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
APS es apoyado por la Fundación Debra Piel británica e internacional. YZN es apoyado por A * STAR - Universidad de Programa de Doctorado Dundee Partnership.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
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