Summary
Ткань инженерии фибробластов, полученных родной матрица является новым инструментом для создания стромы субстрат, который поддерживает пролиферацию эпителиальных клеток и дифференцировки. Вот протокол применения этой методологии для оценки воздействия различных видов клеток стромы на опухоль клеточной биологии представлен.
Abstract
3D органотипической культуры эпителиальных клеток на матрице с встроенной мезенхимальных клеток широко используется для изучения эпителиальных клеточной дифференциации и инвазии. Тип крысиный хвост коллагена и / или матрица получена из Engelbreth-Холм-Swarm мыши клеток саркомы были традиционно используются в качестве субстратов для моделирования матрицу или стромы микросреду, в которую мезенхимальные клетки (обычно фибробластов) заселены. Хотя эксперименты с использованием таких матриц очень информативным, можно утверждать, что в связи с первостепенной присутствии одного белка (например, в типа I коллаген) или высоким содержанием компонентов мембранных подвальных и факторов роста (например, в матрице, полученной из мыши клетки саркомы), эти подложки не наилучшим образом отражают вклад в матричной композиции, сделанное стромальных самих клеток. Для изучения родных матрицы, произведенные первичных фибробластов дермы, выделенных от больных с опухолью склонны, генетическая пузырей расстройство (рецессивный дистрофическийбуллезный эпидермолиз), мы адаптировали существующий собственный протокол матрицу для изучения вторжение опухолевых клеток. Фибробласты индуцируются производить свои собственные матрицу в течение длительного периода в культуре. Это родной матрица затем отделяется от культуральной чашки и эпителиальные клетки высевают на него прежде всего сокультивирования повышают до границы раздела воздух-жидкость. Клеточной дифференцировки и / или вторжение затем могут быть оценены с течением времени. Этот метод дает возможность оценить эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия клеток в 3D-настройки без необходимости синтетического или иностранной матрицы с единственным недостатком является длительный период времени, необходимый для получения родной матрицу. Здесь мы опишем применение этого метода для оценки способности одной молекулы, выраженное фибробластов, тип VII коллаген, ингибировать инвазию опухолевых клеток.
Introduction
Использование биоматериала в 3D культуре ткани позволило исследователям изучить поведение клеток в лаборатории в физиологических условиях больше похоже на окружающую среду в естественных условиях, чем у одного воспроизводятся с 2D адгезии и пластиковой подложке. В частности, большие успехи вперед были сделаны в моделировании стратифицированную эпителий с принятием 3D методами культивирования в воздух и жидкой фаз 1-4. Такие методы добросовестно имитировать дифференцировку кератиноцитов и инвазии опухолевых клеток благоприятной большую гибкость и точность для исследователей, изучающих эти процессы. Выбор биоматериала подложки для имитации среды стромальных имеет первую очередь предполагает использование типа I коллаген, Engelbreth-Холм-рой мыши саркомы матрицы и де-epidermized дермы. Например, рак, связанный фибробласты, как было показано, чтобы внести вклад инвазию раковых 5, инициации и прогрессии через стромальных-эпителиальных взаимодействий 6,7 Wheн выросли в таких субстратов.
Золотым стандартом для имитируя стромы среды в кожу, крупнейшие и наиболее широко изученных слоистых эпителий, использующие такие методы, рассматривается быть де-epidermized человека дермы (DED). Подготовка DED включает в себя удаление эпидермиса через трипсином или физического диссоциации от человеческого трупа 3,4 кожи. Однако доступ к такой кожи может быть очень трудно для лабораторий, не связанных с клиническими учреждениями, а больные дермы практически невозможно получить. В качестве альтернативы, лаборатории часто используют комбинацию типа коллагена (изолирован от крысиные хвосты) и / или Engelbreth-Холм-рой мыши саркома матрица.
После открытия в 1927 году Нажотта 8, что коллаген может быть легко выделен с использованием уксусной кислоты и соли осадков, его применение к культуре ткани впоследствии пионером Huzelла и его коллеги 9. Коллаген покрытие оказалось превосходит стекло для культивирования клеток из 29 штаммов и ткани эксплантов как опрошенных Ehrmann и Gey 9. В настоящее время основным типом коллагена используется в тканевой культуре изолирован от крыс-хвост сухожилий, и, как правило, купил из коммерческих источников. Однако недостатком для верного подложки рекапитуляции является то, что крысиный хвост коллагена не совпадает с человеческого коллагена, или человека дермы, где тип я и III коллагены присутствуют в качестве основных составляющих, и изолированы крысиный хвост коллагена неизменно фрагментирован.
Engelbreth-Холм-рой мыши саркома матрица является желеобразные смесь белок выделяется культивируемых Engelbreth-Холм-Swarm мыши клеток саркомы 10. Основными компонентами являются ламинином, тип IV коллагена, гепаринсульфат протеогликан, энтактин и нидоген и точные соотношения этих белков будут меняться от партии к партии. Помимо структурных Proбелки, эта матрица также содержит значительные уровни факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста β, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста 1, бычий фактор роста фибробластов, и тромбоцитарный фактор роста, который будет изменять поведение сотовой 11,12. Указывая к самой сложности Engelbreth-Холм-Swarm мыши саркомы матрицы, в общей сложности 1851 белков были идентифицированы в недавнем протеомного исследования 13. В свете богатого и сложного характера этой матрицы, осторожность была предупреждена при интерпретации и сравнения различных экспериментов с использованием его 11.
Наши лаборатории имеют большой интерес к генетическим кожных заболеваний, особенно тех, с предрасположенностью к развитию кожной плоскоклеточный рак (CSCC) 14. В случае рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (RDEB), тяжелой пузырей заболевания с зародышевой линии мутации в COL7A1 гена
В этой статье операции, используемые резюмировать кожную опухоль стромы микросреду (родной матрицу) выводится непосредственно из первичных стромальных фибробластов в пробирке описаны 18. Родные матрицы рroduced на долгосрочной культуре фибробластов были использованы в качестве дермального эквивалента до анализа на клеточной инвазии CSCC. Мы представляем данные, используя встроенную матрицу, полученную из любой внеклеточного матрикса, секретируемого RDEB фибробластов (дефицитных по типу VII коллагена (С7)) или из RDEB фибробластов, трансдуцированных ретровирусом типа VII коллагена, экспрессирующих построить и демонстрируют сильное воздействие единого коллагена на опухоли Вторжение сотовый.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов и был одобрен соответствующими комитетов по этике.
1. Подготовка сред и реактивов
- Подготовка 200x из L-аскорбиновой кислоты 2-фосфат складе
- Растворите 29 мг L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата в 5 мл модифицированной среде Игла (DMEM) раствор Дульбекко и фильтруют через 0,22 мкм мембранный фильтр. Магазин, как 0,25 мл стерильной аликвоты в -20 ° C.
- Добавить 0,25 мл аликвоты 200x L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата к каждому складе 50 мл фибробластов среде (DMEM с 1% L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) в день, необходимого для конечной концентрации 0,1 мМ L -аскорбиновой кислоты 2-фосфата.
- Подготовка питательной среды кератиноцитов
- Выделение и культивирование первичных кератиноцитов SCC были описаны ранее 21. Подготовка питательной среды кератиноцитов описываетсяв нем, как хорошо.
- Вкратце, подготовить средства массовой информации следующим образом:
300 мл DMEM и 100 мл Хэма F-12 с добавлением 10% FBS
0,4 мг / мл гидрокортизона
5 мг / мл инсулина
10 нг / мл EGF
5 мг / мл трансферрина
8,4 нг / мл холерного токсина
13 нг / мл лиотиронин
1x пенициллин-стрептомицин решение
2. In Vitro Строительство фибробластов Native Matrix в L-аскорбиновая кислота 2-фосфат дополнен СМИ
- Семенной 200000 фибробласты на лунку в 6-луночных планшетах (20000 клеток / см 2) в фибробластов среде с из L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата. Подпитку каждые 2-3 дня с 2-5 мл СМИ. (Примечание: возобновленного кормления частота и объем может быть скорректирована с учетом индивидуальных потребностей различных клеток См. "Разговоры".).
- Толстый слой клеток, внедренных в внеклеточного матрикса сформируют в конце 6 недель, видимых невооруженным глазом (
- Пусть родной матрицы поплавок и реконструировать в течение 5 дней, сменить носитель каждые 2-3 дня. Благодаря прочности на разрыв и внутренней реконструкции в матрицы, матрица будет сжиматься и становится значительно сокращен до меньшего, но более толстый родной матрицы, и готова быть использованы для вторжения анализа.
3. Вторжение Проба с опухоли ГТК кератиноцитов
- Возьмите родной матрицу осторожно тупыми щипцами и трансфер в нейлоновой сеткой. После того, как в сети нейлона, распространять матрицу мягко лежать как можно более плоскими, используя 1 мл микропипеткинаконечник и тупые щипцы.
- Подготовка стерильные цилиндры клоновых по размытию небольшое количество стерильного вазелина на одном конце.
- Поместите клоновых цилиндры на родном матрицы, со стороной Вазелин вниз. Это необходимо для обеспечения герметичности между родной матрицы и клоновых колец.
- Добавить CSCC клетки к клональных цилиндров (250000 клеток в 100 мкл питательной среды кератиноцитов).
- Удалите клоновых цилиндров после 6 часов, когда клетки CSCC расположились на родном матрицы.
- Поднимите сеть нейлона с родной матрицы и CSCC клеток к воздуха и жидкой фаз на изогнутой опоры сетка из нержавеющей стали.
- Добавьте СМИ роста кератиноцитов дополнены с аскорбиновой кислотой, пока уровень СМИ не касается дна родной матрицы.
- Изменение СМИ каждые 2-3 дней и урожай в 7 и 14 дней после высева CSCC клеток.
4. Заготовка 3D культур и подготовка к гистологии
- Fix в 4% номиналаaformaldehyde в течение ночи при комнатной температуре.
- Пополам образцы и вставлять в воск для фиксированных формалином и залитых в парафин блоков, с поверхности среза наружу.
- С другой стороны, вставлять пополам образцы в октябре и оснастки заморозить сразу в жидком азоте для свежих замороженных блоков ткани.
- Вырезать 4 мкм разделы, посвященные микротоме и депарафинизации (при необходимости). Пятно с использованием стандартного гематоксилин-эозином. Для визуализации клеток CSCC, моноклональное антитело мыши против кератина 14 (LL001, в доме) может быть использован в окрашивании иммуногистология.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод открывает возможность изучения и сравнения инвазии опухолевых клеток (в данном случае CSCC) под разными 3D стромальных средах. Используя эту технику, не только C7-дефицитных носители матрицы, которые воспроизводятся на окружающую среду RDEB кожной могут быть получены, но и дополнительные матрицы, которые были генетически модифицированных для сверхэкспрессии C7 18. Как видно на рисунке 2, вторжение в RDEB CSCC кератиноцитов было значительно отстают в С7-сверхэкспрессирующих родных матриц по сравнению с C7-дефицитных контроля RDEB. Это вторжение визуализируется с помощью стандартных гистологических методов, где гели фиксированных, встроенных в парафиновые блоки, а затем секционных и иммуноокрашиванию. Предлагаемые антитела, чтобы использовать для окрашивания являются анти-кератин 14 (LL001) для CSCC клеток и анти-виментина (V9) для фибробластов.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. Рабочий процесс генерации фибробластов родной матрицы и опухолевой инвазии анализа. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Кератин 14 (LL001) окрашивание вторжения CSCC в родной матрицы, полученной из управления RDEB фибробластов, дефицитного по C7 (ай & би), или в RDEB фибробластов сверхэкспрессирующих полнометражный C7 выражение (AII и Бий), ясно показывает, что повторное выражение C7 в внеклеточного матрикса может замедлить CSCC кератиноцитов вторжение. Ядра окрашивали DAPI (синим цветом) и фибробласты с виментина (в зеленом) в би и бия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за природы этого эксперимента, общее время, необходимое для завершения может быть до двух месяцев. На протяжении всего этого времени, все меры предосторожности и стерильной ткани практики культуры должны быть использованы для предотвращения микробного загрязнения.
Помимо своей роли в качестве кофактора в синтезе гидроксипролина и гидроксилизина из коллагенов, аскорбиновая кислота стимулирует коллагена специфическую экспрессию мРНК в фибробластов 22. Аскорбиновая кислота выбора здесь является более стабильным L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата 23. Повторного кормления рекомендуется три раза в неделю, но это будет неизменно зависит от клеток изучаются. Начальные культуры фибробластов будет потреблять больше питательных веществ, как проходят недели, и более частыми повторного кормления с большими объемами средств массовой информации может быть целесообразным. Важно быть нежным при смене СМИ и следует позаботиться, чтобы минимизировать нарушения в клеточном слое во время отечественного производства матрицы.
Матрица должна стать видимым как правило, после 2 недель, особенно по окружности скважины. Нечасто, матрица освободит себя без какой-либо механического разрушения. Это является отражением внутренней реконструкции матрицы и прочность на разрыв, который тянет матрицу внутрь, но также может быть признаком того, что окружность родной матрицы был нарушен во время смены носителя.
При освобождении и освобождая матрица слой клеток с пластинки, нужно быть осторожным, чтобы не ткнуть отверстия через матрицу. Небольшие тупые скребки клеток также могут быть использованы вместо 1 мл советы микропипетки. Размещение выпущен родной матрицы на нейлоновой сеткой, первым (будучи уверенным, чтобы заложить родной матрицу квартира) делает для гораздо более легкой обработки и последующего подъема к поверхности раздела воздух-жидкость.
Этот протокол является первым, кто описалиспользование родного фибробластов матрицы как кожного субстрата для моделирования микросреды в анализах опухолевых клеток, с тем чтобы получить более точные и физиологически соответствующие данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
APS поддерживается Дебра International и Британского фонда кожи. YZN поддерживается A * STAR - университет Программы PhD Данди партнерства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
