Summary
الأنسجة المهندسة والمستمدة من الخلايا الليفية مصفوفة الأصلي هو أداة لتوليد الناشئة ركيزة اللحمية التي تدعم انتشار الخلايا الظهارية والتمايز. هنا يتم تقديم بروتوكول تطبيق هذه المنهجية لتقييم تأثير مختلف أنواع الخلايا اللحمية في بيولوجيا الخلايا السرطانية.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع الثقافات عضوي النمط 3D من الخلايا الظهارية على المصفوفة المضمنة مع خلايا اللحمة المتوسطة لدراسة تمايز الخلايا الظهارية والغزو. نوع ذيل فأر الأول من الكولاجين و / أو مصفوفة المستمدة من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما وقد استخدمت تقليديا باعتبارها ركائز لنموذج مصفوفة أو اللحمية المكروية في التي يتم ملؤها خلايا اللحمة المتوسطة (الخلايا الليفية عادة). على الرغم من التجارب باستخدام مثل هذه المصفوفات هي مفيدة للغاية، فإنه يمكن القول أنه نظرا لوجود الغالب من بروتين واحد (كما هو الحال في النوع الأول الكولاجين) أو على نسبة عالية من مكونات الغشاء القاعدي وعوامل النمو (مثل في مصفوفة المستمدة من الماوس خلايا ساركوما)، وهذه ركائز لا تعكس أفضل مساهمة لتكوين مصفوفة التي أدلى بها الخلايا اللحمية نفسها. لدراسة المصفوفات الأم التي تنتجها الخلايا الليفية الجلدية الأولية المعزولة من المرضى الذين يعانون من ورم عرضة، اضطراب وراثي عنيفا (التصنع المتنحيةانحلال البشرة الفقاعي)، ونحن تكيفت بروتوكول مصفوفة الأصلية الموجودة لدراسة غزو الخلايا السرطانية. وبفعل الخلايا الليفية لإنتاج مصفوفة خاصة بهم على مدى فترة طويلة في الثقافة. ثم يتم فصل هذه المصفوفة الأم من الطبق الثقافة والمصنف الخلايا الظهارية على ذلك قبل أن يتم رفع coculture كامل إلى واجهة الهواء السائل. ومن ثم يمكن تقييم التمايز الخلوي و / أو الغزو على مر الزمن. توفر هذه التقنية القدرة على تقييم التفاعلات الخلية الظهارية الوسيطة في وضع 3D دون الحاجة إلى مصفوفة الاصطناعية أو الخارجية مع العيب الوحيد هو فترة طويلة من الوقت المطلوب لإنتاج المصفوفة الأصلية. نحن هنا وصف تطبيق هذه التقنية لتقييم قدرة جزيء واحد التي أعربت عنها الخلايا الليفية، نوع السابع الكولاجين، لمنع غزو الخلايا السرطانية.
Introduction
وقد مكن استخدام مادة بيولوجية في زراعة الأنسجة 3D الباحثين لدراسة سلوك الخلية في المختبر تحت ظروف فسيولوجية أقرب إلى بيئة في الجسم الحي من أن واحدة لخص مع 2D التصاق وركيزة من البلاستيك. على وجه الخصوص، إلى الأمام قد خطت خطوات كبيرة في نمذجة ظهائر طبقية مع اعتماد أساليب الثقافة 3D في واجهة الهواء السائل 1-4. هذه التقنيات تقليد بأمانة التمايز القرنية وغزو الخلايا السرطانية مما يتيح قدرا أكبر من المرونة والإخلاص للباحثين دراسة هذه العمليات. اختيار الركيزة مادة بيولوجية لتقليد البيئة اللحمية قد تشارك في المقام الأول على استخدام النوع الأول من الكولاجين، Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة والأدمة دي epidermized. على سبيل المثال، وقد ثبت أن الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان في المساهمة نحو غزو سرطان 5، بدء، وتطور عبر انسجة-الظهارية التفاعلات 6،7 عرجنمت ن في مثل هذه ركائز.
المعيار الذهبي لمحاكاة البيئة في انسجة الجلد، أكبر وأهم درس على نطاق واسع ظهائر طبقية باستخدام هذه التقنيات، ويعتبر أن يكون دي epidermized-الأدمة الإنسان (دائرة التنمية الاقتصادية). إعداد دائرة التنمية الاقتصادية ينطوي على إزالة البشرة عبر trypsinization أو تفارق المادية من جيفة الإنسان 3،4 الجلد. ومع ذلك، يمكن الحصول على مثل هذه البشرة يكون من الصعب للغاية بالنسبة للمختبرات التي لا ترتبط مع المؤسسات السريرية، والأدمة المريضة هو شبه مستحيل الحصول عليها. كبديل، والمختبرات في كثير من الأحيان استخدام مزيج من النوع الأول من الكولاجين (معزولة عن ذيول الفئران) و / أو Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة.
بعد اكتشاف في 1927 من قبل ناجوت 8 الكولاجين التي يمكن بسهولة أن تكون معزولة باستخدام حمض الخليك وهطول الأمطار والملح، وكان رائدا تطبيقه على زراعة الأنسجة في وقت لاحق من قبل Huzelلا وزملاؤه 9. أثبتت الكولاجين طلاء لتكون متفوقة على الزجاج للثقافة خلية من 29 سلالات وإإكسبلنتس الأنسجة كما استجوابه من قبل ارمان وGey 9. حاليا، يتم عزل نوع رئيسي من الكولاجين المستخدمة في زراعة الأنسجة من الأوتار ذيل فأر، وعادة ما يتم شراؤها من مصادر تجارية. ومع ذلك، فإن العيب عن المؤمنين الركيزة خلاصة هو أن الكولاجين ذيل فأر ليست مطابقة لالكولاجين الإنسان، أو الأدمة الإنسان، حيث من النوع الأول والثالث الكولاجين موجودة بوصفها مكونات رئيسية، ومعزولة الكولاجين ذيل فأر مجزأة دائما.
Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما مصفوفة هو خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب خلايا فأر ساركوما مثقف 10. المكونات الرئيسية هي laminin، النوع الرابع الكولاجين، والهيبارين كبريتات بروتيوغليكان، entactin وnidogen وسوف نسب الدقيق لهذه البروتينات تختلف من دفعة لدفعة واحدة. وبصرف النظر عن المؤيد الهيكليةالبروتينات، هذه المصفوفة يحتوي أيضا على مستويات عالية من عوامل النمو مثل عامل النمو تحويل β، عامل نمو البشرة، الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 والأبقار عامل نمو الخلايا الليفية، وعامل النمو المشتق من الصفيحات التي من شأنها تغيير السلوك الخلوية 11،12. لافتا نحو التعقيد الهائل من Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما المصفوفة، تم تحديد ما مجموعه 1،851 البروتينات في دراسة البروتين الأخيرة 13. في ضوء الطبيعة الغنية والمعقدة لهذه المصفوفة، وقد نصحت الحذر عند تفسير ومقارنة تجارب مختلفة مع استخدام تكنولوجيا المعلومات 11.
مختبرات لدينا اهتماما كبيرا في الأمراض الجلدية الوراثية، خاصة تلك التي لديها الاستعداد لتطوير سرطان الخلايا الحرشفية الجلدي (CSCC) 14. في حالة المتنحية الفقاعي التصنع البشرة (RDEB)، وهو مرض تقرحات شديدة مع الطفرات سلالة الجرثومية في الجينات COL7A1
في هذه الورقة الخطوات المستخدمة لألخص الجلدي المكروية ورم اللحمية (مصفوفة الأم) مشتقة مباشرة من الخلايا الليفية اللحمية الأولية في المختبر وصفها 18. المصفوفات الأصلية صالعمليات roduced الثقافة على المدى الطويل من الخلايا الليفية استخدمت بوصفها الجلد يعادل مقايسة لغزو الخلايا CSCC. نقدم البيانات باستخدام مصفوفة الأصلية المستمدة إما من المصفوفة خارج الخلية التي يفرزها الخلايا الليفية RDEB (نقص في نوع الكولاجين السابع (C7)) أو من الخلايا الليفية RDEB transduced retrovirally مع نوع الكولاجين السابع معربا عن بناء وإظهار تأثير عميق من الكولاجين واحدة على الورم غزو الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا لإعلان المبادئ هلسنكي وتمت الموافقة من قبل لجان الأخلاقيات المناسبة.
1. إعداد وسائل الإعلام والكواشف
- إعداد 200X من حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات الأسهم
- حل 29 ملغ من حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات في 5 مل من التعديل النسر متوسطة (DMEM) حل Dulbecco لوتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون الغشاء. المخزن كما 0.25 مل العقيمة مأخوذة في -20 درجة مئوية.
- إضافة 0.25 مل قسامة من 200X حمض الأسكوربيك L-2-الأسهم الفوسفات إلى كل 50 مل من وسائل الإعلام الخلايا الليفية (DMEM مع 1٪ L-الجلوتامين و 10٪ مصل بقري جنيني) في اليوم المطلوب، لتركيز النهائي من 0.1 ملم من L حمض الاسكوربيك 2 فوسفات.
- إعداد وسائط النمو القرنية
- وقد وصفت العزلة وثقافة الكيراتينية SCC الابتدائي سابقا 21. يوصف إعداد وسائط النمو القرنيةفيها كذلك.
- لفترة وجيزة، وإعداد وسائل الإعلام على النحو التالي:
300 مل من DMEM و 100 مل من هام لل-F 12 تستكمل مع FBS 10٪
مل الهيدروكورتيزون / 0.4 ملغ
5 ملغ / مل الأنسولين
10 نانوغرام / مل EGF
5 ملغ / مل ترانسفيرين
8.4 نانوغرام / مل بكتيريا الكوليرا
13 نانوغرام / مل يوثيرونين
1X حل البنسلين الستربتوميسين
2. في المختبر من الخلايا الليفية البناء المشتقة من مصفوفة الأصلية في L-2-حمض الاسكوربيك فوسفات تستكمل وسائل الإعلام
- البذور 200،000 الليفية لكل بئر في 6 لوحات جيدة (20،000 خلية / سم 2) في وسائل الإعلام تستكمل مع الخلايا الليفية من L-الاسكوربيك حمض 2 فوسفات. Refeed كل 2-3 أيام مع 2-5 مل من وسائل الإعلام. (ملاحظة: إعادة التغذية وتيرة وحجم ويمكن تعديلها لتناسب الاحتياجات الفردية للخلايا مختلفة انظر "المناقشات").
- وهناك طبقة سميكة من الخلايا المضمنة في المصفوفة خارج الخلية تشكل في نهاية 6 أسابيع، مرئية للعين المجردة (
- السماح للمصفوفة تعويم المحلية وإعادة تشكيلها لمدة 5 أيام، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. نظرا لقوة الشد وإعادة الجوهرية داخل المصفوفة، فإن مصفوفة التعاقد بشكل كبير وتصبح لانخفاض مصفوفة الأصلي أصغر، ولكن أكثر سمكا، وعلى استعداد لاستخدامها لغزو الفحص.
3. الغزو الفحص مع ورم الخلايا الكيراتينية SCC
- التقاط المصفوفة الأم بلطف مع ملقط حادة ونقل إلى صافي النايلون. مرة واحدة على الشبكة النايلون، ونشر مصفوفة بلطف إلى الاستلقاء قدر الإمكان باستخدام micropipette 1 ملتلميح وملقط حادة.
- إعداد اسطوانات النسيلي العقيمة التي كتبها تلطيخ كمية صغيرة من الفازلين المعقم واحدة على نهاية.
- وضع اسطوانات النسيلي على مصفوفة الأصلي، مع الجانب الفازلين أسفل. هذا هو لضمان وجود ختم ضيق بين مصفوفة الأم وحلقات النسيلي.
- إضافة خلايا CSCC إلى اسطوانات النسيلي (250،000 الخلايا في 100 ميكرولتر من وسائط النمو القرنية).
- إزالة اسطوانات النسيلي بعد 6 ساعة عندما استقروا الخلايا CSCC أسفل على المصفوفة الأصلية.
- رفع صافي النايلون مع مصفوفة الأصلي والخلايا CSCC إلى واجهة الهواء السائل على دعم عازمة الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة سلكية.
- إضافة وسائط النمو القرنية تستكمل مع حمض الأسكوربيك حتى يلامس مستوى وسائل الاعلام أسفل المصفوفة الأصلية.
- تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام والحصاد في 7 و 14 يوما بعد البذر من الخلايا CSCC.
4. حصاد الثقافات 3D والتحضير لعلم الأنسجة
- إصلاح في 4٪ الاسميةبين عشية وضحاها aformaldehyde في درجة حرارة الغرفة.
- تقسم العينات وتضمين الشمع في لالفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من كتل، مع سطح قطع تواجه الخارج.
- بدلا من ذلك، تضمين عينات شطر في أكتوبر والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل على الفور للكتل الأنسجة الطازجة المجمدة.
- قطع 4 ميكرومتر المقاطع على مشراح وdewax (إذا لزم الأمر). وصمة عار باستخدام haematoxylin القياسية ويوزين. لتصور الخلايا CSCC، والماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد الكيراتين 14 (LL001، في المنزل) يمكن استخدامها في immunohistology تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه التقنية يفتح إمكانية دراسة ومقارنة السلوك الغازية من الخلايا السرطانية (في هذه الحالة CSCC) تحت بيئات مختلفة انسجة 3D. باستخدام هذه التقنية، يمكن أن تتولد ليس فقط مصفوفات الأصلي C7-ناقصة التي خصت البيئة RDEB الجلدي، ولكن أيضا مصفوفات إضافية التي تم هندستها وراثيا لأكثر من صريحة C7 18. كما رأينا في الشكل 2، وكان غزو الخلايا الكيراتينية RDEB CSCC المتخلفين بشكل ملحوظ في C7-overexpressing المصفوفات الأم مقارنة مع السيطرة RDEB C7-ناقصة. هو تصور هذا الغزو عن طريق وسائل النسيجي القياسية، حيث تم إصلاح المواد الهلامية، جزءا لا يتجزأ في كتل البارافين ثم مقطوع وimmunostained. اقترح استخدام الأجسام المضادة لتلطيخ معادون للالكيراتين 14 (LL001) للخلايا CSCC ومكافحة vimentin (V9) لالليفية.
p_upload/51321/51321fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 1. سير العمل من جيل من الخلايا الليفية المشتقة من مصفوفة الأم والفحص غزو الورم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. الكيراتين 14 (LL001) تلطيخ للغزو CSCC في مصفوفة الأصلية المستمدة من السيطرة RDEB نقص الخلايا الليفية في C7 (منظمة العفو الدولية وثنائية)، أو في الخلايا الليفية RDEB الإفراط في التعبير عن كامل طول C7 التعبير (AII وBII)، يدل بوضوح على أن إعادة التعبير عن C7 في المصفوفة خارج الخلية يمكن أن تؤخر CSCC غزو القرنية. كانت ملطخة النوى مع دابي (باللون الأزرق) والخلايا الليفية مع vimentin (باللون الأخضر) في ثنائية وBII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرجع ذلك إلى طبيعة هذه التجربة، يمكن أن إجمالي الوقت اللازم لإنجاز أن تصل إلى شهرين. طوال هذا الوقت، يجب أن يوظف الممارسات قصوى ثقافة الرعاية والأنسجة عقيمة لمنع التلوث الميكروبي.
وبصرف النظر عن دورها بمثابة العامل المساعد في تركيب الهيدروكسي برولين وهيدروكسي ليزين من الكولاجين وحمض الاسكوربيك يحفز الكولاجين محددة التعبير مرنا في الخلايا الليفية 22. حمض الاسكوربيك الاختيار هنا هو أكثر استقرارا حمض الأسكوربيك L-2-23 الفوسفات. وينصح إعادة التغذية ثلاث مرات في الأسبوع ولكن هذا سوف يكون دائما تعتمد على الخلايا التي تجري دراستها. فإن الثقافات الليفية الأولية تستهلك المزيد من المواد الغذائية كما تمر الأسابيع، وإعادة التغذية على نحو أكثر تواترا مع وحدات التخزين أكبر وسائل الإعلام قد يكون من المستحسن. من المهم أن يكون لطيف عندما ينبغي أن تؤخذ تغيير وسائل الإعلام والحرص على تقليل الاضطرابات إلى طبقة الخلايا أثناء إنتاج مصفوفة الأصلية.
ينبغي أن تصبح المصفوفة مرئية عادة بعد 2 أسابيع، وخصوصا حول محيط البئر. نادرا، فإن مصفوفة تحرير نفسها من دون أي خلل ميكانيكي. هذا هو انعكاس لإعادة الذاتية للمصفوفة والشد، والتي تسحب المصفوفة إلى الداخل، ولكن قد يكون أيضا علامة على أن محيط المصفوفة الأم وانزعجت خلال التغييرات الوسائط.
عند إطلاق وتحرير طبقة الخلايا مصفوفة من لوحة، ويجب على المرء أن يكون حريصا على عدم لكزة ثقوب من خلال المصفوفة. ويمكن أيضا استخدام مكاشط حادة خلية صغيرة بدلا من 1 مل نصائح micropipette. وضع مصفوفة الأصلي صدر في الصعود إلى شبكة نايلون الأولى (ويجري التأكد من وضع مصفوفة الأصلي شقة) ليجعل من الاسهل بكثير المناولة ورفع لاحقة إلى واجهة الهواء السائل.
هذا البروتوكول هو أول من وصفاستخدام مصفوفة الخلايا الليفية المحلية باعتبارها الركيزة الجلدي لنموذج المكروية في المقايسات الخلايا السرطانية من أجل الحصول على بيانات أكثر دقة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
معتمد من قبل وكالة الأنباء الجزائرية ديبرا الدولية ومؤسسة الجلد البريطانية. ويدعم YZN بواسطة A * ستار - جامعة دندي برنامج دكتوراه الشراكة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| DMEM with L-glutamine, 4,500 mg/L D-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | Life Technologies | 11995-073 | |
| 100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
| Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
| Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 μm 25 μm diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
| Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |
References
- Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).
- Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface. Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).
- Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).
- Prunieras, M., Régnier, M. New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts. Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).
- Gaggioli, C. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits. Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).
- Ehrmann, R. L., Gey, G. O. The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen. J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).
- Kleinman, H. K. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).
- Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).
- BD Biosciences - Discover Labware. SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from: http://SPC-356230 Rev 5.0 Forthcoming.
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma. , Forthcoming.
- Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms. J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).
- Hovnanian, A. A. Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene. J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).
- Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils. J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).
- Ng, Y. Z. Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).
- Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. Chapter 15. Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).
- Pouliot, R. R. Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice). Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).
- Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines. Methods Biol. 731, 151-159 (2011).
- Pinnell, S. R. Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review. Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).
- Hata, R., Senoo, H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).
