Tissue konstruert fibroblast-avledede opprinnelige matrise er en ny verktøy for å generere en stromal substrat som understøtter epitelial cellevekst og differensiering. Her en protokoll å bruke denne metoden for å vurdere effekten av ulike stromal celletyper på kreftcellebiologi er presentert.
3D organotypic kulturer av epitelceller på en matrise med innebygde mesenchymalceller er mye brukt til å studere epitelial celledifferensiering og invasjon. Rotte hale type I kollagen og / eller matrise avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom celler har tradisjonelt blitt brukt som underlag for å modellere matrise eller stromal mikromiljøet der mesenchymalceller (vanligvis fibroblaster) er befolket. Selv om forsøk ved bruk av slike matriser er meget informative, kan det hevdes at på grunn av en overordnet tilstedeværelsen av et enkelt protein (for eksempel i type I kollagen) eller et høyt innhold av kjellermembrankomponenter og vekstfaktorer (slik som i matrise utledet fra mus sarcom-celler), kan disse substrater ikke best reflekterer bidrag til matrise-blandingen gjort av stromale celler selv. Å studere innfødte matriser produsert av primær dermal fibroblaster isolert fra pasienter med en svulst utsatt, genetisk blemmer forstyrrelse (recessive dystrofeEpidermolysis bullosa), har vi tilpasset en eksisterende innfødte matrise-protokollen for å studere svulst celle invasjon. Fibroblaster er overtalt til å produsere sin egen matrise over en lengre periode i kultur. Denne opprinnelige matrise blir så løsnet fra dyrkningsskål og epitelceller blir sådd ut på den før hele coculture heves til luft-væske-grensesnittet. Cellulær differensiering og / eller invasjon kan deretter vurderes over tid. Denne teknikken gjør det mulig å vurdere epitel-mesenchymale celle interaksjoner i en 3D-innstillingen uten behov for en syntetisk eller fremmed matriks med den eneste ulempe er den lengre tid som kreves for å frembringe den opprinnelige matrise. Her beskriver vi anvendelse av denne teknikk for å vurdere evnen til en enkelt molekyl uttrykt av fibroblaster, kollagen type VII, for å hemme tumorcelle invasjon.
Bruken av biomateriale i 3D vevskultur har gjort det mulig forskere for å studere oppførselen celle i laboratoriet under fysiologiske betingelser mer beslektet med en in vivo miljø enn en rekapitulert med 2D-adhesjon og en plast-substrat. Spesielt store fremskritt fremover har blitt gjort i modellering stratifisert epitel med innføringen av 3D-kultur metoder på luft-væske-grensesnittet 1-4. Slike teknikker trofast etterligne keratinocyte differensiering og svulst celle invasjon muliggjør større fleksibilitet og troskap for forskere som studerer disse prosessene. Valget av biomateriale substrat å etterligne stromal miljøet har primært involvert bruk av type I kollagen, Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrix og de-epidermized dermis. For eksempel har kreftassosierte fibroblaster vist seg å bidra til kreft invasjon 5, initiering og progresjon via stromal-epitel interaksjoner 6,7 When vokst i slike underlag.
Gullstandarden for ligne stromal miljøet i huden, de største og mest studerte stratifisert epitel ved hjelp av slike teknikker, regnes for å være de-epidermized menneskelige dermis (DED). Fremstilling av DED omfatter fjerning av overhuden via trypsinering eller fysisk disassociation fra humant kadaver skin 3,4. Men, kan tilgang til slik hud være svært vanskelig for laboratorier ikke forbundet med kliniske institusjoner, og syke dermis er nær umulig å oppnå. Som et alternativ, laboratorier ofte bruke en kombinasjon av type I kollagen (isolert fra rottehaler) og / eller Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise.
Etter oppdagelsen i 1927 av Nageotte 8 at kollagen kan lett bli isolert ved hjelp av eddiksyre og salt nedbør, ble sin søknad til vev kultur senere utviklet av Huzella og kolleger ni. Kollagen belegg viste seg å være bedre enn glass for cellekultur av 29 stammer og vev eksplantater som forhørt av Ehrmann og Gey ni. For tiden, er den større type av kollagen benyttes i vevskultur isolert fra rotte-hale sener, og er vanligvis kjøpes fra kommersielle kilder. Imidlertid er ulempen for trofast substrat gjentagelse er at rottehale kollagen ikke er identisk med humant kollagen, eller de humane dermis, hvor type I-og III-kollagen er tilstede som hoved-bestanddeler, og isolert rottehale kollagen er alltid fragmentert.
Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise er en geléaktig protein blanding utskilt av dyrkede Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom celler 10. De viktigste bestanddelene er laminin, type IV kollagen, heparin sulfat proteoglycan, entactin og nidogen og de eksakte prosenter av disse proteinene vil variere fra parti til parti. Bortsett fra strukturelle proproteiner, inneholder denne matrisen også signifikante nivåer av vekstfaktorer slik som transformerende vekstfaktor β, epidermal vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor-1, bovin fibroblast vekstfaktor og blodplateavledet vekstfaktor som ville endre cellulære oppførselen 11,12. Peker mot selve kompleksiteten i Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise, ble totalt 1851 proteiner identifisert i en fersk proteomikk studie 13. I lys av den rike og komplekse natur av denne matrisen, har forsiktig blitt informert når tolke og sammenligne ulike eksperimenter med bruk av det 11.
Våre laboratorier har en interesse i genetiske hudsykdommer, særlig de med en predisposisjon for utvikling av cutaneous plateepitelkarsinom (CSCC) 14. I tilfelle av recessive dystrofe Epidermolysis bullosa (RDEB), en alvorlig blemmer sykdom med germline mutasjoner i COL7A1 genet <sopp> 15-17, har vi fastslått at dermal mikromiljøet i disse pasientene er svulst fremme 18. I løpet av denne studien var vi ikke i stand til å vurdere svulsten fremme egenskaper dermal fibroblaster innebygd i kollagen I / Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom matrise og undersøkte måter å vurdere cellenes eget, native matrise. For å oppnå dette, endret vi en tidligere teknikk fra laboratoriet av Lucie Germain jobber med menneskelig hud ekvivalenter 19,20. Teknikken Germain, var i stand til å rekonstruere menneskehud med velorganisert basalmembran ved hjelp av primære human keratinocytt-og fibroblast-kulturer i fravær av et syntetisk eller avdød stillaset.
I denne utredningen trinnene som brukes til å rekapitulere den cutaneous svulst stromal mikromiljøet (native matrise) stammer direkte fra primær stromal fibroblaster in vitro er beskrevet 18. Native matriser produced ved langtidskultur av fibroblaster ble anvendt som en dermal ekvivalent med assay for CSCC celle invasjon. Vi presentere data ved hjelp av innfødte matrise stammer enten fra den ekstracellulære matrise utskilt av RDEB fibroblaster (mangelfull i type VII kollagen (C7)) eller fra RDEB fibroblaster retrovirally transduserte med en type VII kollagen uttrykke konstruere og demonstrere den dype effekten av en enkelt kollagen på tumor celle invasjon.
På grunn av arten av dette forsøk, kan den totale tid som kreves for fullføring være opp til to måneder. I løpet av denne tiden må ytterste forsiktighet og sterile vevskultur fremgangsmåter anvendes for å forhindre mikrobiell forurensning.
I tillegg til sin rolle som en kofaktor i syntesen av hydroksyprolin og hydroksylysin av kollagen, stimulerer askorbinsyre kollagenspesifikke mRNA ekspresjon i fibroblaster 22. Den askorbinsyre valg her er de…
The authors have nothing to disclose.
APS er støttet av Debra International og British Skin Foundation. YZN støttes av A * STAR – University of Dundee Partner PhD-programmet.
L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
DMEM with l-glutamine, | Life Technologies | 11995-073 | |
4,500 mg/L d-glucose, 110 mg/L sodium pyruvate | |||
100x Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Vaseline | VWR | PROL28908.290 | |
Clonal cylinders | Sigma | Z370789 | |
Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100um 25um diameter 100/pk | Millipore | NY1H02500 | |
Bent stainless steel wire mesh support | Made in house | Dimensions were made so that the mesh would fit into 6-well plates |