Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade

Summary

Dannelse af protein-komplekser in vivo kan visualiseres ved bimolekylær fluorescens komplementering. Interaktionspartnere fusioneres til komplementære dele af fluorescerende tags og udtrykt transient i tobaksblade, hvilket resulterer i et rekonstitueret fluorescenssignal ved tæt nærhed af de to proteiner.

Abstract

Mange proteiner interagerer transient med andre proteiner eller er integreret i multi-protein-komplekser til at udføre deres biologiske funktion. Bimolekylær fluorescens komplementering (BiFC) er en in vivo metode til at overvåge sådanne interaktioner i planteceller. I de præsenterede protokol de undersøgte kandidat proteiner fusioneret til komplementære halvdele af fluorescerende proteiner, og de respektive konstruktioner introduceres i planteceller via Agrobacterium-medieret transformation. Efterfølgende proteinerne udtrykt transient i tobaksblade og de gendannede fluorescerende signaler kan detekteres med et konfokalt laserscanningmikroskop i intakte celler. Dette giver ikke kun visualisering af samspillet selv, men også den subcellulære lokalisering af protein-komplekser kan bestemmes. Til dette formål kan markørgener indeholder en fluorescerende tag blive coudtrykt sammen med BiFC konstruktioner, og dermed visualisere cellulære strukturer såsom than endoplasmatiske reticulum, mitokondrier, Golgi-apparatet eller plasmamembranen. Kan overvåges fluorescerende signal enten direkte i epidermale bladceller eller i enkelte protoplaster, som let kan isoleres fra de transformerede tobaksblade. BiFC er velegnet til at studere protein-protein interaktioner i deres naturlige omgivelser i den levende celle. Det skal dog tages i betragtning, at udtrykket skal være drevet af stærke promotorer, og at samspillet partnerne er ændret som følge af fusion af de relativt store fluorescens tags, som kan interferere med interaktionen mekanisme. , BiFC er ikke desto mindre en glimrende tilgang, der supplerer andre almindeligt anvendte metoder undersøger protein-protein interaktioner, såsom coimmunoprecipitation, in vitro pull-down-analyser eller gær-to-hybrid eksperimenter.

Introduction

Studere dannelsen af protein-komplekser og deres lokalisering i planteceller i vivo er vigtigt at undersøge mobilnetværk, signalering og metaboliske processer. BiFC tillader visualisering af protein-protein interaktioner i deres naturlige miljø direkte i den levende plantecelle ^1-5.

I BiFC nærmer komplementering af to fluorescerende N-og C-terminale fragmenter af et fluorescerende protein fører til en rekonstitueret fluorescerende protein. Fragmenter af mange forskellige fluorescerende proteiner er blevet anvendt til påvisning af protein-interaktioner, fx det grønne fluorescerende protein (GFP) kromoforen som er kemisk dannet af tre forskellige rester ^6. Fluorescerende proteiner kan halveres i en løkke eller ß-streng til at resultere i de to fluorescerende fragmenter, der kan være fusioneret til begge proteiner af interesse. Assayet kan anvendes til at detektere interaktioner i enhver subcellulære rum firent i nogen aerobt voksende organisme eller celler, der kan være genetisk modificeret til at udtrykke fusionsproteiner. Hvis de to proteiner stammer i tæt nærhed i cellen fluorescens rekonstitueres og kan overvåges ved hjælp af mikroskopi uden tilsætning af exogene fluorophorer eller farvestoffer ^3.

Tobacco (Nicotiana benthamiana) har vist sig at være en bekvem model organisme at visualisere samspillet af vegetabilske proteiner, da proteiner nemt kan udtrykkes ved at udnytte Agrobacterium-medieret transformation af tobaksblade med de genererede konstruktioner. Agrobakterier bruge en såkaldt Ti-plasmid (tumorinducerende), der koder for enzymer, der medierer transduktionen af ​​genet af interesse i planteceller. BiFC er vel gælder for opløseligt samt membranproteiner inden for alle cellulære rum, og har været anvendt med succes i de seneste år til at identificere interagerende proteiner in vivo såvel som at analysere interaktionsstederinden proteinerne ^7-9. Efter ekspression af de indførte gener, kan interaktionen af ​​de fluorescerende proteiner visualiseres direkte i blade, der er egnet til større cellulære strukturer, såsom det endoplasmatiske reticulum (ER), plasmamembranen eller chloroplaster. For at overvåge lokalisering i mere raffinerede strukturer, for eksempel, chloroplast konvolut, er det tilrådeligt at visualisere fluorescens i protoplaster isoleret fra transformerede tobaksblade. Et sæt af BiFC vektorer indeholdende enten en C-terminal eller N-terminal fluorescerende mærke skal anvendes til BiFC tilgang i planter ^10. Beskrevet i det følgende protokol blev anvendt til at undersøge samspillet mellem cytosol varmeshockprotein 90 (HSP90) med tetratricopeptide repeat (TPR) domæne indeholdende docking proteiner Toc64 og AtTPR7 bosat i chloroplasten yderste kuvert og det endoplasmatiske reticulum, henholdsvis ^11-13. Til dette formål blev HSP90 fusioneret med Cterminal del af SCFP (SCFP ^C). Tag'en N-terminalt fusioneret til chaperonen for at sikre tilgængeligheden af ​​den C-terminale MEEVD bindende motiv af HSP90 at fastspænde-type TPR domæner. Samtidig blev den N-terminale del af Venus (Venus ^N) fusioneret til den cytosoliske domæner i TPR domæne indeholdende docking proteiner Toc64 og AtTPR7 hhv. Som en negativ kontrol klonede vi det opløselige C-terminale del af SCFP ^C alene, som er placeret i cytosolen og er derfor en passende kontrol.

De fluorescerende tags af de undersøgte proteiner står over for den samme cellulære rum til at tillade nærhed og dermed rekonstituering af det fluorescerende signal. For at bestemme lokaliseringen af ​​det rekonstituerede fluorescenssignal en markør fusioneret til et andet fluorescerende mærke kan cotransformeres at demonstrere den subcellulære lokalisering af interaktionen. En ER-markør fusioneret til mCherrry blev transformeret samtidigt itilfælde af ER placeret AtTPR7 ^14. Den autofluorescens af klorofyl tjente som chloroplasten markør i tilfælde af Toc64. Med dette ikke blot in vivo interaktionen af Toc64 og AtTPR7 med henholdsvis den cytosoliske HSP90 chaperone kan overvåges direkte i tobaksbladene, men også den subcellulære lokalisering af interaktionen kan undersøges.

BiFC er velegnet som en tilgang til andre metoder, der studerer protein-protein interaktioner. Sammenlignet med coimmunoprecipitation eller in vitro-nedtrækningsforsøg for eksempel ingen specifikke antistoffer skal være til rådighed for proteinerne af interesse, og proteinerne ikke skal udtrykkes rekombinant in vitro, hvilket kan være en udfordring, især for membranproteiner. Desuden også forbigående interaktioner kan overvåges ved hjælp BiFC, da proteinerne er fanget af samspillet mellem de sammensmeltede fluorescerende tags ^15.

Protocol

1.. Transformation af BiFC Konstruerer i Agrobacteria Kloning af BiFC konstruktioner Forstærk genet af interesse fra et passende skabelon ved hjælp af oligonukleotider indeholdende flankerende attB-sites. Udføre en PCR under anvendelse af en korrekturlæsning polymerase. Tilpasse længden af ​​udglødningstrin til designet primer kombination, og længden af ​​forlængelsen trin ifølge størrelsen fragment. Kontroller PCR-produktet ved agarosegelelektroforese og rense det ved hjælp af en …

Representative Results

I dette eksempel anvendte vi BiFC metode til at overvåge interaktionen af ​​den cytosoliske molekylchaperone HSP90 med membran docking-proteiner AtTPR7 og Toc64. AtTPR7 er en del af Sec translocon og interagerer med cytosoliske chaperoner, som muligvis leverer sekretoriske preproteins for posttranslationel translokation til ER-membranen. Ligeledes Toc64 på chloroplasten kuvert optræder i post-translationel import ved at modtage HSP90 tilknyttede chloroplastproteiner preproteins. Begge proteiner omfatter en cytoso…

Discussion

Ved planlægningen af ​​et BiFC eksperiment flere punkter bør overvejes. Selv om ingen strukturel information om de proteiner af interesse er påkrævet, topologi skal være kendt, når der arbejdes med membranspændende proteiner. De fluorescerende proteiner er nødt til at opholde sig i samme subcellulære rum eller står over for samme side af en membran for at tillade interaktion. Naturligvis, når analysere proteiner, der kræver en N-terminal targeting sekvens kun en C-terminal tag kan overvejes. Da det er mu…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)