Summary
لفهم بنية الشبكات العصبية، وتوصيف وظيفي والمورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية هو ضرورة. هنا، علينا أن نظهر وضع العلامات juxtasomal biocytin، والذي يسمح التسجيلات الكهربية في تكوين الخلية، ولكن الحفاظ على القدرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية لإعادة الإعمار آخر مخصص للشجيري والهندسة المعمارية محور عصبي.
Abstract
تتميز قشرة الدماغ بواسطة طبقات متعددة وكثيرة متميزة الخلية الأنواع التي معا كشبكة هي المسؤولة عن العديد من الوظائف المعرفية بما في ذلك صنع القرار العليا، والسلوك الحسي موجهة أو الذاكرة. لفهم كيف يمكن لهذه الشبكات العصبية المعقدة أداء مثل هذه المهام، خطوة حاسمة في تحديد وظيفة (أو النشاط الكهربائي) من أنواع الخلايا الفردية داخل الشبكة، تفضيلي عند الحيوان هو أداء مهمة المعرفية ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أيضا لتحديد بنية التشريحية للشبكة والبنية المورفولوجية من الخلايا العصبية الفردية للسماح الهندسة العكسية شبكة القشرية. اختراقات التقنية المتاحة اليوم تسمح تسجيل النشاط الخلوي في اليقظة، تتصرف الحيوانات مع خيار قيمة من آخر مخصص تحديد الخلايا العصبية المسجلة. هنا، علينا أن نظهر تقنية وضع العلامات juxtasomal biocytin، الذي ينطوي على إجراءات تسجيل potentiآل ارتفاعه في تكوين خارج الخلية (أو فضفاضة التصحيح) باستخدام ماصات التصحيح التقليدية. تكوين تسجيل juxtasomal مستقرة نسبيا وقابلة للتطبيق في جميع أنحاء الظروف السلوكية، بما في ذلك تخدير، مخدرا، مستيقظا الثابتة الرأس، وحتى في الحيوان يتحرك بحرية. وهكذا، وهذه الطريقة تسمح ربط الخلايا من نوع إجراءات محددة ارتفاعه المحتملة خلال سلوك الحيوان لإعادة بناء الخلايا العصبية الفردية، وفي نهاية المطاف، والمتناهية الصغر القشرية بأكملها. في هذه المخطوطة الفيديو، وتبين لنا كيف يمكن أن توصف الخلايا العصبية الفردية في تكوين juxtasomal مع biocytin في الفئران مخدرة يوريثان لتحديد آخر مخصص وإعادة الإعمار المورفولوجية.
Introduction
تتكون الشبكات العصبية من أنواع خلايا متعددة، وتتميز خصائص المورفولوجية والفسيولوجية محددة للغاية 1-7. نتيجة لذلك، أنواع الخلايا الفردية أداء المهام المتخصصة داخل الشبكة (انظر على سبيل المثال Gentet وآخرون. 8 وBurgalossi وآخرون. 9). نحن ليست سوى بداية لفهم وظائف محددة نوع الخلية عبر الشبكات العصبية والكثير لا يزال يتعين اكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية، العديد من المعامل وتنفيذ نهج التجريبية التي تسمح للتحليل الخصائص المورفولوجية من نفس السكان من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها المعلمات الفسيولوجية 1،10-15. هنا، ونحن لشرح وضع العلامات juxtasomal تقنية 16،17 الذي ينطوي التسجيلات الكهربية باستخدام ماصات التصحيح التقليدية في التكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية في تركيبة مع التثقيب الكهربائي من الخلايا العصبية المسجلة مع biocytin. الالميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن طبيعة موسع يضمن أن العمل ارتفاعه المحتملة من الخلايا العصبية الفردية يتم تسجيلها دون تغيير (على سبيل المثال dialyzing) محتوى الخلايا من الخلية. تليها التثقيب الكهربائي، ونهج juxtasomal يوفر خيار آخر تحديد الخلية المخصصة وإعادة الإعمار لربط وظيفة (وظائف الأعضاء) لهيكل (التشكل). عادة والتعمير المورفولوجية ينطوي على إعادة بناء التشكل شجيري ومحور عصبي والتي يمكن أن تمتد إلى العمود الفقري الكمي و / أو حبة الكثافة أو حتى إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية في القرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني. تقنية تسجيل juxtasomal يمكن استخدامها لفي الجسم الحي تسجيلات لمختلف أنواع الخلايا عبر الطبقات القشرية أو في المناطق شبه القشرية في مجموعة من الأنواع، على الرغم من أن معظم الدراسات قد طبقت هذه التقنية في القوارض الصغيرة مثل الفئران أو الجرذان. وتركز أبحاثنا على تسجيل ووصفها الخلايا العصبيةمن الفئران القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) وينطوي على تحديد الخلايا العصبية البصرية سجلت 18، شجيري اعادة البناء في تركيبة مع تسجيل دقيق في إطار مرجعية موحدة لعكس مهندس شبكات القشرية 4،19 وإعادة الإعمار مفصلة العمارة محور عصبي لوصف نوع محدد خلية محلية والإسقاط طويل المدى يستهدف 20.
مقارنة في الجسم الحي تقنيات التسجيل بديلة (الخلايا أو خلية كاملة)، والتسجيلات juxtasomal مستقرة نسبيا، وبالتالي يمكن تطبيقها في جميع أنحاء دول السلوكية بما في ذلك تخدير 21،22، مخدرا 14، 23 مستيقظا الحيوانات الثابتة الرأس، أو التحرك بحرية، وحتى 9 . هنا، وتبين لنا وضع العلامات juxtasomal في S1 من الفئران تخدير يوريثان، على الرغم من أننا نشدد على تطبيق العام لهذه التقنية إلى العديد من الأعمال التحضيرية في الاختيار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحيوان
يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للقانون الهولندي وبعد تقييم من قبل لجنة أخلاقية المحلية في VU جامعة أمستردام، هولندا.
- تخدير الفئران ويستار (P25-P45، ♂ / ♀) مع isoflurane و(2-3٪ في الأكسجين)، وبعد ذلك مع يوريثان (20٪ في كلوريد الصوديوم 0.9٪، 1،6-1،7 جم / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق. تقييم عمق التخدير عن طريق مراقبة انسحاب قرصة، وردود الفعل جفن، والحركات vibrissae.
- إدارة جرعة إضافية من يوريثان (10٪ من الجرعة الأولي) في حال الحيوان لا يصل عمق التخدير كافية أو كلما لاحظت تشنجات vibrissae أثناء التجربة.
- وضع الحيوان تخدير على الإطار التجسيمي مجهزة وسادة التدفئة، إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم والحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 ± 0.5 درجة مئوية بحلول وسادة التدفئة.
- ضخ 100 ميكرولتر 1٪ ليدوكائين (في كلوريد الصوديوم 0.9٪) تحت الجلد لتخدير موضعي في موقع العملية والانتظار 3-5 دقائق. إزالة الجلد تغطي سطح الجمجمة عن طريق خفض في الاتجاه الذيلية-إلى منقاري وتنظيف الأنسجة المتبقية.
- تنظيف الجمجمة على نطاق واسع مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم ومسحات ماصة.
- تحديد إحداثيات المنطقة المستهدفة على نصف الكرة المخية الأيسر (على القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1): 2.5 ملم و 5.5 ملم الخلفي الجانبي لbregma). وضع علامة على موقع على الجمجمة مع الجراحية علامة الجلد من ركلة جزاء.
- كشط العظام بلطف بواسطة حفر الأسنان من منطقة الفائدة حتى يصبح شفافا العظام والأوعية الدموية هي واضحة للعيان.
- جعل 0.5 مم × 0.5 مم حج القحف عن طريق خفض نافذة في الجمجمة ضعيفة مع مشرط (# 11)، وتجنب الأضرار التي لحقت الأم الجافيةوالأوعية الدموية. اختياري: علم على حواف حج القحف باستخدام الجراحية علامة الجلد القلم لتحسين الرؤية.
- تطبيق طبقة رقيقة من superglue على الجمجمة الجافة ثم الاسمنت الأسنان لبناء حمام (أي غرفة تسجيل) إحاطة حج القحف.
- تقليم شعيرات في الجانب المقابل لبالضبط 5 ملم من بصيلات الطولي. اختياري: تسليط الضوء على شعيرات قلص مع الماسكارا السوداء.
2. Juxtasomal تسجيلات وصفها Biocytin
- جعل ماصات التصحيح من الزجاج البورسليكات مع قطر الحافة داخل ~ 1 ميكرون للحصول على الأقطاب مع المقاومة MΩ 3-5. ملاحظة: مورفولوجيا ماصة مثالية لتسجيل juxtasomal هو تفتق تدريجي مرهف، زاوية المخروط منخفضة، و~ 1 ميكرون طرف (الشكل 1).
- اعتمادا على عمق تسجيل (مع الاحترام لسطح حنوني)، ينبغي تعديل أبعاد تفتق من القطب تسجيل. بالغ الأهمية هو أن روقال انه ينبغي أن يكون تفتق قطرها أقل من 75 ميكرون في نقطة الدخول في الدماغ لتجنب الأضرار الميكانيكية أو الإجهاد إلى منطقة التسجيل. هذا يدل على أن للتسجيلات القشرية سطحية، لا بد من تفتق من 300-500 ميكرون مع القطر الخارجي الحد الأقصى من 75 ميكرومتر (الشكل 1A) في حين التسجيلات من الطبقات القشرية العميقة نسبيا تتطلب تفتق أطول من 1،500-1،800 ميكرون، ومرة أخرى مع الخارجي القصوى قطر 75 ميكرومتر (ميكرون في 1،800 من طرف القطب).
- تحميل ماصة التصحيح مع الفئران العادية المسابقة (NRR) تستكمل مع 2٪ biocytin (انظر الجدول رقم 1 لإيجاد حلول والكواشف) وجبل ماصة التصحيح على مرحلة الرأس ثابت إلى مياداة مجهرية.
- تعيين زاوية حامل القطب إلى 34 درجة فيما يتعلق المستوى السهمي خصيصا لاستهداف العمود D2 من S1 الفئران.
- ربط رئيس لمرحلة مكبر للصوت في جسر وضع (أي المشبك الحالي).
- وضع التصحيحماصة على مقربة من حج القحف. ملء حوض الاستحمام مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتحديد المقاومة القطب الذي يجب أن يكون بين 3-5 MΩ وتقييمها عن طريق تطبيق نبض مربع مع الحقن الحالية إيجابية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف).
- إنشاء الضغط الزائد من 100-150 م بار، ودفع ماصة التصحيح في 1 ميكرومتر الخطوات أثناء تطبيق الحالية إيجابية البقول مربع (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). رصد تغير المقاومة القوية عند إنشاء اتصال مع الأم الجافية. عند هذه النقطة، تعيين إحداثيات مياداة مجهرية ل'صفر' للسماح للقياسات عمق دقيقة.
- التقدم في الخطوة 1 ميكرومتر الوضع حتى تخترق ماصة التصحيح الأم الجافية يتبين من انخفاض مفاجئ في مقاومة القطب. إزالة الضغط عقد ماصة.
- بحث عن وحدة واحدة في حين تتقدم في 1 ميكرومتر الخطوات. رصد المقاومة الكهربائي بشكل مستمر من خلال تطبيق 200 ميللي ثانية على / قبالة البقول. زيادة في القطب المقاومة typicحليف يشير إلى القرب من الخلايا العصبية واحدة. تقدم القطب حتى إمكانات العمل الإيجابي (ا ف ب) يتم تسجيل الطول الموجي من ~ 2 بالسيارات (أرقام 2A و 2B).
- اختياري: قم بتسجيل نمط ارتفاعه عفوية من الخلايا العصبية وتحديد ارتفاعه من قبل، على سبيل المثال، تشتيت نحو caudally شعيرات فردية ل200 ميللي ثانية في زاوية من 3.3 درجة باستخدام جهاز كهرضغطية 18-أثار ضئيلة للغاية.
- تقدم القطب حتى المقاومة 25-35 MΩ والمسامير لديهم سعة من 3-8 بالسيارات للحصول على ظروف مثلى من juxtasomal التعبئة. بدء ملء juxtasomal من خلال تطبيق نبضات مربع من الإيجابية الحالية (1 غ، 200 ميللي ثانية تشغيل / إيقاف). ببطء وتدريجيا يزيدون الكمية الحالية من خلال الخطوات من 0.1 غ في حين رصد الموجي AP وتردد (أرقام 2A و 2B).
- رصد افتتاح الغشاء كما زيادة واضحة في وتيرة AP أثناء مرحلة على من نبض كتلة (الشكل 2C (أرقام 2C و 2D). وتشمل معلمات إضافية زادت الضوضاء أو صغيرة (1-5 بالسيارات) سلبي DC التحول.
- زيادة أو نقصان الحالية (1 غ) في حين ملء للحفاظ على استقرار ضخ biocytin. خفض أو وقف نبضات الحالي على زيادة مفاجئة في وتيرة AP لتجنب السمية عن طريق تدفق الزائد من الأيونات خارج الخلية، مثل أيونات الصوديوم. ملاحظة: ستكون كل الخلايا العصبية تستجيب بشكل مختلف للحقن الحالية ووضع العلامات juxtasomal تحتاج المعلمات إلى تعديل تبعا لظروف التسجيل الفردية.
- عن كثب رصد إشارة بعد إيقاف الحقن الحالية. الموجي ارتفاع بعد جلسة ملء عادة ما يتم توسيع ويظهر انخفض بشدة بعد فرط الاستقطاب. انتظر استعادة الخلايا العصبية، والتي هي واضحة عندما يعود إلى خصائص ارتفاع الموجي الأصلي (أي وجودطبيعي بعد فرط الاستقطاب، الشكل 2).
- تكرار biocytin ملء جلسات بعد الشفاء الكامل من الخلايا العصبية لزيادة الحمل biocytin لتحسين جودة تلطيخ.
- سحب ماصة التصحيح في الخطوات من 1 ميكرون حتى يقلل من السعة ارتفاع للحد من أي إجهاد للخلية. الانتظار ما لا يقل عن 1 ساعة لbiocytin لنزع فتيل داخل الخلية بينما تراقب عن كثب درجة حرارة جسم الحيوان والتنفس.
3. Perfusing الحيوان وإزالة الدماغ
- إعداد الإعداد التروية، شطف، وتهيئة تحميلها على الأنابيب مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
- وضع الحيوان على صينية الجراحية وآمن مع الشريط وضع العلامات القياسية. ضمان عمق كاف من التخدير؛ قرصة القدم وردود الفعل جفن يجب أن يكون غائبا.
- جعل الإنسي إلى الوحشي شق (5-6 سم) من خلال جدار البطن فقط تحت القفص الصدري والمضي قدما في اتجاه الخلفي الأمامي لفضح القص.سحب القص الأمامية وفصل بعناية الكبد من الحجاب الحاجز.
- إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز، وقطع من خلال انخفاض أضلاعه ومواصلة شق على طول من تجويف البطن لفضح القلب.
- إزالة التأمور.
- إدراج الإبرة في البطين الأيسر وإجراء شق في الأذين الأيمن. يروي مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم (~ 8 مل / دقيقة) حتى إزالة اللون من الكبد كاملة.
- التبديل إلى ضخ بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حتى تصلب مخلب الجبهة والفك السفلي هو واضح.
- قطع رأس الفأر باستخدام زوج من مقص
- إزالة عضلات الرقبة المتبقية وفضح الجمجمة تماما.
- ضع مقص في جذع الدماغ على الجانب الظهري وقطع العظم بعناية على طول الدرز السهمي، والحفاظ على موقف الظهرية.
- إزالة العظام من كلا الجانبين من الدرز السهمي لفضح الدماغ باستخدام ملقط. إزالة الجافية بعناية لتجنب دamage.
- إدراج بعناية ملعقة حادة إلى الجانب البطنية من الدماغ وإزالة الدماغ بلطف.
- بعد إصلاح بين عشية وضحاها في الدماغ كله PFA في 4 درجات مئوية. التبديل الدماغ إلى 0.05 M العازلة الفوسفات (PB) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
4. تشريح الدماغ في أقسام تماسي
- اتخاذ الدماغ من 0.05 M PB ووضعها على ورقة الترشيح التي تواجه الأمامي. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع المخيخ على طول الطائرة الاكليلية وفصل نصفي الكرة الأرضية عن طريق خفض طول الطائرة منتصف السهمي.
- تطبيق superglue على منصة تصاعد وجبل نصف الكرة اليسار على المستوى السهمي مع الأمامية التي تواجه الحق. تأمين منصة متزايدة في زاوية من 45 درجة على vibratome ويغرق في الدماغ 0.05 M PB.
- تأمين شفرة حلاقة على vibratome وتأكد من أن أول اتصال مع سطح الدماغ في منتصف الطائرة الأمامي الخلفي من نصف الكرة الغربي. قطع 24 100 ميكرونأقسام وجمعها في لوحة 24 أيضا تحتوي على 0.05 M PB.
5. إجراءات النسيجية
- أداء بروتوكولات النسيجية لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز 24 و-البيوتين أفيدين طريقة البيروكسيداز وفقا للأساليب الموصوفة سابقا 25. اختياري: تصور biocytin باستخدام تقارن الفلورسنت أفيدين / streptavidin-اليكسا. وهذا يسمح بالإضافة المزدوج تلطيخ مع تقنيات تتبع إلى الوراء أو تقدمي.
- أقسام غسيل 5 × 5 دقائق مع 0.05 M PB وإعداد tetrahydrochloride 3،-3'-diaminobenzidine (DAB) التي تحتوي على حل لتلطيخ السيتوكروم أوكسيديز لتصور برميل في طبقة 4 (L4) من S1 (انظر الجدول 2 لحلول و الكواشف). احتضان أقسام 6-12 من الحنون في حل محمى لمدة 30-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- شطف المقاطع مع 0.05 M PB ل6 × 5 دقائق وإخماد النشاط البيروكسيديز الذاتية التي يحتضنها كل المقاطع في 3٪ H 2 2 في 0.05 م PB لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. احتضان المقاطع في ABC-الحل (انظر الجدول 3 لحلول والكواشف) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- شطف المقاطع مع 0.05 M PB لمدة 5 × 10 دقيقة، وإعداد حل DAB-لتصور الخلايا العصبية مليئة biocytin (انظر الجدول رقم 4 لحلول والكواشف). احتضان المقاطع في حل تصفيتها عن 45-60 دقيقة في RT.
- شطف المقاطع مع 0.05 M PB عن 5 × 10 دقيقة. أقسام جبل على الشرائح المجهر وغطاء قابل للانزلاق مع Mowiol (انظر الجدول 5 للحلول والكواشف).
- تحديد نوعية وضع العلامات باستخدام المجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معرفة تفصيلية على هيكل 3D من الخلايا العصبية الفردية هو أمر حاسم لتوضيح المبادئ التنظيمية للشبكات العصبية. يتضمن أسلوب لدينا خط أنابيب لتحقيق وضع العلامات biocytin جودة عالية من الإعداد في الجسم الحي، مما يتيح تصنيف الوظائف المخصصة الخلايا العصبية وإعادة الإعمار مفصلة من شجيري والهندسة المعمارية محور عصبي واحد من الخلايا العصبية في ارتفاع القرار. اعتمادا على نوعية وضع العلامات juxtasomal، يتم استرداد الخلايا العصبية مع مختلف DAB-كثافات تتراوح بين خافت لإشارات DAB مكثفة في المواقف التي تتوافق بشكل دقيق جدا إلى الموقع تسجيل 19،26. في مختبرنا، وتعمل على تدريب مجرب في معدل نجاح 30-40٪ في يوريثان القوارض مخدرة. هذا يدل على أن يتم تحديد الخلايا العصبية واحد لإعادة الإعمار شجيري ومحور عصبي في واحدة من ثلاث تجارب التي ثم يحقق المعايير التالية: 1) الخلايا العصبية واحد فقط شغل في الدماغ، 2) ذات نوعية ممتازة ووضع العلامات،3) إشارة biocytin هو ثابت على طول محور عصبي والتوقعات لا تنقص في النهايات البعيدة، 4) CYT C counterstaining ناجحا للسماح تسجيل العصبية، و5) لا الأضرار التي لحقت شرائح الدماغ خلال الأنسجة. العامل المحدد هو عادة غير كافية biocytin وضع العلامات، وهذا يعني أنه في ~ 80٪ من جميع التجارب (مخدرة و / أو مستيقظا)، سيتم استرداد الخلايا العصبية المسجلة (سوما والتشعبات). هذا يكفي لتصنيف نوع من الخلايا ولكن لا يمكن الاعتماد عليها لإعادة الإعمار والكامل للبنية محور عصبي. في الشكل 3، وتبين لنا مثالين من الخلايا العصبية التي تحمل علامات biocytin مع إشارة DAB بعد وضع العلامات juxtasomal المناسبة، واحد الخلايا العصبية الهرمية شائك (الشكل 3A) عصبون واحد (الشكل 3B). إعادة بناء أقسام عرضية المجاورة يسمح إعادة الإعمار المسلسل للحصول على كامل التشكل 18،22،23،27،28 العصبية. بالإضافة إلى ذلك، وتلطيخ النسيجية من الأطر المرجعية التشريحية (على سبيل المثال فيالقشرة الحسية الجسدية الأولية) يسمح بتسجيل الخلايا العصبية واحد لأطر مرجعية موحدة 4،19. المثالين المقدمة هنا تعكس الظروف المثلى لتصنيف وبعد ذلك إعادة بناء الخصائص المورفولوجية مع النظام اليدوي أو الآلي (الشكل 4) 15،20،29-31.
الشكل 1. خصائص الكهربائي لjuxtasomal biocytin وضع العلامات. (A) الكهربائي لتسجيل juxtasomal من الخلايا العصبية القشرية في عمق 300-500 ميكرون فيما يتعلق سطح حنوني. (B) الكهربائي لتسجيل juxtasomal من الخلايا العصبية القشرية في 1،500-1،800 ميكرومتر عمق التسجيل. لاحظ الفرق في طول تفتق بين فريقي (A) و (B). (
الشكل 2. الخصائص الكهربية خلال biocytin التعبئة. (A، B) لوحظ إمكانات العمل العفوي خلال تطبيق نبضات مربع (200 ميللي ثانية، تشغيل / إيقاف) مع الإيجابية الحالية ولكن مع عدم كفاية السعة لتحميل الخلايا العصبية مع biocytin. (C) زيادة السعة الحالية النتائج في افتتاح غشاء الخلايا العصبية مما يسمح biocytin التحميل وظاهرة للعيان في تتبع مثل مرحلة غير الساحلية انفجار ارتفاعه خلال س على مراحلو النبض. (D) والموجي ارتفاع خلال ملء يبين زيادة العرض وانخفاض بعد فرط الاستقطاب. يتم تطبيع ارتفاع السعة إلى ارتفاع السعة في B للمقارنة. (E، F) بعد الانتعاش ناجحة من الخلايا العصبية اللاحقة للدورة ملء يمكن ملاحظة ارتفاع العرض العادي والتردد. يتم تطبيع ارتفاع السعة إلى ارتفاع السعة في B للمقارنة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. وضع العلامات Biocytin-DAB من الخلايا العصبية في القشرة شغل juxtasomally الحسية الجسدية الأولية من الفئران يوريتان مخدرة. (A) الخلايا العصبية الهرمية في عرضيةالرأي. لاحظ الفرق بارزا في حجم قطرها من التشعبات والمحاوير. (B) عصبون سريعة ارتفاعه نظرا عرضية. ملاحظة بنية مطرز من التشعبات والمحاوير. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. إعادة الإعمار الرقمية من الخلايا العصبية المسماة juxtasomally. (A) الخلية العصبية صورة الإسقاط بدقة عالية (ولكن منخفضة التكبير) تم الحصول عليها من 100 ميكرون شريحة عرضية من طبقة الخلايا العصبية من الفئران 6 القشرة الحسية الجسدية الأولية باستخدام خط أنابيب التصوير شبه الآلي. (ب) نفس الصورة كما في (A) مع إعادة الإعمار الرقمية الآلي مضافين (محوار باللون الأزرق، الغصنITE باللون الأحمر، على التوالي). (C) مربع القوس من (B) بالتكبير لتوضيح موثوقية إعادة الإعمار محور عصبي باستخدام الوسم juxtasomal. لاحظ حبات محوار في جميع أنحاء طول محور عصبي؛ ويسلط الضوء على اثنين حبات من قبل السهام السوداء. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| ملي | ز / لتر | |
| 135 | كلوريد الصوديوم | 7.8894 |
| 5.4 | بوكل | 0.40257 |
| 1.8 | و CaCl | 0.26464 | |
| 1 | MgCl 2 | 0.2033 |
| 5 | HEPES | 1.1915 |
| ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم | ||
| إضافة 20 biocytin mg/ml-1 |
الجدول 1. الجرذ العادي قارع الأجراس تستكمل مع Biocytin.
| 8 ملغ | السيتوكروم C من القلب الفروسية |
| 8 ملغ | Catalasه من الكبد البقري |
| 265 ميكرولتر | 75 ملغ / مل DAB |
| تذوب في 40 مل 0.05M PB | |
| مرشح وسخن الحل عند 37 درجة مئوية | |
الجدول 2. حل لالسيتوكروم C أوكسيديز تلطيخ.
| 1 قطرة | كاشف A |
| 1 قطرة | كاشف B |
| 0.5 مل | 10٪ تريتون X100 |
| آيت = "21" على غرار = "الارتفاع: 21px؛"> حل في 9.5 مل 0.05M PB (45 دقيقة مقدما) | |
| إضافة 410 ميكرولتر حل / جيد | |
| بروتوكول للABC-حل واحد 24 لوحة جيدا. | |
الجدول 3. الحل مع Vectastain القياسية ABC-عدة.
| 265 ميكرولتر | 75 ملغ / مل DAB |
| 13.4 ميكرولتر | 30٪ H 2 O 2 |
الجدول 4. حل لتلطيخ DAB.
| 6 ز | الصف التحليلية الجلسرين |
| 2.4 ز | Mowiol 4-88 |
| يقلب 10 دقيقة لمعطف Mowiol مع الجلسرين يدويا | |
| 6 مل | المقطر H 2 O |
| احتضان عند RT لمدة 2 ساعة | |
| 12 مل | 0.2 M ثلاثيو درجة الحموضة 8.5 |
| احتضان في 50 درجة مئوية بالحمام المائي ل1HR - O / N، وإثارة أحيانا | |
| الطرد المركزي 15 دقيقة في 5،000 x ج، قسامة وتخزينها في -20 ° C | |
الجدول 5. Mowiol الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح أسلوب juxtasomal تسجيل في العمل فيفو ارتفاعه المحتملة من وحدات واحدة عبر الظروف السلوكية (تخدير، مستيقظا أو بحرية التحرك الثابت الرأس) مع خيار من الخلايا العصبية المسجلة لآخر مخصص نوع من الخلايا تصنيف و / أو إعادة الإعمار 3D-وصفها biocytin. والميزة الرئيسية هي الحصول على المعلمات الفسيولوجية في تكوين (وبالتالي موسع) خارج الخلية، ولكن أن تكون قادرة على تسمية الخلايا العصبية داخل الخلية مع biocytin 16،17،32. بالإضافة إلى biocytin وضع العلامات، وهذه التقنية يمكن استخدامها لحقن الخلايا العصبية مع DNA، RNA، البروتينات، أو الأصباغ الفلورية 33،34. العيب الأكثر وضوحا لهذا النهج هو ربما عدم وجود رقابة بصرية من نوعية وضع العلامات، وبالتالي أي وسيلة للتحقق من جودة وضع العلامات أثناء التجربة. ومع ذلك، ظروف التسجيل وبشكل خاص العمل شكل محتمل يمكن أن تستخدم لتقييم نجاح العملية ووضع العلامات. لإنستاالامتحانات التنافسية الوطنية، فإن احتمال استعادة الخلايا العصبية مع كثيفة التسمية biocytin-DAB يزيد عندما تردد ارتفاعه خلال البقول الحالي يزيد بشكل كبير، وترافق مع اختفاء ما بعد فرط الاستقطاب وتوسيع نطاق العمل الموجي المحتملة (انظر الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، يرتبط نوعية biocytin وضع العلامات مباشرة لطول لخص جلسات وضع العلامات منفصلة، بحيث عدة جلسات ملء طويلة (> 60 ثانية) سوف يؤدي إلى تحسين نوعية النسيجي مقارنة مع جلسة قصيرة ملء الفردية (<30 ثانية) . أخيرا، فإن الوقت للبقاء التتبع نشرها تحديد دقيق للكثافة وضع العلامات حجرات البعيدة. بشكل عام، والوقت بقاء 1 ساعة بعد عالية الجودة التثقيب الكهربائي يضمن وضع العلامات كافية من التوقعات طويلة المدى محور عصبي intracortical. أحد الأمثلة على هذه التوقعات طويلة المدى هي الخلايا العصبية من القشرة الحسية الجسدية الأولية لإسقاط القشرة الحسية الجسدية الثانوية أو dysgranularوبالتالي إسقاط المناطق إلى المناطق التي هي عدة مليمترات بعيدا عن موقع 4،20 وضع العلامات. عندما يتم التحقيق التوقعات محور عصبي من أبعاد أكبر (مثل التوقعات المهادي القشري)، ينبغي زيادة وقت البقاء على قيد الحياة 15. المهم هو أن ندرك التثقيب الكهربائي من الخلايا العصبية سيكون لها تأثير عميق على حالة فسيولوجية من الخلايا العصبية بسبب الإفراط في تدفق الصوديوم من المحلول الكهربائي. وبالتالي، فإنه يوصى بشدة أن تتداخل مع ملء الحلقات حلقة هادئة للسماح الشفاء التام من العمل ارتفاعه المحتملة، ورصد ظروف التسجيل بعد ملء جلسات عندما يسمح biocytin لنزع فتيل طول شجيري وarborizations محور عصبي 12،31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وauthros ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر الأستاذان. Huibert Mansvelder وبيرت Sakmann للحصول على دعم واسع النطاق، والدكتور مارسيل Oberlaender لإجراء مناقشات مثمرة وتوفير تتبع الخلايا العصبية، وبريندان ودر للحصول على المساعدة الفنية. تم الحصول على البيانات باستخدام ntrode السادس لابفيف، قدمت بسخاء من قبل R. برونو (جامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). وأيد هذا البحث من قبل جمعية ماكس بلانك ومركز العلوم العصبية الحاسوبية لبرنشتاين، توبنغن (بتمويل من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF؛ FKZ: 01GQ1002)) (RTN)، مركز البحوث وNeurogenomics المعرفي (CNCR) ، علم الأعصاب في الحرم الجامعي أمستردام (NCA)، التمويل لCPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 وENC-P3-# شبكة C3) وVU جامعة أمستردام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
