Summary
כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.
Abstract
קליפת המוח מאופיין במספר רב של שכבות והרבה תאים מסוגים שונים שיחד כרשת אחראים להרבה תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר כולל קבלת החלטות, התנהגות מודרכת חושית או זיכרון. כדי להבין כיצד רשתות עצביות סבוכות כזה לבצע משימות כאלה, בצעד מכריע הוא לקבוע את הפונקציה (או פעילות חשמלית) של סוגי תאים בודדים בתוך הרשת, מעדיף כאשר החיה היא ביצוע משימה קוגניטיבית רלוונטית. בנוסף, הוא חשוב באותה מידה כדי לקבוע את המבנה האנטומי של הרשת והארכיטקטורה מורפולוגי של נוירונים הבודדים כדי לאפשר להנדסה הפוכה הרשת בקליפת המוח. פריצות דרך טכניות הזמינים כיום מאפשרות הקלטת פעילות סלולרית בערים, מתנהגת בעלי חיים עם האפשרות היקר של פוסט הוק זיהוי נוירונים המוקלטים. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג biocytin juxtasomal, הכוללת potenti פעולת הקלטהאל יוצרות עלייה חד בתצורה (-התיקון רופף או) תאי באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית. תצורת הקלטת juxtasomal היא יציבה יחסית והחלים על פני תנאים התנהגותיים, הכולל הרדמה, תרופות הרגעה, קבוע בראש, ואפילו בערים בעלי החיים לנוע בחופשיות. לכן, שיטה זו מאפשרת קישור spiking פוטנציאל פעולת תאים מסוג מסוים בהתנהגות בעלי חיים לשחזור של נוירונים הבודדים וסופו של דבר, microcircuit קליפת המוח כולו. בכתב יד הסרטון הזה, אנו מראים כיצד יכולים להיות מתויגים נוירונים בודדים בתצורת juxtasomal עם biocytin בעכברים מורדם urethane לפוסט הוק זיהוי ושחזור מורפולוגיים.
Introduction
רשתות עצביות מורכבות של סוגי תאים מרובים, מאופיינים בתכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות מאוד ספציפיות 1-7. כתוצאה מכך, סוגי תאים בודדים לבצע משימות מיוחדות בתוך הרשת (ראה למשל Gentet et al. 8 וBurgalossi et al. 9). אנחנו רק מתחילים להבין פונקציות ספציפיות לסוג תא ברשתות עצביות ועוד ועדיין לא התגלה. לשם כך, במעבדות רבות ביישום גישות ניסיוניות המאפשרות הניתוח של מאפיינים צורניים של אותה האוכלוסייה העצבית שממנו הפרמטרים פיסיולוגיים התקבלו 1,10-15. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג juxtasomal 16,17 הכוללת קלטות אלקטרו באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית בתצורה תאית (ובכך פולשני) בשילוב עם electroporation של נוירון שהוקלט עם biocytin.יתרון עיקרי של גישה זו הוא שהטבע לא פולשנית מבטיח כי spiking פוטנציאל פעולה של נוירונים בודדים נרשם מבלי לשנות (למשל dialyzing) התוכן תאיים של התא. ואחריו electroporation, גישת juxtasomal מספקת את האפשרות של הודעה זיהוי תא הוק ושחזור לקשר תפקוד (פיזיולוגיה) למבנה (מורפולוגיה). בדרך כלל, שיקום מורפולוגיים כרוך שחזור של מורפולוגיה הדנדריטים ואקסון אשר יכול להתארך לכימות של צפיפות עמוד השדרה ו / או בוטון או אפילו שחזור של מורפולוגיה עצבית ברזולוציה ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקת הקלטת juxtasomal יכולה לשמש לin vivo הקלטות של תאים מסוגים שונים על פני שכבות בקליפת המוח או באזורים תת קליפת המוח במגוון של מינים, למרות שרוב המחקרים ליישם את הטכניקה במכרסמים קטנים כגון עכברים או חולדות. בהקלטת ותיוג נוירונים המחקר שלנו מתמקדמקליפה החושית העיקרית עכברוש (S1) וכרוך בזיהוי חזותי של נוירונים נרשמו 18, שחזורים דנדריטים בשילוב עם רישום מדויק במסגרת התייחסות אחידה ללהנדס לאחור רשתות קליפת המוח 4,19 ושחזור מפורט של אדריכלות אקסון לאפיין סוג התא ספציפי מקומי ותחזית לטווח ארוך מטרות 20.
בהשוואה לin vivo טכניקות חלופיות הקלטה (תאית או כל תא), הקלטות juxtasomal הן יציבים יחסית, ולכן יכולות להיות מיושמות על פני מדינות התנהגותיות כוללים 21,22 מורדם, מסוממת 14, בעלי חיים 23 אפילו באופן חופשי הנעים קבוע בראש, או ער 9 . כאן, אנו מציגים תיוג juxtasomal בS1 של עכברוש הרדים urethane, אם כי אנו מדגישים את תחולתה הכללית של טכניקה זו כדי הכנות רבות של בחירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת בעלי החיים
כל הליכי הניסוי מתבצעים בהתאם לחוק ההולנדי ולאחר הערכה על ידי ועדה אתית מקומית באוניברסיטת VU אוניברסיטת אמסטרדם, הולנד.
- הרדימי עכברוש Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) עם isoflurane (2-3% בחמצן) ולאחר מכן עם urethane (20% ב0.9% NaCl, 1.6-1.7 גר '/ קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ניטור נסיגת קמצוץ, רפלקסים עפעף, ותנועות vibrissae.
- לנהל מנה נוספת של urethane (10% ממינון ראשוני) במקרה של בעלי החיים לא מגיעים לעומק הרדמה מספיק או בכל פעם שפרכוסי vibrissae הם נצפו במהלך הניסוי.
- מניחים את החיה מורדמת במסגרת stereotaxic מצוידת בכרית חימום, הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי כרית חימום.
- הזרק 100 ידוקאין μl 1% (ב0.9% NaCl) תת עורי להרדמה מקומית באתר המבצע ולהמתין 3-5 דקות. הסר את העור המכסה את פני השטח של הגולגולת על ידי חיתוך בכיוון הזנב למקורי ולנקות את הרקמה שנותרה.
- נקה את הגולגולת באופן נרחב עם 0.9% NaCl ומטליות סופגים.
- לקבוע את הקואורדינטות של היעד באזור באונה השמאלית (לקליפת המוח העיקרי החושית (S1): 2.5 מ"מ האחורי ו5.5 מ"מ לרוחב גבחת). סמן את המיקום על הגולגולת עם עט סמן עור כירורגית.
- לגרד את העצם בעדינות על ידי מקדח שיניים מהאזור של עניין עד העצם הופך שקוף וכלי דם הם נראים בבירור.
- הפוך craniotomy x 0.5 מ"מ 0.5 מ"מ על ידי חיתוך חלון בגולגולת דליל עם אזמל (# 11), הימנעות מהפגיעה במאטר הדורהוכלי דם. אופציונאלי: לסמן את הקצוות של פתיחת הגולגולת באמצעות עט סמן עור כירורגית כדי לשפר את הנראות.
- למרוח שכבה דקה של דבק מגע בגולגולת היבשה ולאחר מכן מלט שיניים לבנות אמבטיה (כלומר תא הקלטת) התוחמת את פתיחת הגולגולת.
- חתוך את השפם בצד הנגדי ל5 מ"מ בדיוק מזקיק השערה. אופציונאלי: להדגיש את השפם הגזוז עם מסקרה השחור.
2. Juxtasomal הקלטות וסימון Biocytin
- הפוך טפטפות תיקון זכוכית ורוסיליקט עם קוטר קצה פנימי של 1 ~ מיקרומטר להשיג אלקטרודות עם 3-5 התנגדות MΩ. הערה: מורפולוגיה פיפטה האידיאלית להקלטת juxtasomal היא להתחדד הדרגתי דק, זווית קונוס נמוכה, ו~ 1 מיקרומטר קצה (איור 1).
- תלוי בעומק ההקלטה (לגבי שטח pial), הממדים להתחדד של האלקטרודה ההקלטה צריכים להיות מותאמים. חשוב באופן קריטי הוא לא כיהוא להתחדד קוטר צריך להיות פחות מ 75 מיקרומטר בנקודת הכניסה במוח כדי למנוע נזק או לחץ מכאניים לאזור ההקלטה. זה מצביע על כך להקלטות בקליפת המוח שטחיות, להתחדד של 300-500 מיקרומטר עם קוטר חיצוני של מקסימאלי 75 מיקרומטר נדרש (איור 1 א) ואילו הקלטות משכבות בקליפת המוח עמוקות יחסית דורשות להתחדד ארוך יותר של 1,500-1,800 מיקרומטר, שוב עם חיצוני מקסימאלי קוטר של 75 מיקרומטר (ב1,800 מיקרומטר מהקצה האלקטרודה).
- טען את פיפטה התיקון עם צלצול עכברים נורמלי (NRR) בתוספת biocytin 2% (ראה טבלת מס '1 לפתרונות וחומרים כימיים) והר פיפטה את התיקון על במה ראש הקבוע לmicromanipulator.
- להגדיר את הזווית של בעל אלקטרודה ל34 ° ביחס למישור הסגיטלי למקד את עמודת D2 של S1 העכברוש באופן ספציפי.
- חבר את שלב הראש למגבר בגשר במצב (כלומר, מהדק הנוכחי).
- מקם את התיקוןפיפטה בסמיכות לפתיחת הגולגולת. מלא את האמבטיה עם 0.9% NaCl ולקבוע את ההתנגדות האלקטרודה שאמורה להיות בין 3-5 MΩ, שהוערך על ידי החלת דופק מרובע עם הזרקה נוכחית חיובית (Na 1, 200 msec / כיבוי).
- להקים overpressure של 100-150 mbar ולקדם את פיפטה את התיקון ב1 מיקרומטר צעדים תוך יישום הנוכחי חיובי כמו פולסים מרובעים (Na 1, 200 msec / כיבוי). לפקח על שינוי ההתנגדות החזקה על הקמת קשר עם מאטר הדורה. בשלב זה, לקבוע את הקואורדינטות של micromanipulator 'אפס' כדי לאפשר עומק מדידות מדויקות.
- להתקדם בצעד 1 במצב מיקרומטר עד פיפטה את התיקון חודרת מאטר הדורה שצוינה על ידי ירידה פתאומית בהתנגדות האלקטרודה. הסר את הלחץ החזק של טפטפת.
- לחפש את יחידות בודדות, תוך קידום ב1 מיקרומטר צעדים. לפקח על התנגדות האלקטרודה ברציפות על ידי יישום 200 msec / כיבוי קטניות. עלייה בtypic התנגדות האלקטרודהברית מצביעה על קרבתו של נוירון בודד. לקדם את האלקטרודה עד פוטנציאל פעולה חיובית (AP) צורות גל של ~ 2 mV נרשמים (2A דמויות ו2B).
- אופציונאלי: הקלט את דפוס spiking הספונטני של תא העצב ולקבוע להתחדד על ידי, למשל, caudally להסיט שפם פרטני ל200 אלפית שניים בזווית של ° 3.3 באמצעות מכשיר פיזואלקטריים 18 עורר זיף.
- לקדם את האלקטרודה עד ההתנגדות היא 25-35 MΩ ויש לי קוצים אמפליטודות של 3-8 mV להשיג תנאים אופטימליים של מילוי juxtasomal. התחל מילוי juxtasomal ידי החלת פולסים מרובעים של חיובי הנוכחי (Na 1, 200 msec / כיבוי). להגדיל לאט ובהדרגה הנוכחית על ידי צעדים של 0.1 Na תוך ניטור צורת גל AP ותדירות (2A דמויות ו2B).
- לפקח על פתיחת הקרום כעלייה ברורה בתדירות AP במהלך השלב על דופק הבלוק (איור 2C 2C דמויות ו2D) מופחתים לאחר hyperpolarization. פרמטרים נוספים כוללים רעש מוגבר או שינוי DC שלילי קטן (1-5 mV).
- להגדיל או להקטין את הזרם (1 Na) בעת המילוי לשמור על עירוי biocytin יציב. להפחית או להפסיק את הפעימות הנוכחיות על עלייה פתאומית של תדירות AP, כדי למנוע הרעלה על ידי זרם עודף של יונים תאיים, כגון יוני נתרן. הערה: כל נוירון יגיב בצורה שונה להזרקה הנוכחית וjuxtasomal פרמטרים תיוג צריכים להיות מותאמים בהתאם לתנאי הקלטה בודדים.
- לעקוב מקרוב אחר האות לאחר הפסקת ההזרקה הנוכחית. גל העלייה החדה לאחר פגישת מילוי בדרך כלל הרחיב ומראה מופחתים מאוד לאחר hyperpolarization. לחכות להתאוששות של העצב, שהוא לכאורה כאשר גל ספייק חוזר למאפייניו המקוריים (כלומר נוכחות שלנורמלי, איור לאחר hyperpolarization 2).
- חזור biocytin מילוי מפגשים לאחר התאוששות של הנוירון מלא כדי להגדיל את עומס biocytin לאיכות צביעה משופרת.
- לחזור בי פיפטה את התיקון בצעדים של 1 מיקרומטר עד משרעת ספייק יורד כדי להפחית את כל לחץ מכאני לתא. לחכות שעה לפחות 1 לbiocytin לנטרל intracellularly תוך מעקב הדוק על טמפרטורת הגוף של החיה ונושמת.
3. מרוסס בעלי החיים והסרת המוח
- הכן את התקנת זלוף, לשטוף, ולטעון מראש צינורות עם 0.9% NaCl.
- מקם את החיה על מגש כירורגית ובטוח עם קלטת תיוג סטנדרטית. ודא עומק מספק של ההרדמה; קמצוץ רגל ורפלקסים עפעף צריך להיות נעדרים.
- הפוך המדיאלי לרוחב חתך (5-6 סנטימטר) בדופן הבטן מתחת לצלעות ולהמשיך בכיוון אחורי-קדמי על מנת לחשוף את עצם החזה.משוך את עצם החזה anteriorly ולהפריד בזהירות את הכבד מהסרעפת.
- לעשות חתך קטן בסרעפת, לחתוך דרך הצלעות התחתונות ולהמשיך את החתך לאורך כל אורכו של חלל הבטן כדי לחשוף את הלב.
- הסר את קרום הלב.
- הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ועושה חתך בעלייה הימנית. תנקב עם 0.9% NaCl (~ 8 מיליליטר / דקה) עד הדהייה של הכבד היא מוחלטת.
- לעבור העירוי לparaformaldehyde 4% (PFA) עד נוקשות של כפה קדמית ולסת תחתונה היא נראית לעין.
- לערוף את העכברוש באמצעות מספריים
- הסר את שרירי צוואר שנותרו ולחשוף את הגולגולת לחלוטין.
- מקם את המספריים בגזע המוח בצד הגבי ולחתוך את העצם בזהירות לאורך תפר sagittal, שמירה על מיקום הגב.
- הסר את העצמות משני צידי תפר sagittal לחשוף את המוח באמצעות מלקחיים. מוציא בזהירות את הדורה כדי למנוע דamage.
- בזהירות להכניס מרית קהה לצד הגחוני של המוח ולהסיר את המוח בעדינות.
- פוסט לתקן את כל לילה המוח בPFA ב 4 ° C. לעבור למוח 0.05 M חיץ פוספט (PB) ולאחסן ב 4 ° C.
4. חותך את המוח בסעיפי משיק
- קח את המוח של 0.05 M PB ולשים אותו על נייר סינון מול קדמי. השתמש בסכין גילוח חד לחתוך את המוח הקטן לאורך מטוס העטרה ולהפריד את האונות על ידי חיתוך לאורך המישור הסגיטלי האמצע.
- החל דבק מגע על פלטפורמת ההרכבה ולעלות את ההמיספרה השמאלית במישור הסגיטלי שלה עם קדמי פונה ימינה. אבטח את פלטפורמת ההרכבה בזווית של ° 45 על vibratome ולהטביע את המוח ב0.05 M PB.
- Secure סכין גילוח על vibratome ולוודא כי המגע הראשון עם משטח המוח הוא באמצע המטוס הקדמי, אחורי של האונה. חותכים 24 100 מיקרומטרחלקים ולאסוף אותם בצלחת 24 גם מכילה 0.05 M PB.
5. נהלים היסטולוגית
- בצע פרוטוקולים היסטולוגית לצביעת ציטוכרום אוקסידאז 24 ו- ביוטין-peroxidase avidin השיטה על פי שיטות שתוארו קודם לכן 25. אופציונאלי: לדמיין biocytin באמצעות conjugates avidin הניאון / streptavidin-Alexa. זה בנוסף מאפשר כפול מכתים עם טכניקות מעקב מדרדר או אנטרוגרדית.
- חלקים לשטוף דקות 5 X 5 עם 0.05 M PB ולהכין tetrahydrochloride 3,-3'-diaminobenzidine (DAB) המכיל פתרון לצביעת ציטוכרום אוקסידאז לדמיין חביות בשכבה 4 (L4) של S1 (ראה טבלה 2 לפתרונות ו ריאגנטים). דגירה סעיפי 6-12 מפיא בפתרון שחומם מראש למשך 30-45 דקות ב37 ° C.
- יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל6 x 5 דקות ולהרוות את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים כל הסעיפים ב3% H 2 2 ב0.05 M PB ל20 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
- יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. דגירה סעיפים בABC-פתרון (ראה טבלה 3 עבור פתרונות וחומרים כימיים) הלילה ב 4 ° C.
- יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות ולהכין DAB-הפתרון כדי להמחיש את הנוירון מלא biocytin (ראה טבלה 4 לפתרונות וחומרים כימיים). דגירה סעיפים בפתרון מסונן ל45-60 דקות ב RT.
- יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. חלקי הר בשקופיות מיקרוסקופ ולהחליק לכסות עם Mowiol (ראה טבלה 5 לפתרונות וחומרים כימיים).
- לקבוע את איכות תיוג באמצעות מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ידע מפורט על מבנה 3D של נוירונים בודדים הוא חיוני להבהרת עקרונות ארגוניים של רשתות עצביות. השיטה שלנו כרוכה בצינור כדי להשיג תיוג biocytin באיכות גבוהה מהכנת in vivo, ובכך לאפשר סיווג post hoc עצבי ושחזור מפורט של הדנדריטים ואדריכלות אקסון של נוירונים בודדים ברזולוציה גבוהה. תלוי באיכות של תיוג juxtasomal, הנוירונים הם התאוששו עם DAB-עוצמות שונות הנעות בין קלוש לאותות DAB אינטנסיביים בעמדות שמאוד מדויק מתאימות למיקום ההקלטה 19.26. במעבדה שלנו, הנסיין מיומן פועל בהצלחה בשיעור של 30-40% במכרסמים מורדמים urethane. זה מצביע על כך נוירון אחד נבחר לשיקום הדנדריטים ואקסון באחד מתוך שלושה ניסויים אשר לאחר מכן עומד בקריטריונים הבאים: 1) רק נוירון אחד מילא את המוח, 2) איכות תיוג מצוינת,3) אות biocytin היא קבועה לאורך תחזיות אקסון ואינו פוחתת בסופים הדיסטלי, 4) counterstaining CYT C הוא מוצלח כדי לאפשר רישום עצבי, ו5) אין נזק לפרוסות מוח בהיסטולוגיה. הגורם המגביל הוא בדרך כלל תיוג biocytin מספיק, כלומר ב~ 80% מכל הניסויים (מורדם ו / או ער), נוירון שנרשם יהיה התאושש (סומה ודנדריטים). זה מספיק לסיווג סוג התא, אך לא לבנייה מחדש אמינה ומלאה של ארכיטקטורת אקסון. באיור 3, אנו מראים שתי דוגמאות של נוירונים שכותרת biocytin עם אות DAB לאחר תיוג juxtasomal המתאים; נוירון אחד פירמידה קוצנית (איור 3 א) וinterneuron אחד (איור 3 ב). בנייה מחדש של חלקים משיקים סמוכים מאפשרת שחזור סידורי להשיג 18,22,23,27,28 מורפולוגיה עצביות מלאים. בנוסף, צביעה היסטולוגית של מסגרות התייחסות אנטומיים (למשל בקליפה החושית העיקרית) מאפשרת רישום נוירונים בודדים למסגרות התייחסות סטנדרטיות 4,19. שתי דוגמאות שהובאו כאן משקפות את תנאים אופטימליים כדי לסווג ולאחר מכן לשחזר את המאפיינים מורפולוגיים עם מערכת ידנית או אוטומטי (איור 4) 15,20,29-31.
איור 1. מאפייני אלקטרודה לjuxtasomal biocytin תיוג. () אלקטרודה להקלטת juxtasomal של נוירונים בקליפת המוח בעומק מיקרומטר 300-500 ביחס לשטח pial. (ב) אלקטרודה להקלטת juxtasomal של נוירונים בקליפת המוח בעומק 1,500-1,800 הקלטת מיקרומטר. שים לב להיבדל באורך להתחדד בין הפנלים (א) ו (ב). (
איור 2. מאפייני אלקטרו במהלך מילוי biocytin. (A, B) פוטנציאל פעולה ספונטני הם נצפו במהלך היישום של פולסים מרובעים (200 msec, on / off) עם זרם חיובי, אך עם משרעת מספיק כדי לטעון את נוירון עם biocytin. (ג) הגדלת תוצאות משרעת הנוכחיות בפתיחה של הקרום העצבי המאפשר biocytin טעינה, גלוי בזכר כפרץ-יוצרות עלייה חדה של שלב נעול במהלך o בשלבf הדופק. (ד) צורת גל ספייק במהלך מילוי תערוכות רוחב הגדיל והקטין לאחר hyperpolarization. המשרעת ספייק היא מנורמל לספייק משרעת בB לצורך ההשוואה. (E, F) לאחר שחזור מוצלח של הנוירון לאחר פגישת המילוי ניתן לצפות רוחב ספייק רגיל ותדירות. המשרעת ספייק היא מנורמל לספייק משרעת בB להשוואה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תיוג Biocytin-DAB מתא עצב מילא juxtasomally בקליפה החושית העיקרית של חולדות מורדמות urethane. () נוירון פירמידלי במשיקתצוגה. שים לב להיבדל הבולט בגודל קוטר של דנדריטים ואקסונים. (ב) interneuron המהיר spiking בתצוגה משיקה. שים לב למבנה חרוזים של דנדריטים ואקסונים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. שחזור דיגיטלי של נוירון שכותרת juxtasomally. (א) תמונת Neuron הקרנה ברזולוציה גבוהה (אך בהגדלה נמוכה) המתקבל מ100 מיקרומטר הפרוסה משיקה של שכבת 6 נוירון של קליפה החושית העיקרית עכברוש באמצעות צינור הדמיה חצי אוטומטי. (ב) אותה תמונה כמו ב (א) עם שחזור דיגיטלי אוטומטי מעולף (האקסון בכחול, dendrITE באדום, בהתאמה). (ג) תיבת Bracket מ( ב ') זנקה בלהמחיש אמינות של שיקום אקסון באמצעות תיוג juxtasomal. הערה boutons האקסון לאורך כל אורכו של האקסון; שני boutons מודגשים על ידי חצים שחורים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| מ"מ | גר '/ ליטר | |
| 135 | NaCl | 7.8894 |
| 5.4 | KCl | .40257 |
| 1.8 | CaCl | .26464 | |
| 1 | MgCl 2 | .2033 |
| 5 | HEPES | 1.1915 |
| התאם ל-pH 7.2 עם NaOH | ||
| הוסף 20 biocytin mg/ml-1 |
טבלת 1. רגיל העכברוש רינגר בתוספת Biocytin.
| 8 מ"ג | ציטוכרום C מלב סוסים |
| 8 מ"ג | Catalasדואר מכבד שור |
| 265 μl | 75 מ"ג / מיליליטר DAB |
| ממיסים ב40 מיליליטר 0.05M PB | |
| פתרון סינון ומחמם על 37 מעלות צלזיוס | |
טבלה 2. פתרון עבור מכתים מונואמין ציטוכרום C.
| 1 טיפה | מגיב |
| 1 טיפה | מגיב ב ' |
| 0.5 מיליליטר | 10% X100 טריטון |
| ight = בסגנון "21" = "גובה: 21px;"> ממיסים ב9.5 מיליליטר PB 0.05M (45 דקות מראש) | |
| הוספת פתרון μl 410 / טוב | |
| פרוטוקול עבור ABC-פתרון לצלחת 24 גם אחד. | |
לוח 3. פתרון עם ABC-ערכה סטנדרטית Vectastain.
| 265 μl | 75 מ"ג / מיליליטר DAB |
| 13.4 μl | 30% H 2 O 2 |
לוח 4. פתרון עבור מכתים DAB.
| 6 גרם | גליצרול כיתה אנליטית |
| 2.4 גרם | Mowiol 4-88 |
| ידני מערבבים 10 דקות למעייל Mowiol עם גליצרול | |
| 6 מיליליטר | H 2 O מזוקק |
| לדגור על RT במשך שעה 2 | |
| 12 מיליליטר | 0.2 M Triה-pH של 8.5 |
| דגירה בwaterbath 50 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות - O / N, מערבב מדי פעם | |
| צנטריפוגה 15 דקות ב 5,000 XG, aliquot ולאחסן ב -20 ° C | |
לוח 5. פתרון Mowiol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת juxtasomal מאפשרת הקלטה בspiking פוטנציאל פעולת vivo מיחידות בודדות על פני תנאים התנהגותיים (בהרדמה, ער או באופן חופשי לנוע קבוע בראש) עם האפשרות של נוירון שנרשם לפוסט סיווג סוג תא הוק ו / או שחזור 3D תיוג-biocytin. היתרון העיקרי הוא להשיג פרמטרים פיסיולוגיים בתצורה תאית (ובכך לא פולשנית), ובכל זאת להיות מסוגלת לתייג נוירון intracellularly עם biocytin 16,17,32. בנוסף לbiocytin תיוג, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי להזריק נוירונים עם DNA, RNA, חלבונים, או צבעי ניאון 33,34. החסרון הבולט ביותר של גישה זו הוא אולי חוסר השליטה ויזואלית של איכות התיוג, ולכן אין אמצעי בקרת איכות התיוג במהלך הניסוי. עם זאת, ניתן להשתמש בתנאי הקלטה ובמיוחד צורת פוטנציאל פעולה על מנת להעריך את ההצלחה של הליך התיוג. עבור instance, הסבירות מתאושש נוירון עם תווית biocytin-DAB צפוף מגבירה כאשר תדירות spiking בפולסים הנוכחי מגדילה באופן דרמטי, מלווה עם היעלמותו של לאחר hyperpolarization ורחבה של צורת גל פוטנציאל הפעולה (ראה איור 2). בנוסף, איכות biocytin תיוג היא בקורלציה ישירה לאורך סיכם של הפעלות תיוג נפרדות, כך שפגישות כמה זמן מילוי (> 60 שניות) תגרום איכות היסטולוגית טובה יותר בהשוואה למפגש בודד קצר מילוי (<30 שניות) . לבסוף, זמן ההישרדות לדיפוזיה נותב יהיה ביקורתי לקבוע את עוצמת התיוג של תאי דיסטלי. באופן כללי, זמן הישרדות של 1 שעות לאחר electroporation באיכות גבוהה מבטיח תיוג מספק של תחזיות axonal intracortical ארוך טווח. אחת דוגמאות לתחזיות ארוך טווח כאלה הן נוירונים מקליפה החושית העיקרית מקרינים לקליפה החושית משני או dysgranularאזורים ובכך מקרינים לאזורים שהם כמה מילימטרים מ4,20 אתר תיוג. כאשר תחזיות axonal של ממדים גדולים עוד יותר נחקרות (כגון תחזיות thalamocortical), זמן הישרדות צריך להיות מוגבר 15. חשוב להבין הוא שelectroporation של נוירון יהיה השפעה עמוקה על מצבו הפיזיולוגי של הנוירון בשל זרם נתרן מוגזם מפתרון האלקטרודה. לכן, מומלץ מאוד להתערבב מילוי פרקים עם פרקים שקטים כדי לאפשר התאוששות מלאה של spiking פוטנציאל הפעולה ומעקב אחר תנאי הקלטה לאחר מילוי מפגשים כאשר biocytin מותר מפוזר לאורך הדנדריטים וarborizations אקסון 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי authros אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לפרופ. Huibert Mansvelder וברט Sakmann לתמיכה נרחבת, ד"ר מרסל Oberlaender לדיונים פוריים ומתן מעקב עצבי, וברנדן Lodder לקבלת סיוע טכני. הנתונים נרכשו באמצעות ntrode השישי לLabView, סיפק בנדיבות על ידי ר 'ברונו (קולומביה Univ., ניו יורק, ארה"ב). מחקר זה נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק והמרכז ברנשטיין לחישובית Neuroscience, טובינגן (ממומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), מרכז לNeurogenomics ומחקר קוגניטיבי (CNCR) , מדעי המוח הקמפוס אמסטרדם (NCA), מימון לCPJdK (NWO-alw # 822.02.013 ו# p3-C3 ENC-רשת) וVU באוניברסיטת אמסטרדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
