Summary
Nöronal ağların yapısını anlamak için, bireysel nöronların fonksiyonel ve morfolojik karakterizasyon bir zorunluluktur. Burada, juxtasomal biocytin dışı yapılandırmada elektrofizyolojik kayıtları etiketleme izin verir, ama hücre içi dendritik ve aksonal mimari post hoc yeniden için nöron etiket yeteneğini muhafaza göstermektedir.
Abstract
Beyin korteksi, birlikte bir ağ olarak karar verme, duyusal kılavuzlu davranış veya bellek dahil olmak üzere birçok yüksek bilişsel işlevler sorumludur çok katmanlı ve çok farklı hücre tipleri ile karakterize edilir. Böyle karmaşık nöronal ağlar gibi görevleri gerçekleştirmek nasıl anlamak için, çok önemli bir adımdır hayvan ilgili bir bilişsel görevi gerçekleştirirken zaman tercihen, ağ içinde tek tek hücre tiplerinin işlevini (veya elektriksel aktiviteyi) belirlemektir. Ayrıca, ters kortikal ağını sağlamak için bireysel nöronların ağ ve morfolojik mimarisinin anatomik yapısını belirlemek için eşit derecede önemlidir. Bugün mevcut teknik atılımlar kaydedildi nöronları belirlenmesi post hoc değerli seçeneği ile hayvanlar davranmak, uyanık hücresel aktiviteyi kayıt izin. Burada, biz kayıt eylem potenti içerir juxtasomal biocytin etiketleme tekniği, göstermekal geleneksel yama pipetler kullanılarak dışı (ya da gevşek-yama) konfigürasyonunda spike. Juxtasomal Kayıt konfigürasyon, anestezi sedasyon, uyanık kafa sabit, ve hatta serbestçe hareket hayvanda dahil, davranışsal koşulları karşısında nispeten istikrarlı ve uygulanabilir. Bu yüzden, bu yöntem, bireysel nöronlar ve sonuçta, tüm kortikal mikrodevre yeniden hayvan davranış sırasında hücre tipi özel aksiyon potansiyeli çapalama bağlama sağlar. Bu Video yazıda, juxtasomal yapılandırmada bireysel nöronların post hoc tanımlanması ve morfolojik yeniden inşası için üretan-anestezi sıçan biocytin ile etiketlenmiş nasıl göstermektedir.
Introduction
Nöronal ağ oldukça spesifik morfolojik ve fizyolojik özellikleri 1-7, özelliği çok sayıda hücre türleri, oluşur. Bunun bir sonucu olarak, tek tek hücre tipleri (bakınız örneğin Gentet et al. 8 ve Burgalossi et al. 9) ağ içinde özel görevleri yerine getirir. Biz sadece nöronal ağlarda hücre tipine özel işlevleri anlamaya başlıyor ve çok keşfedilmeyi hala. Bu amaçla, çok sayıda laboratuarlar fizyolojik parametre 1,10-15 elde edilmiş olan aynı nöronal nüfusun morfolojik özelliklerinin analizine izin deneysel yaklaşımlar uygulamaktadır. Burada, biocytin ile kaydedilen nöronun elektroporasyon ile kombinasyon halinde hücre dışı (böylece invazif olmayan) bir yapılandırmada geleneksel kumanda pipetler kullanılarak elektrofizyolojik kayıtları içerir juxtasomal etiketleme tekniği 16,17 gösterir.Bu yaklaşımın önemli bir avantajı, invaziv olmayan doğası tek nöronların aksiyon potansiyeli spike (örneğin diyaliz) hücrenin hücre içeriği değiştirmeden kaydedilir sağlar olmasıdır. Elektroporasyon ardından, juxtasomal yaklaşım yapısı (morfoloji) fonksiyonu (fizyoloji) bağlamak için post hoc hücre tanımlaması ve rekonstrüksiyon seçeneği sağlar. Tipik olarak, morfolojik yeniden omurga ve / veya bouton yoğunlukları miktarının veya elektron mikroskobu kullanılarak nm çözünürlükte nöronal morfoloji da yeniden genişletilebilir dendritik ve aksonal morfolojisi yeniden içerir. Çalışmaların çoğu, örneğin, fare ya da sıçan gibi küçük kemirgenlerde tekniği uygulanır olmasına rağmen juxtasomal kayıt tekniği, kortikal katmanları arasında türler ya da bir dizi alt kortikal bölgelerinde çeşitli hücre tiplerinin in vivo kayıtları için kullanılabilir. Bizim araştırma nöronlar kayıt ve etiketleme odaklanmıştırsıçan primer somatosensori korteks (S1) dan ve kayıtlı nöronların 18 görsel bir kimlik içerir, standart bir referans çerçevesi içinde kesin kayıt ile kombinasyon dendritik rekonstrüksiyonlar hücre tipine özel yerel karakterize etmek için kortikal ağları 4,19 ve aksonal mimarisi ayrıntılı yeniden tersine mühendislik ve uzun menzilli projeksiyon 20. hedefliyor.
Uyanık baş sabit 23, ya da serbest hareket eden hayvanlar 9, alternatif bir in vivo kayıt teknikleri (hücre içi ya da bütün hücre) ile karşılaştırıldığında, juxtasomal kayıtları nispeten kararlı olan ve bu yüzden anestezi 21,22 dahil olmak üzere davranış eyalette uygulanabilir, 14, sedasyon . Biz seçim birçok preparatlar için bu tekniğin genel uygulanabilirliğe vurgulamak rağmen Burada, bir üretan ile anestezi uygulanmış sıçan S1 juxtasomal etiketleme göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Animal hazırlanması
Tüm deneysel prosedürleri VU Üniversitesi Amsterdam, Hollanda'da yerel etik komite tarafından Hollanda yasaları uyarınca ve değerlendirilmesinden sonra yapılır.
- Intraperitoneal enjeksiyon ile (% 0.9 NaCI, 1.6-1.7 g / kg 'de% 20) üretan ile izofluran (oksijen içinde% 2-3) ile ve daha sonra bir Wistar sıçan (P25-P45, ♂ / ♀) anestezisi. Tutam çekilmesi, göz kapağı refleksleri ve burun kılı hareketlerini izleyerek anestezi derinliğini değerlendirin.
- Halinde üretan ek bir doz (başlangıç dozunun% 10) yönetmek hayvanın yeterli anestezi derinliği ulaşamazsa ya da burun kılı twitches deney süresince gözlenir zaman.
- Bir ısıtma yastığı ile donatılmış stereotaksik çerçeve üzerine anestezi hayvan koyun, rektal sıcaklık probu eklemek ve bir ısıtma yastığı ile 37.5 ± 0.5 ° C 'de, hayvanın vücut ısısını korumak.
- Operasyon yerinde lokal anestezi için 100 ul% 1 lidokain, deri altı (% 0.9 NaCl) enjekte edilir ve 3-5 dakika bekleyin. Kuyruk-to-rostral yönde keserek kafatası yüzeyi kaplayan deri çıkarın ve geri kalan doku temizleyin.
- % 0.9 NaCl ve emici bezlerden ile yoğun kafatası temizleyin.
- (: 2.5 mm posterior ve bregmaya yanal 5,5 mm birincil somatosensoriyel korteks (S1)) sol yarımkürede hedef alan koordinatlarını belirlemek. Bir cerrahi cilt marker kalem ile kafatası üzerinde konumunu işaretlemek.
- Kemik şeffaf hale gelir ve kan damarları açıkça görülebilir kadar ilgi bölgesinden bir diş matkap yavaşça kemik kazıyın.
- Dura mater zarar kaçınarak, bir neşter (# 11) ile inceltilmiş kafatasında bir pencere keserek 0.5 mm x 0.5 mm kraniotomiye olunve kan damarları. İsteğe bağlı: görünürlüğünü artırmak için cerrahi bir cilt işaretleyici kalem kullanılarak kraniotomi kenarlarını işaretleyin.
- Kraniotomi kuşatan bir banyo (yani kayıt odası) oluşturmak için kuru kafatası ve daha sonra diş çimento üzerinde superglue ince bir tabaka uygulayın.
- Bıyık folikül tam 5 mm kontralateral tarafta bıyıkları kırpmak. İsteğe bağlı: siyah maskara ile kesilmiş bıyıkları vurgulayın.
2. Juxtasomal Kayıtlar ve Biocytin Etiketleme
- 3-5 MQ direnci ile elektrotlar elde etmek ~ 1 mikron iç ucu çapı ile borosilikat cam yama pipetler olun. Not: juxtasomal kayıt için ideal bir pipet morfoloji kademeli sivrilik, düşük koni açısı ve bir ~ 1 mikron ucu (Şekil 1).
- (Pial yüzeyine göre) kayıt derinliğine bağlı olarak, kayıt elektrot şev boyutları ayarlanmalıdır. Önem bu to çap kayıt alanının mekanik hasar veya stresi önlemek için beyinde giriş noktada en az 75 mikron olmalıdır konik. Nispeten derin kortikal katmanları kayıtları maksimum dış yine, 1,500-1,800 um daha uzun bir konik gerektirir ise bu yüzeysel kortikal kayıtları için, maksimum 75 um'lik bir dış çapı 300-500 um'lik bir şev (Şekil 1A) gerekli olduğunu gösterir (elektrot ucundan 1.800 mikron olarak) 75 mikron çapı.
- Normal sıçan zil (NRR) ile yama pipet yükleyin 2% biocytin ile desteklenmiş (çözümleri ve reaktifler için bakınız Tablo 1) ve bir micromanipulator sabit bir kafa sahnede yama pipet montaj.
- Özellikle sıçan S1 D2 sütun hedeflemek için sagital düzleme göre 34 ° 'ye kadar, elektrot tutucu açısını ayarlayın.
- Köprü modunda bir amplifikatör (yani şimdiki kelepçe) için kafa sahne bağlayın.
- Yama yerleştirinkraniotomi yakın pipetle. % 0.9 NaCl ile banyo doldurmak ve pozitif akım enjeksiyon (1 nA, on / off 200 msn) ile bir kare darbe uygulayarak değerlendirilen 3-5 MQ arasında olmalıdır elektrot direncini belirlemek.
- Kare bakliyat (1 nA, on / off 200 msn) gibi pozitif akımı uygulanması sırasında 100-150 mbar aşırı basınç kurmak ve 1 mikron adımlarla yama pipet ilerlemek. Dura mater ile temas kurarak üzerine sağlam direnç değişimi izleyin. Bu noktada, doğru derinlik ölçümü izin vermek için "sıfır" için mikromanipülatör koordinatlarını ayarlayın.
- Yama pipet elektrot direnci ani bir düşüş ile gösterilen dura mater girinceye kadar 1 mikron adım modunda ilerlemek. Pipet tutma basıncını çıkarın.
- 1 mikron adımlarla ilerleyen süre tek birimler arayın. / Kapama bakliyat 200 msn'den uygulayarak sürekli elektrot direnci izleyin. Elektrot direnci Typic bir artışmüttefiki tek bir nöron yakınlığını gösterir. Pozitif hareket potansiyelini (AP) ~ 2 mV dalga formu (Şekil 2A ve 2B) kaydedilir kadar elektrodu ilerletin.
- İsteğe bağlı: nöronun kendiliğinden engelleyici desen kaydedin ve tespit bıyık-uyarılmış kaudal bir piezoelektrik cihaz 18 kullanılarak 3.3 ° 'lik bir açı ile 200 msn için ayrı bir bıyık saptırma, örneğin, ile spike.
- Direnci 25-35 MQ ve sivri juxtasomal dolum en uygun koşulları elde etmek için 3-8 mV'luk genlikleri kadar elektrot ilerlemek. Pozitif akım (1 nA, on / off 200 msn) kare bakliyat uygulayarak juxtasomal dolum başlatın. AP dalga biçimi ve frekans (Şekil 2A ve 2B) ve izleme sırasında yavaş yavaş yavaş 0.1 nA aşamaları mevcut artar.
- Blok darbesi (Şekil 2C-on aşamasında AP frekans belirgin bir artış gibi, zar açıklığı Monitör (Şekiller 2C ve 2D) göstermektedir. Ek parametreler artan gürültü ya da bir küçük (1-5 mV) negatif DC vardiya içerir.
- Artırın veya stabil biocytin infüzyon korumak için dolum esnasında (1 nA) akımı azalır. Azaltmak veya sodyum iyonları gibi iyonların hücre dışı, aşırı akışı ile toksisite önlemek için AP frekans ani artışı üzerine akım darbeleri durdurun. Not: Her nöron etiketleme parametreleri ayrı kayıt koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekir akım enjeksiyon ve juxtasomal farklı yanıt olacaktır.
- Yakından mevcut enjeksiyon durdurduktan sonra sinyalini izlemek. Bir dolum oturumundan sonra başak dalga genellikle genişletmiş ve güçlü bir hiperpolarizasyonuna sonra azalır gösterir. Başak dalga (orijinal özelliklerine yani varlığını döndüğünde açıktır nöron, kurtarılması için bekleyinNormal sonrası hiperpolarizasyonuna, Şekil 2).
- Gelişmiş boyama kalitesi için biocytin yükünü artırmak için nöron tam iyileşme sonra oturumları doldurarak biocytin tekrarlayın.
- Başak genlik hücreye herhangi bir mekanik stresi azaltmak düşene kadar 1 mikron adımlarla yama pipet geri çekin. Yakından ilgili hayvanın vücut sıcaklığının izlenmesi ve solunum sırasında hücre yayılması için biocytin için en az 1 saat bekleyin.
3. Hayvan perfüze ve Beyin Çıkarma
- , Perfüzyon kurulum hazırlayın durulayın, ve% 0.9 NaCl ile boru preload.
- Cerrahi bir tepsi üzerinde hayvan yerleştirin ve standart etiketleme bant ile sabitleyin. Anestezi yeterli derinliği sağlamak; ayak tutam ve göz kapağı refleksleri olmalıdır.
- Sadece göğüs kafesinin altında karın duvarından kesi (5-6 cm) yanal ve sternum maruz posterior-anterior yönde devam etmek için bir orta yapmak.Öne sternum çekin ve dikkatlice diyaframdan karaciğer ayrı.
- Alt kaburga kesti diyafram küçük bir kesi, yapın ve kalp açığa çıkarmak için karın boşluğunun tüm uzunluğu boyunca kesik devam etmektedir.
- Perikard çıkarın.
- Sol ventrikül içine iğne takın ve sağ atrium bir kesi yapmak. Karaciğer soldurması tamamlanana kadar% 0.9 NaCl (~ 8 ml / dak) ile serpmek.
- Ön ayaklarında tutukluk kadar% 4 paraformaldehid (PFA) için infüzyon geçin ve alt çene belirgindir.
- Bir makas kullanılarak sıçan başını kesmek
- Kalan boyun kaslarını kaldırmak ve tamamen kafatası maruz.
- Sırt tarafında beyin sapındaki makas yerleştirin ve dorsal konumunu koruyarak, sagital sütür boyunca dikkatle kemiği kesti.
- Forseps kullanarak beyin maruz sutur iki taraftan kemikleri çıkarın. Dikkatle d önlemek için dura kaldırmakermeden.
- Dikkatli beynin ventral tarafında künt spatula yerleştirin ve yavaşça beyin kaldırmak.
- 4 ° C'de PFA tüm beyin gecede Post-fix 0.05 M fosfat tampon maddesi (PB) için beyin geçiş ve 4 ° C'de saklayın
4. Teğet bölümlerinde Beyin dilimleme
- 0.05 M PB dışında beyin almak ve anterior bakan bir filtre kağıdı üzerine koydu. Koronal düzlem boyunca beyincik kesti ve orta sagital düzlemi boyunca keserek yarımküresini ayırmak için keskin bir jilet kullanın.
- Montaj platformda superglue uygulayın ve ön sağ bakan ile sagital düzlemde sol yarımkürede monte edin. Bir vibratome üzerinde 45 ° 'lik bir açı ile monte platformu elde edin ve 0.05 M PB beyin daldırın.
- Vibratome bir jilet güvenli ve beyin yüzeyi ile ilk temas yarımkürenin ön-arka düzlemin ortasında olduğundan emin olun. 24 100 mikron kestibölümleri ve 0.05 M PB ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içinde toplarlar.
5. Histolojik Prosedürleri
- Daha önce tarif edilen yöntemlere uygun olarak 25, sitokrom oksidaz boyama 24 ve avidin-biotin-peroksidaz yöntemi için histolojik protokolleri gerçekleştirir. İsteğe bağlı: floresan avidin / streptavidin-Alexa birleşimleri kullanılarak biocytin görselleştirmek. Bu ayrıca retrograd veya antegrad izleme teknikleri ile çift boyanmasını sağlar.
- 0.05 M PB ve 3-3'-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) çözümleri için bakınız Tablo 2 (katman 4 S1 (L4) in varil görselleştirmek üzere, sitokrom oksidaz boyanması için çözelti içeren hazırlanması ile yıkayın bölümleri 5 x 5 dakika reaktif). 37 ° C de 30-45 dakika için önceden ısıtılmış çözeltide pia kesitler 6-12 inkübe
- 6 x 5 dakika süreyle 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve% 3 H 2'deki tüm bölümleri inkübe edilerek bir endojen peroksidaz etkinliğini gidermek 2.
- 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. 4 ° C de bir gece (çözümler ve reaktifler için bakınız Tablo 3) ABC-çözeltisi içinde bölümleri inkübe
- 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın ve (çözümleri ve reaktifler için Tablo 4) biocytin doldurulmuş nöron görselleştirmek için DAB-solüsyon hazırlanır. Oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca filtre edilmiş çözelti içinde bölümleri inkübe edin.
- 5 x 10 dakika için 0.05 M PB bölümleri ile yıkayın. Mikroskop slaytlar ve Mowiol ile kapak kayma (çözümleri ve reaktifler için bkz. Tablo 5) Mount bölümleri.
- Işık mikroskobu kullanılarak etiketleme kalitesini belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bireysel nöronların 3D yapısı hakkında detaylı bilgi nöronal ağların örgütsel ilkelerini aydınlatılması için çok önemlidir. Bizim yöntem ve böylece post hoc nöronal sınıflandırma ve dendritik ve yüksek çözünürlükte tek nöronların aksonal mimarisinin ayrıntılı yeniden izin, in vivo hazırlanmasında yüksek kaliteli biocytin etiketleme elde etmek için bir boru hattı içerir. Juxtasomal etiketleme kalitesine bağlı olarak, nöronlar soluk çok doğru bir şekilde kayıt konumu 19,26 uygun pozisyonlarda yoğun DAB sinyaller arasında farklı DAB-yoğunlukları ile elde edilir. Laboratuvarda, eğitimli bir deneyci üretan anestezisi kemirgenlerde% 30-40 arasında bir başarı oranı ile çalışmaktadır. , Beyin, 2) mükemmel etiketleme kalitede doldurulur 1) sadece tek bir nöron: Bu bir nöron sonra aşağıdaki kriterleri karşılayan her üç deneylerde dendritik ve aksonal yeniden inşası için seçili olduğunu gösterir3) biocytin sinyal aksonal projeksiyonlar boyunca sabit olduğunu ve 4) Cyt C counterstaining nöronal kayıt izin başarılı, distal uçlarında azaltmak ve histoloji sırasında beyin dilimleri 5) hiçbir zarar vermez. Sınırlayıcı faktör tüm deneyler (anestezi ve / veya uyanık)% 80 ~, kaydedilen nöron (soma ve dendritler) kurtarılmış olacak yani, genellikle yetersiz biocytin etiketleme. Bu hücre tipi sınıflandırma için değil, aksonal mimari güvenilir ve tam bir yeniden yapılanma için yeterlidir. Bir dikenli piramidal nöron (Şekil 3A) ve bir interneuron (Şekil 3B), Şekil 3'te, uygun juxtasomal etiketleme sonra DAB sinyali ile biocytin etiketli nöronların iki örneğini göstermektedir. Komşu teğet bölümlerin İmar tam nöronal morfoloji 18,22,23,27,28 elde seri yeniden sağlar. Örneğin anatomik referans çerçeveleri Ayrıca, histolojik boyama (inbirincil somatosensoriyel korteks) standart referans çerçeveleri 4,19 tek nöronları kayıt sağlar. Burada sunulan iki örnek sınıflandırmak ve daha sonra manuel veya otomatik sistemi ile morfolojik özellikleri (Şekil 4) 15,20,29-31 yeniden optimal koşulları yansıtmaktadır.
Etiketleme biocytin juxtasomal Şekil 1. Elektrot özellikleri. (A) pial yüzeyine göre 300-500 um derinlikte kortikal nöronların juxtasomal kayıt için elektrot. (B) 1,500-1,800 mikron kayıt derinlikte kortikal nöronların juxtasomal kayıt için elektrot. Panel (A) ve (B) arasındaki konik uzunluk farkı dikkat edin. (
Şekil 2. Biocytin dolumu sırasında elektrofizyolojik özellikleri. (A, B) Spontan aksiyon potansiyelleri biocytin ile nöron yüklemek için pozitif akım ile (on / off 200 msn) kare darbeleri uygulama sırasında ancak yetersiz genlik ile gözlenir. (C) izin nöronal membran açıklığında mevcut genlik sonuçları Artan biocytin-yükleme, on-faz o sırasında faz-kilitli çoğuşma çivilenmesi olarak iz görünürf darbe. (D) dolumu sırasında başak dalga artmış genişliğini gösterir ve hiperpolarizasyonuna sonra azalır. Başak genlik karşılaştırma için B genlik spike normalleştirilmiştir. Normal bir başak genişlik ve frekans gözlemlenebilir dolum oturumuna sonraki nöron başarı elde edildikten sonra (E, F). Spike genlik karşılaştırma için B genliği başak normalize edilmektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Üretan anestezisi sıçan birincil somatosensoriyel korteks juxtasomally dolu nöronlardan Biocytin-DAB etiketleme. Teğet (A) piramidal nörongörünümü. Dendritler ve akson çapı boyutu önemli farka dikkat edin. Teğet görünümünde (B) Hızlı çivileme interneuron. Dendritler ve akson boncuklu yapısını unutmayın. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Juxtasomally etiketli nöron Şekil 4.. Dijital rekonstrüksiyon. (A) Nöron projeksiyon, yüksek çözünürlükte görüntü (ama düşük büyütme) yarı-otomatik görüntüleme boru hattı kullanılarak sıçan birincil somatosensoriyel korteks tabakası 6 nöronun 100 mikron teğet dilim elde. (B) otomatik dijital rekonstrüksiyonu ile (A) olarak aynı görüntü mavi, dendr yılında (akson bindirilmiş) sırasıyla, kırmızı ite. (B), (C) Tutucu kutu juxtasomal etiketleme kullanarak aksonal yeniden güvenilirliğini göstermek için yakınlaştırılmış. Akson uzunluğu boyunca akson BOUTONS unutmayın; iki boutons siyah oklarla vurgulanır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
| mM | g / lt | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaC | 0,26464 | |
| 1 | MgCI2 | 0,2033 |
| 5 | Hepes | 1,1915 |
| NaOH ile pH'ı 7.2 'ye ayarlayın | ||
| 20 mg/ml-1 biocytin ekle |
Tablo 1. Normal Rat Ringer Biocytin ile desteklenmiş.
| 8 mg | At kalp sitokrom C |
| 8 mg | Catalassığır karaciğer e |
| 265 ul | 75 mg / ml DAB |
| 40 ml 0.05 M PB içerisinde çözülür | |
| 37 ° C'de filtre ve ön ısıtma çözelti | |
Tablo 2. Sitokrom C oksidaz boyanması için çözümü.
| 1 damla | Reaktif A |
| 1 damla | Reaktif B |
| 0.5 mi | % 10 Triton X100 |
| uş = "21" style = "height: 21px;"> 9.5 ml 0.05 M PB içinde eritin (önceden 45 dk) | |
| 410 ul çözeltisi ekleyin / göz | |
| Bir 24-delikli plaka için ABC çözeltisi için protokol. | |
Tablo 3. Vectastain standart ABC-kiti ile çözüm.
| 265 ul | 75 mg / ml DAB |
| 13.4 ul | 30% H, 2 O 2 |
Tablo 4. DAB boyama için çözüm.
| 6 g | Analitik dereceli gliserol |
| 2.4 g | Mowiol 4-88 |
| El gliserol ile kat Mowiol 10 dakika karışmaya | |
| 6 mi | Damıtılmış H2O |
| 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe | |
| 12 mi | 0.2 M Tris pH 8.5 |
| 1 saat boyunca 50 ° C su banyosu içinde inkübe edin - O / N, zaman karışması | |
| -20 ° C'de 5,000 xg, kısım ve mağaza santrifüj 15 dk | |
Tablo 5. Mowiol çözeltisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Juxtasomal yöntem davranışsal koşulları karşısında tek birimlerden vivo aksiyon potansiyeli çivilenmesi kayıt sağlar (anestezi, uyanık baş-sabit veya serbestçe hareket) biocytin-etiketleme post hoc hücre tipi sınıflandırma ve / veya 3D rekonstrüksiyon için kaydedilen nöron seçeneği ile. Büyük avantajı dışı (böylece noninvaziv) yapılandırmada fizyolojik parametrelerini elde etmek için, henüz biocytin 16,17,32 ile hücre nöron etiketlemek edememek. Etiketleme biocytin ek olarak, bu teknik, DNA, RNA, protein ya da floresan boyalar ile 33,34 nöronlar enjekte etmek için kullanılabilir. Bu yaklaşımın en belirgin dezavantajı etiketleme kalitesinin görsel kontrol belki eksikliği ve deney sırasında etiketleme kalitesini kontrol etmek ve böylece herhangi bir araçtır. Bununla birlikte, kayıt koşulları ve özellikle aksiyon potansiyeli şekil etiketleme işleminin başarısını değerlendirmek için de kullanılabilir. Insta içinakım darbeleri sırasında spike frekans önemli ölçüde artar nce, yoğun biocytin-DAB etiketi olan bir nöron geri kazanılması olasılığı sonrası aşırı kutuplaşması aksiyon potansiyeli dalga biçiminin ve genişleme (bkz. Şekil 2) kaybolması ile birlikte artar. Buna ek olarak, biocytin-etiketleme kalitesini doğrudan birkaç uzun dolgu seans (> 60 saniye), bir bireysel kısa doldurma oturum (<30 saniye) ile karşılaştırıldığında daha iyi histolojik kalitesi neden olur ki bu, ayrı bir etiketleme oturumların özetlenebilir uzunluğuna korelasyon . Son olarak, izleyici difüzyon için sağkalım süresi eleştirel uzak bölmelerin etiketleme yoğunluğunu belirleyecektir. Genel olarak, yüksek kaliteli elektroporasyon sonra 1 saat hayatta kalma süresi uzun menzilli intrakortikal aksonal projeksiyonlar yeterli etiketleme sağlar. Bu tür uzun menzilli projeksiyonlar bir örnek ikincil Somatosensory korteks veya dysgranular projelendirme birincil somatosensoriyel korteks nöronlarbölgeler böylece birkaç milimetre uzaklıkta etiketleme sitesi 4,20 den alanlarda projelendirme. Daha büyük boyutlarda aksonal çıkıntılar (örneğin talamokortikal çıkıntılar gibi) incelendiğinde, hayatta kalma süresi 15 arttırılmalıdır. Gerçekleştirmek için önemli nöronun elektroporasyon nedeniyle elektrot çözüm aşırı sodyum akını nöronun fizyolojik durumuna üzerinde büyük bir etkiye sahip olmasıdır. Bu nedenle, son derece aksiyon potansiyeli çivilenmesi tam iyileşme sağlamak için sakin bölüm ile bölüm doldurma ve biocytin dendritik ve aksonal arborizations 12,31 boyunca yayılmaya izin verildiğinde oturumları doldurduktan sonra kayıt şartlarının izlenmesi içe tavsiye edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Authros ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Profs teşekkür etmek istiyorum. Kapsamlı destek için Huibert Mansvelder ve Bert Sakmann, verimli tartışmalar ve teknik yardım için nöronal izleme ve Brendan Lodder sağlamak için Dr Marcel Oberlaender. Veri cömertçe R. Bruno (Columbia Üniv., NY, ABD) tarafından sağlanan LabView için ntrode VI, kullanılarak elde edilmiştir. Bu araştırma Max Planck Derneği ve Hesaplamalı Sinirbilim, Tübingen için Bernstein Merkezi tarafından desteklenmiştir (Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (Bmbf tarafından finanse; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Neurogenomics ve Bilişsel Araştırma Merkezi (CNCR) , Neuroscience Kampüs Amsterdam (NKA), CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 ve ENC-Ağ # p3-c3) ve VU Üniversitesi Amsterdam fon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
