Summary
For å forstå strukturen av nevrale nettverk, er funksjonelle og morfologiske karakterisering av individuelle nevroner en nødvendighet. Her viser vi juxtasomal biocytin merking, noe som gjør at elektrofysiologiske opptak i den ekstracellulære konfigurasjon, men har likevel beholdt evnen til intracellulært merke nervecellen for post hoc rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal arkitektur.
Abstract
Hjernebarken er preget av flere lag og mange forskjellige celletyper som sammen som et nettverk er ansvarlig for mange høyere kognitive funksjoner, inkludert beslutningstaking, sensorisk-guidet atferd eller minne. For å forstå hvordan slike intrikate nevrale nettverk utføre slike oppgaver, er et viktig skritt for å bestemme funksjonen (eller elektriske aktivitet) av enkelte celletyper i nettverket, fortrinnsvis når dyret utfører en relevant kognitiv oppgave. I tillegg er det like viktig å fastslå den anatomiske strukturen i nettverket og den morfologiske arkitekturen i de enkelte nerveceller til å tillate reverse engineering kortikale nettverk. Tekniske gjennombrudd tilgjengelig i dag la innspillingen cellulær aktivitet i våken, oppfører dyr med verdifull mulighet for post hoc identifisere de registrerte nevroner. Her demonstrerer vi juxtasomal biocytin merking teknikk, som innebærer innspilling handling potenal spiking i den ekstracellulære (eller løs-patch) konfigurasjon ved hjelp av konvensjonelle patch pipetter. Den juxtasomal opptaksoppsettet er relativt stabil og gjelder på tvers av atferdsvilkår, herunder bedøvet, bedøvet, våken head-fast, og selv i fritt bevegelige dyr. Dermed gir denne metoden knytte celle-type spesifikke aksjonspotensial spiking under dyrs atferd til gjenoppbygging av de enkelte nevroner og til slutt, hele kortikale mikrokretsen. I denne videoen manuskript, viser vi hvordan enkelte nevroner i juxtasomal konfigurasjon kan merkes med biocytin i uretan-bedøvet rotte for post hoc identifisering og morfologisk rekonstruksjon.
Introduction
Nevrale nettverk består av flere celletyper, karakterisert ved en svært spesifikke morfologiske og fysiologiske egenskaper 1-7. Som en konsekvens av de enkelte celletyper utføre spesielle oppgaver innenfor nettverket (se f.eks Gentet et al. 8 og Burgalossi et al. 9). Vi er bare begynnelsen for å forstå celletypespesifikke funksjoner på tvers av nevrale nettverk og mye er fortsatt å bli oppdaget. For å oppnå dette, er mange laboratorier implementere eksperimentelle tilnærminger som tillater analyse av morfologiske egenskaper av samme neuronal populasjon som fysiologiske parametere er blitt oppnådd 1,10-15. Her demonstrerer vi juxtasomal merking teknikk 16,17 som innebærer elektrofysiologiske opptak ved hjelp av konvensjonelle patch pipetter i den ekstracellulære (altså ikke-invasiv) konfigurasjon i kombinasjon med elektroporering av den innspilte nevron med biocytin. Denstor fordel ved denne tilnærmingen er at den ikke-invasiv karakter sikrer at aksjonspotensial spiking av individuelle nevroner er ført uten å forandre (f.eks dialysering) det intracellulære innholdet av cellen. Etterfulgt av elektroporering, gir juxtasomal tilnærming muligheten av post hoc cellen identifisering og gjenoppbygging å knytte funksjon (fysiologi) til struktur (morfologi). Vanligvis innebærer morfologiske rekonstruksjon rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal morfologi som kan utvides til kvantifisering av rygg-og / eller Bouton tettheter eller rekonstruksjon av neuronal morfologi ved nanometer oppløsning ved hjelp av elektronmikroskopi. Den juxtasomal opptaksteknikk kan benyttes til in vivo opptak av forskjellige celle-typer på tvers av kortikale lag eller i sub-kortikal områder av forskjellig art, selv om de fleste studier har anvendt teknikk i små gnagere som mus eller rotter. Vår forskning er fokusert på innspillingen og merking nevronerfra rotte primære somatosensoriske cortex (S1) og innebærer visuell identifisering av innspilte nevroner 18, til dendrittiske rekonstruksjoner i kombinasjon med presis registrering i et standardisert referanseramme reverse engineering kortikale nettverk 4,19 og detaljert rekonstruksjon av aksonal arkitektur for å karakterisere celletype-spesifikke lokale og langtrekkende projeksjon mål 20.
Sammenlignet med alternative in vivo opptaksteknikker (intracellulære eller hel-celle), juxtasomal opptakene er relativt stabil, og kan derfor brukes på tvers av atferds stater inkludert bedøvet 21,22, bedøvet 14, våken head-fast 23, eller til og med fritt-bevegelige dyr 9 . Her viser vi juxtasomal merking i S1 av en uretan-bedøvet rotte, selv om vi understreke den generelle anvendelsen av denne teknikken til mange forberedelser av valg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Animal
Alle eksperimentelle prosedyrer er utført i samsvar med nederlandsk lov og etter evaluering av en lokal etisk komité ved VU University Amsterdam, Nederland.
- Anesthetize en Wistar-rotte (P25-P45, ♂ / ♀) med isofluran (2-3% i oksygen) og deretter med uretan (20% i 0,9% NaCl, 1,6 til 1,7 g / kg) ved intraperitonal injeksjon. Vurdere dybden av anestesi ved å overvåke klype tilbaketrekking, øyelokk reflekser, og vibrissae bevegelser.
- Administrer en ytterligere dose med uretan (10% av initial dose) i tilfelle dyret ikke komme tilstrekkelig anestesidybden, eller når vibrissae rykninger blir observert i løpet av eksperimentet.
- Plasser bedøves dyret på stereotaxic rammen er utstyrt med en varmepute, sett rektal temperaturprobe og opprettholde dyrets kroppstemperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C ved en varmepute.
- Injiser 100 pl 1% lidokain (i 0,9% NaCl) subkutant i lokalbedøvelse i operasjonsområdet, og vente 3-5 min. Fjern huden som dekker overflaten av kraniet ved å kutte i caudal til rostral retning og rense det gjenværende vev.
- Rengjør skallen mye med 0,9% NaCl og absorberende kompresser.
- Bestem koordinatene til målområdet på venstre hemisfære (for primær somatosensoriske cortex (S1): 2.5 mm posterior og 5,5 mm lateral til bregma). Merk av plasseringen på skallen med en kirurgisk hud tusj.
- Skrap av beinet forsiktig av en dental drill fra regionen av interesse før benet blir gjennomsiktig og blodkar er klart synlig.
- Lag en 0,5 mm x 0,5 mm craniotomy ved å kutte et vindu i tynnet skallen med en skalpell (# 11), unngå skade på dura materog blodkar. Valgfritt: markere kantene på kraniotomi ved hjelp av en kirurgisk hud tusj for å bedre sikten.
- Påfør et tynt lag med superlim på den tørre hodeskallen og deretter dental sement for å bygge et bad (dvs. opptak kammer) omslutter kraniotomi.
- Trim værhårene på motsatt side til nøyaktig 5 mm fra værhåret hårsekken. Valgfritt: markere trimmet værhår med svart mascara.
2. Juxtasomal Recordings og Biocytin Merking
- Gjør patch pipetter av borsilikatglass med innvendig spissen diameter på ~ 1 mikrometer å få elektroder med 3-5 MΩ motstand. Merk: En ideell pipette morfologi for juxtasomal opptak er en gradvis slank konus, en lav kjeglevinkel, og en ~ 1 mikrometer spiss (figur 1).
- Avhengig av opptaksdybden (i forhold til den pial overflaten), bør de koniske dimensjoner av opptaks elektrode justeres. Kritisk viktig er at than taper diameter bør være mindre enn 75 mikrometer ved inngangspunktet i hjernen for å unngå skade på mekaniske eller stress til opptaksområdet. Dette indikerer at for overfladiske kortikale opptak, en avsmalning på 300 til 500 mikrometer med en ytre diameter på maksimalt 75 mikrometer kreves (figur 1A), mens opptak fra relativt dype kortikale lag krever en lengre avsmalning av 1,500-1,800 pm, igjen med maksimal utvendig diameter på 75 mikrometer (ved 1800 mikrometer fra elektrodespissen).
- Last inn lappen pipette med normal rotte ringetone (NRR) supplert med 2% biocytin (se tabell 1 for løsninger og reagenser) og monter patch pipetten på et hode scene festet til en micromanipulator.
- Sett vinkel på elektrodeholderen til 34 ° med hensyn til den sagittale plan for å spesifikt målrette D2 kolonne av rotte S1.
- Koble hodet scenen til en forsterker i bridge-modus (dvs. strømtang).
- Plasser lappenpipette i umiddelbar nærhet til kraniotomi. Fyll badekaret med 0,9% NaCl og bestemme elektrode motstand som bør være mellom 3-5 MΩ, vurderes ved å bruke en firkant puls med positiv strøm injeksjon (1 nA, 200 msek på / av).
- Etablere overtrykk på 100-150 mbar og avansere lappen pipetten i en mikrometer trinn mens søknad positiv strøm som firkantede pulser (1 Na, 200 msek på / av). Overvåk robust motstand endring ved å etablere kontakt med dura mater. På dette punktet, sette koordinatene mikromanipluatoren til "null" for å tillate nøyaktige dybdemålinger.
- Advance in 1 mikrometer trinn-modus inntil plasteret pipette penetrerer dura mater indikert ved et plutselig fall i elektrodemotstand. Fjern holdetrykket av pipetten.
- Søk etter enkle enheter mens fremme i en mikrometer trinn. Overvåke elektrodemotstand kontinuerlig ved å bruke 200 msek på / av pulser. En økning i elektrodemotstand typically angir nærhet av en enkelt neuron. Advance elektroden inntil positiv aksjonspotensial (AP) bølgeformene fra ~ 2 mV blir registrert (figurene 2A og 2B).
- Valgfritt: Spill spontan spiking mønster av nervecellen og bestemme værhår-fremkalt spiking av, for eksempel, caudally avlede individuelle værhår for 200 msek i en vinkel på 3,3 ° ved hjelp av et piezoelektrisk enhet 18.
- Advance elektroden til motstanden er 25-35 MΩ og pigger har amplituder av 3-8 mV for å få optimale forhold for juxtasomal fylling. Start juxtasomal fylling ved å bruke firkant pulser av positiv strøm (1 nA, 200 msek på / av). Sakte og gradvis øke den nåværende trinn på 0,1 nA mens overvåking av AP bølgeform og frekvens (Tall 2A og 2B).
- Overvåk membranåpningen som en klar økning i AP-frekvens under den fase av blokken pulsen (fig. 2C (Tall 2C og 2D). Andre parametere inkluderer økt støy eller en liten (1-5 mV) negative DC skift.
- Øk eller reduser strøm (1 nA) mens fylling å opprettholde stabil biocytin infusjon. Redusere eller stoppe de aktuelle pulser ved plutselig økning av AP-frekvens for å unngå forgiftning av overskytende strøm av ekstracellulære ioner, slik som natrium-ioner. Merk: Hver nervecelle vil reagere forskjellig på dagens injeksjon og juxtasomal merking parametere må justeres avhengig av individuelle opptaksforhold.
- Nøye overvåke signalet etter å stoppe den nåværende injeksjon. Den pigg bølgeform etter en fylling økten er vanligvis utvidet og viser et sterkt redusert etter hyperpolarization. Vent til gjenoppretting av nervecellen, som er tydelig når spike-kurven vender tilbake til sine opprinnelige egenskaper (dvs. tilstedeværelse avnormalt etter-hyperpolarisering, figur 2).
- Gjenta biocytin fylle økter etter fullstendig gjenoppretting av nervecellen til å øke biocytin belastning for forbedret farging kvalitet.
- Trekk lappen pipetten i trinn på 1 mikrometer til pigg amplitude reduseres for å redusere mekanisk stress til cellen. Vent minst en time for biocytin til diffuse intracellulært mens tett oppfølging dyrets kroppstemperatur og puste.
Tre. Perfusjon av husdyr-og Fjerne Brain
- Forbered perfusjon setup, skyll, og preload slangen med 0,9% NaCl.
- Plasser dyret på en kirurgisk skuffen og fest med standard merking tape. Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi; foten klype og øyelokk reflekser skal være fraværende.
- Lag en medial til lateral snitt (5-6 cm) gjennom bukveggen rett under brystkassen og fortsett i posterior-anterior retning å utsette sternum.Trekk sternum anteriorly og nøye skille leveren fra mellomgulvet.
- Lag et lite innsnitt i membranen, skjære gjennom de nedre ribber og fortsette snittet langs hele lengden av bukhulen for å blottlegge hjertet.
- Fjern hjerteposen.
- Stikk nålen inn i venstre hjertekammer og lage et snitt i høyre forkammer. Perfuse med 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) inntil decoloration av leveren er fullført.
- Slå infusjon til 4% Paraformaldehyde (PFA) til stivhet foran labben og underkjeven er åpenbar.
- Halshogge rotte ved hjelp av en saks
- Fjern de resternakkemusklene og avsløre skallen helt.
- Plasser saksen i hjernestammen på ryggsiden og kuttet benet nøye langs den sagittale sutur, under opprettholdelse av dorsal posisjon.
- Fjern benene på begge sider av sagittal sutur for å eksponere i hjernen ved hjelp av tang. Fjern forsiktig dura å unngå dAmage.
- Sett forsiktig en sløv slikkepott til ventral side av hjernen og fjerne hjernen forsiktig.
- Post-fikse hele hjernen overnatter i PFA ved 4 ° C. Slå hjernen til 0,05 M fosfatbuffer (PB), og lagre ved 4 ° C.
4. Slicing Brain i Tangentielle Seksjoner
- Ta hjernen ut av 0,05 M PB og sette den på et filterpapir vendt anterior. Bruk en skarp barberblad for å kutte av lillehjernen langs koronale flyet og skille halvkuler ved å kutte langs midten sagittalplan.
- Påfør superlim på monteringsplattform og montere venstre halvkule på sin sagittalplan med anterior mot høyre. Fest monteringsplattformen ved en vinkel på 45 ° på en vibratome og senk hjernen i 0,05 M PB.
- Sikre et barberblad på vibratome og sørge for at den første kontakten med hjernens overflate er i midten av anterior-posterior planet av halvkulen. Skjær 24 100 mikrometerseksjoner og samle dem i en 24-brønns plate inneholdende 0,05 M PB.
5. Histologiske Prosedyrer
- Utfør histologiske protokoller for cytokrom oksidase farging 24 og avidin-biotin-peroksidase-metoden i henhold til tidligere beskrevne fremgangsmåter for 25. Valgfritt: visual biocytin bruker fluorescerende avidin / streptavidin-Alexa konjugater. Dette gjør i tillegg dobbel-farging med retrograd eller anterograd tracing teknikker.
- Vasking deler 5 x 5 min med 0,05 M PB og forberede 3, 3'-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB)-inneholdende løsning for cytokrom oksidase beising for å visualisere fat i sjikt 4 (L4) av S1 (se tabell 2 for løsninger og reagenser). Inkuber seksjoner 6-12 fra den pia i det forvarmede løsning i 30-45 min ved 37 ° C.
- Skyll seksjoner med 0,05 M PB for 6 x 5 min og slukke endogen peroksidase-aktivitet ved å inkubere alle seksjoner i 3% H 2 2 i 0,05 M PB i 20 min ved romtemperatur (RT).
- Skyll seksjoner med 0,05 M PB for 5 x 10 min. Inkuber seksjoner i ABC-løsning (se tabell 3 for løsninger og reagenser) over natten ved 4 ° C.
- Skyll seksjoner med 0,05 M PB for 5 x 10 min og forberede DAB-løsning for å visualisere biocytin fylte nevron (se tabell 4 for løsninger og reagenser). Inkuber seksjoner i filtrerte løsning for 45 til 60 min ved RT.
- Skyll seksjoner med 0,05 M PB for 5 x 10 min. Mount seksjoner på objektglass og dekkglass med Mowiol (se tabell 5 for løsninger og reagenser).
- Bestem merking kvalitet ved hjelp av lysmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljert kunnskap om 3D-struktur av individuelle nevroner er avgjørende for å belyse organisatoriske prinsipper for nevrale nettverk. Vår metode innebærer en rørledning for å oppnå høy kvalitet biocytin merking fra en in vivo forberedelse, og dermed lar post hoc nevronale klassifisering og detaljert rekonstruksjon av dendrittiske og aksonal arkitektur av enkeltnerveceller i høy oppløsning. Avhengig av kvaliteten av juxtasomal merking, blir neuroner utvinnes med forskjellige DAB-intensiteter som strekker seg fra svak til intense DAB-signaler i posisjonene som meget nøyaktig svarer til opptaks plassering 19,26. I vårt laboratorium, driver en utdannet eksperimentator på en suksess-rate på 30-40% i uretan bedøvede gnagere. Dette indikerer at en neuron er valgt for dendrittiske og aksonal gjenoppbygging i en av tre eksperimenter som deretter oppfyller de følgende kriterier: 1) bare en neuron fylt i hjernen, 2) utmerket merking kvalitet,3) biocytin signalet er konstant langs aksonale projeksjoner, og reduseres ikke i det distale avslutninger, 4) Cyt C kontrafarging er vellykket for å tillate neuronal registrering og 5) ingen skade på hjernesnitt ved histologi. Den begrensende faktoren er vanligvis utilstrekkelig biocytin merking, noe som betyr at i ~ 80% av alle eksperimenter (bedøvede og / eller våken), vil den innspilte nevron gjenvinnes (soma og dendritter). Dette er tilstrekkelig for celletype klassifisering, men ikke for pålitelig og fullstendig rekonstruksjon av aksonal arkitektur. I figur 3 viser vi to eksempler på biocytin-merket nevroner med DAB-signal etter passende juxtasomal merking, ett spiny pyramide neuron (figur 3A) og ett interneuron (Figur 3B). Rekonstruksjon av tilstøtende tangentielle seksjoner gjør at serie rekonstruksjon å oppnå full neuronal morfologi 18,22,23,27,28. I tillegg har histologiske farging av anatomiske referanserammer (for eksempel iprimære somatosensoriske cortex) tillater registrering av enkeltnerveceller til standardiserte referanserammer 4,19. De to eksemplene som presenteres her reflektere optimale forhold til å klassifisere og deretter rekonstruere de morfologiske eiendommer med en manuell eller automatisert system (figur 4) 15,20,29-31.
Figur 1. Elektrode egenskaper for juxtasomal biocytin merking. (A) elektrode for juxtasomal opptak av kortikale nevroner på 300-500 mikrometer dybden med hensyn til pial overflaten. (B) elektrode for juxtasomal opptak av kortikale nevroner på 1,500-1,800 mikrometer opptak dybde. Legg merke til forskjellen i lengde mellom koniske plater (A) og (B). (
Figur 2. Elektrofysiologiske egenskaper under biocytin fylling. (A, B) Spontane aksjonspotensialer er observert under anvendelsen av firkantede pulser (200 msek, on / off) med positiv strøm, men med tilstrekkelig amplitude å laste nervecellen med biocytin. (C) Økende dagens amplitude resultater i åpningen av nevronale membran slik biocytin-lasting, synlig i spor som fase-låst burst-spiking under besøket på fase of pulsen. (D) Den pigg bølgeform under fylling viser en økt bredde og redusert etter hyperpolarization. Spike amplitude er normalisert å pigge amplitude i B for sammenligning. (E, F) Etter vellykket gjenoppretting av nervecellen etter at fyllingen søkt en vanlig pigg bredde og frekvens kan observeres. Spike amplitude er normalisert å pigge amplitude i B for sammenligning. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Biocytin-DAB merking fra juxtasomally fylt nevroner i primære somatosensoriske cortex av uretan bedøvede rotter. (A) Pyramideformet nevron i tangentialutsikt. Legg merke til den fremtredende forskjell i diameter størrelse på dendritter og aksoner. (B) Fast-spiking interneuron i tangential visning. Legg merke til beaded strukturen i dendritter og aksoner. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Digital rekonstruksjon av juxtasomally merket nervecellen. (A) Neuron projeksjon bilde med høy oppløsning (men lav forstørrelse) innhentet fra 100 mikrometer tangential skive lag 6 nevron av rotte primære somatosensoriske cortex ved hjelp av semi-automatisert bildebehandling rørledning. (B) Det samme bildet som i (A) med automatisert digital rekonstruksjon kledde (akson i blått, dendrite i rødt, henholdsvis). (C) Bracket boks fra (B) zoomet inn for å illustrere påliteligheten av aksonal rekonstruksjon med juxtasomal merking. Legg merke til axon boutons gjennom hele lengden av aksonet, to boutons er markert med svarte piler. Klikk her for å se større bilde.
| mM | g / ltr | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1,8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl 2 | 0,2033 |
| 5 | HEPES | 1,1915 |
| Juster pH til 7,2 med NaOH | ||
| Legg 20 mg/ml-1 biocytin |
Tabell 1. Normal Rat Ringer Supplert med Biocytin.
| 8 mg | Cytokrom C fra hestens hjerte |
| 8 mg | Catalase fra storfe leveren |
| 265 mL | 75 mg / ml DAB |
| Løs opp i 40 ml 0,05 M PB | |
| Filter og forvarme løsning ved 37 ° C | |
Tabell 2. Løsning for Cytokrom C oksidase farging.
| En dråpe | Reagens A |
| En dråpe | Reagens B |
| 0,5 ml | 10% Triton X100 |
| ight = "21" style = "height: 21px;"> Løs opp i 9,5 ml 0,05 M PB (45 min på forhånd) | |
| Legg 410 mL løsning / brønn | |
| Protokoll for ABC-løsning for en 24-brønns plate. | |
Tabell 3. Løsning med Vectastain standard ABC-kit.
| 265 mL | 75 mg / ml DAB |
| 13,4 mL | 30% H 2 O 2 |
Tabell 4. Løsning for DAB farging.
| 6 g | Analysekvalitet glyserol |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Manuelt røre 10 min til pels Mowiol med glyserol | |
| 6 ml | Destillert H 2 O |
| Inkuber ved RT i 2 timer | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH 8.5 |
| Inkuber i 50 ° C vannbad for 1t - O / N, rør av og til | |
| Sentrifuger 15 min ved 5000 xg, delmengde og oppbevar ved -20 ° C | |
Tabell 5. Mowiol løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den juxtasomal metoden gjør opptak i vivo aksjonspotensial spiking fra enkle enheter på tvers av atferds forhold (bedøvet, våken head-fast eller fritt bevegelige) med mulighet for biocytin-merking innspilt nevron for post hoc celletype klassifisering og / eller 3D-rekonstruksjon. Den store fordelen er å få fysiologiske parametre i den ekstracellulære (altså ikke-invasiv) konfigurasjon og likevel være i stand til å merke nervecellen intracellulært med biocytin 16,17,32. I tillegg til biocytin merking, kan denne teknikken bli brukt til å injisere nerveceller med DNA, RNA, proteiner, eller fluoriserende fargestoffer 33,34. Den mest åpenbare ulempe med denne tilnærmingen er kanskje den mangel på visuell kontroll av merking kvalitet, og dermed ikke noen fremgangsmåte for å kontrollere merkingen kvaliteten i løpet av eksperimentet. Imidlertid kan opptaksforhold og særlig aksjonspotensial form brukes til å vurdere hvor vellykket merking prosedyren. For INSTANCE, sannsynligheten for å utvinne et nevron med tett biocytin-DAB etiketten øker når spiking frekvens under strømpulser øker dramatisk, akkompagnert med forsvinningen av den etter-hyperpolarization og utvidelse av handlingen potensielle bølgeform (se figur 2). Dessuten er kvaliteten av biocytin-merking direkte korrelert til det summerte lengden av de enkelte merke sesjoner, slik at flere lange fylle sesjoner (> 60 sek), vil gi bedre histologisk kvalitet i forhold til en enkelt kort fylling sesjon (<30 sekunder) . Endelig vil overlevelsestiden for tracer diffusjon kritisk bestemme merking intensiteten av distale seksjonene. Generelt, overlevelse av en time etter høy kvalitet elektroporering sikrer tilstrekkelig merking av langtrekkende intracortical aksonale anslag. Ett eksempel på slike langtrekkende anslag er nerveceller fra primær somatosensoriske cortex prosjektering til andre somatosensoriske cortex eller dysgranularsoner og dermed rager til områder som er flere millimeter vekk fra merking området 4,20. Når aksonale projeksjoner av enda større dimensjoner er undersøkt (for eksempel thalamocortical anslag), bør overlevelsestiden økes 15. Viktig å innse er at elektroporering av nervecellen vil ha en dyp effekt på fysiologiske tilstand av nervecellen grunn av overdreven natrium tilstrømningen fra elektroden løsning. Dermed er det sterkt anbefalt å blander fylle episoder med hvilende episoder å tillate full gjenoppretting av aksjonspotensial spiking og overvåking opptaksforhold etter fylling økter når biocytin diffundere langs dendrittiske og aksonale arborizations 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De authros har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Profs. Huibert Mansvelder og Bert Sakmann for omfattende støtte, Dr. Marcel Oberlaender for fruktbare diskusjoner og gi neuronal tracing, og Brendan Lodder for teknisk assistanse. Data ble anskaffet ved hjelp av ntrode VI for LabView, sjenerøst gitt av R. Bruno (Columbia Univ.., NY, USA). Denne forskningen ble støttet av Max Planck Society og Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (finansiert av det tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Senter for Neurogenomics og kognitiv forskning (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), midler til CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 og ENC-Network # p3-c3) og VU University Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
