Summary
Чтобы понять структуру нейронных сетей, функциональный и морфологическое описание отдельных нейронов является необходимостью. Здесь мы демонстрируем juxtasomal biocytin маркировку, которая позволяет электрофизиологические записи во внеклеточной конфигурации, все же сохраняя способность внутриклеточно маркировать нейрон для пост специальной реконструкции дендритных и аксонов архитектуры.
Abstract
Кора головного мозга характеризуется множественными слоями и многих различных типов клеток, которые в совокупности как сеть ответственных за многих высших когнитивных функций, включая принятие решений, сенсорной наведением поведения или памяти. Чтобы понять, как такие сложные нейронные сети выполнять такие задачи, важным шагом является определение функции (или электрическую активность) отдельных типов клеток внутри сети, преимущественно, когда животное выполняет соответствующую познавательную задачу. Кроме того, не менее важно определить анатомическую структуру сети и морфологического архитектуры отдельных нейронов, чтобы позволить обратного проектирования кортикальной сети. Технические прорывы, доступных сегодня позволяют записывать клеточную активность в просыпаются, ведут себя животные с ценным возможностью постфактум идентифицирующей записанные нейронов. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal biocytin, которая включает действия записи Potentiаль пики в конфигурации внеклеточный (или плохо-патч), используя обычные патч пипетки. Конфигурация записи juxtasomal является относительно стабильным и применимы ко поведенческих условий, в том числе под наркозом, в отключке, проснулся голова фиксирована, и даже в свободно движущейся животного. Таким образом, этот метод позволяет подключить сотового типа конкретных действий потенциального пики во время поведения животных к реконструкции отдельных нейронов и в конечном счете, всей корковой микросхемы. В этом видео рукописи, мы покажем, как отдельные нейроны в конфигурации juxtasomal могут быть помечены biocytin в уретанакрилового наркозом крысы для идентификации сообщение специальной и морфологической реконструкции.
Introduction
Нейронные сети состоят из нескольких типов клеток, характеризующихся высокой специфичностью морфологических и физиологических свойств 1-7. Как следствие, отдельные типы клеток выполнять специальные задачи в рамках сети (см., например Женте соавт. 8 и Burgalossi соавт. 9). Мы только начинаем понимать, типоспецифические функции клеток через нейронных сетей и многое еще предстоит открыть. С этой целью многие лаборатории реализации экспериментальных подходов, которые позволяют анализ морфологических свойств одного и того же нейронов популяции, из которой физиологические параметры были получены 1,10-15. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal 16,17, который включает электрофизиологические записи, используя обычные патч пипетки во внеклеточной (таким образом неинвазивной) конфигурации в сочетании с электропорации записанного нейрона с biocytin.Основное преимущество этого подхода состоит в том, что неинвазивный характер гарантирует, что потенциал действия пики из отдельных нейронов записывается без изменения (например, диализом) внутриклеточное содержание ячейки. Вслед за электропорации, подход juxtasomal предоставляет возможность постфактум идентификации клеток и реконструкции на ссылку функцию (физиология) структуре (морфологии). Как правило, морфологическая реконструкция включает в себя реконструкцию дендритных и аксонов морфологии который может быть продлен до количественной оценки плотности позвоночника и / или Bouton или даже реконструкции нейронов морфологии в нанометровым разрешением с помощью электронной микроскопии. Методика записи juxtasomal может быть использован для записей в естественных условиях различных типов клеток по всей слоев коры или в суб-области коры головного мозга в диапазоне видов, хотя большинство исследований применен метод в мелких грызунов, таких как мыши или крысы. Наше исследование сосредоточено на записи и маркировка нейроныкрысы первичной соматосенсорной коры (S1) и включает в себя визуальную идентификацию зарегистрированных нейронов 18, дендритные реконструкции в сочетании с точной регистрации в стандартизированной системе отсчета перепроектировать корковых сетей 4,19 и подробную реконструкцию аксонов архитектуры охарактеризовать тип конкретных клеток местный и проекция дальний цели 20.
По сравнению с альтернативными естественных условиях методов в записи (внутриклеточных или целых клеток), juxtasomal записи относительно стабильны и поэтому могут быть применены через поведенческих состояний в том числе под наркозом 21,22, седативные 14, Awake головой фиксированной 23, или даже свободно движущихся Животные 9 . Здесь мы покажем juxtasomal маркировку в S1 из уретана наркозом крысы, хотя мы подчеркиваем общую применимость этого метода для многих препаратов выбора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка животных
Все экспериментальные процедуры проводятся в соответствии с голландским законодательством и после оценки местным этическим комитетом на VU университета Амстердама, Нидерланды.
- Обезболить Вистар крыс (P25-P45, ♂ / ♀) изофлураном (2-3% кислорода), а затем уретаном (20% в 0,9% NaCl, 1,6-1,7 г / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Оцените глубину анестезии путем мониторинга щепотку вывод, веко рефлексы и вибрисс движения.
- Администрирование дополнительную дозу уретана (10% от начальной дозы) в случае, если животное не достигнет достаточной глубины анестезии или всякий раз, когда Вибриссы подергивания наблюдаются в ходе эксперимента.
- Поместите наркозом животного на стереотаксической рамы, оснащенной грелку, вставить ректальной датчик температуры и поддерживать температуру тела животного при 37,5 ± 0,5 ° С на грелку.
- Введите 100 мкл 1% лидокаина (в 0,9% NaCl) подкожно для местной анестезии на месте эксплуатации и ждать 3-5 мин. Снимите кожу, покрывающую поверхность черепа за счет сокращения в направлении хвостовой-на-ростральной и очистить оставшиеся ткани.
- Очистите череп экстенсивно с 0,9% NaCl и впитывающих тампонов.
- Определить координаты целевой области на левом полушарии (для первичной соматосенсорной коры (S1): 2,5 мм задней и 5,5 мм сбоку от темени). Отметьте местоположение на черепе с хирургической маркера кожи пера.
- Очистите от кости осторожно бормашины от интересующей области, пока кость не станет прозрачной и кровеносные сосуды хорошо видны.
- Сделайте 0,5 мм х 0,5 мм трепанации черепа путем разрезания окно в утонченной черепа с помощью скальпеля (# 11), избегая повреждения твердой мозговой оболочкии кровеносные сосуды. Дополнительно: обозначая края трепанации черепа с использованием хирургического маркера кожи перо, чтобы улучшить видимость.
- Нанесите тонкий слой суперклея на сухой черепа, а затем зубным цементом построить ванну (т.е. записи камеры), окружающее трепанации черепа.
- Обрежьте усы на противоположной стороне ровно 5 мм от усов фолликула. Дополнительно: выделить обрезанные усы с черной туши.
2. Juxtasomal Записи и маркировка Biocytin
- Сделать патч пипетки из боросиликатного стекла с внутренним диаметром кончика ~ 1 мкм, изготовив электроды 3-5 сопротивления МОм. Примечание: Идеальный пипетки морфология для записи juxtasomal постепенное стройная конус, низкий угол конуса, и ~ 1 мкм наконечник (рис. 1).
- В зависимости от глубины записи (по отношению к поверхности пиальных), размеры конусность регистрирующего электрода должна быть скорректирована. Критически важным является то, что тон сужаются диаметр должен быть меньше 75 мкм в пункте въезда в мозге, чтобы избежать механического повреждения или стресс в области записи. Это означает, что для поверхностных корковых записи, конусность 300-500 мкм с внешним диаметром 75 мкм макси-мально не требуется (рис. 1А), тогда как записи с относительно глубоких слоев коры требуют более длительного конусность 1500-1800 мкм, снова Максимальный наружный диаметр 75 мкм (при 1800 мкм от конца электрода).
- Загрузите патч пипетки с нормальной крысиной звонка (NRR) с добавлением 2% biocytin (см. Таблицу 1 для решений и реагентов) и установите патч пипетки на голове этапе, прикрепленной к микроманипулятора.
- Установите угол держатель электрода до 34 ° по отношению к сагиттальной плоскости непосредственно для столбца D2 крысиного S1.
- Подключите этап головы к усилителю в бридж-режиме (т.е. ограничения тока).
- Установите патчпипетки в непосредственной близости от трепанации черепа. Наполните ванну с 0,9% NaCl и определить сопротивление электрода, который должен быть между 3-5 МОм, начисленных с применением прямоугольный импульс с положительной инжекции тока (1 нА, 200 мс вкл / выкл).
- Создание избыточного давления 100-150 мбар и продвижения патч пипетки в 1 мкм шагов при применении положительный ток как прямоугольных импульсов (1 нА, 200 мс вкл / выкл). Следить за надежную изменение сопротивления при установлении контакта с твердой мозговой оболочки. На данный момент, установить координаты микроманипулятора на "ноль", чтобы позволить точные измерения глубины.
- Авансовые в 1 шаге режиме мкм, пока патч пипетки не проникает в твердую мозговую оболочку, указанную внезапного падения сопротивления электродов. Извлеките удерживающий давление пипетки.
- Искать отдельных единиц при продвижении в 1 мкм шагов. Монитор сопротивление электрода непрерывно, применяя 200 мс вкл / выкл импульсов. Увеличение электрода сопротивления Typicсоюзником указывает близость одного нейрона. Продвиньте электрод, пока положительный потенциал действия (AP) формы волны ~ 2 мВ записываются (рис. 2А и 2В).
- Дополнительно: Запись спонтанное пики образец нейрона и определить, усов, вызываемой пики путем, например, каудально отклонения отдельных усы в течение 200 мс под углом 3,3 ° использованием пьезоэлектрического устройства 18.
- Авансовые электрод, пока сопротивление не составляет 25-35 МОм и шипы имеют амплитуды 3-8 мВ для получения оптимальных условий заполнения juxtasomal. Начните заполнение juxtasomal применяя прямоугольные импульсы положительной тока (1 нА, 200 мс вкл / выкл). Медленно и постепенно увеличивать ток с шагом 0,1 нА при мониторинге AP сигнала и частоту (фиг.2А и 2В).
- Следить за открытие мембраны в виде прозрачного увеличением частоты ЗС в рамках на-фазы блока импульса (рис. 2С (рисунки 2в, 2г). Дополнительные параметры включают в себя повышенный шум или небольшой (1-5 мВ) отрицательный сдвиг постоянного тока.
- Увеличение или уменьшение тока (1 нА) при заполнении, чтобы поддерживать стабильный biocytin настой. Уменьшить или прекратить импульсы тока при внезапном увеличении частоты А.П. чтобы избежать токсичности избыточным притоком внеклеточных ионов, таких как ионы натрия. Примечание: каждый нейрон по-разному реагируют ввода тока и juxtasomal параметры маркировки должны быть скорректированы в зависимости от индивидуальных условий съемки.
- Внимательно следить за сигнал после остановки подачу тока. Шип сигнала после сеанса заполнения обычно расширяется и показывает сильно снижается после гиперполяризации. Дождитесь восстановления нейрона, который является очевидным, когда шип сигнал возвращается к своим исходным свойствам (т.е. наличиенормальное состояние после-гиперполяризации, рисунок 2).
- Повторите biocytin заполнения сессий после полного восстановления нейрона увеличить biocytin нагрузку для улучшения качества окрашивания.
- Уберите патч пипетки с шагом 1 мкм до амплитуда всплеска не уменьшается, чтобы уменьшить любую механическую нагрузку в камеру. Подождите не менее 1 часа для biocytin диффундировать внутри клеток в то время как внимательно следит за температурой тела животного и дыхание.
3. Перфузии Animal и извлечение мозга
- Подготовьте установку перфузии, промыть и предварительно загрузить трубопровод с 0,9% NaCl.
- Расположите животное на хирургическом лоток и закрепите с помощью стандартного маркировки ленты. Обеспечить достаточную глубину анестезии; ноги щепотку и веко рефлексы должны отсутствовать.
- Сделайте медиальнее боковой разрез (5-6 см) через брюшную стенку прямо под грудной клеткой и перейти в задне-переднем направлении, чтобы разоблачить грудины.Потяните грудины вперед и осторожно отделить печень от диафрагмы.
- Сделайте небольшой надрез в диафрагме, разрезать через нижние ребра и продолжить разрез по всей длине брюшной полости, чтобы разоблачить сердце.
- Снимите перикарда.
- Вставьте иглу в левый желудочек и сделать разрез в правом предсердии. не Заливать 0,9% NaCl (~ 8 мл / мин) до тех пор, обесцвечивание печень завершена.
- не Переключите настой в 4% параформальдегида (PFA), пока жесткости передней лапы и нижняя челюсти очевидна.
- Обезглавить крысу, используя ножницы
- Удалите оставшиеся мышцы шеи и подвергать черепа полностью.
- Расположите ножницы в стволе мозга на спинной стороне и тщательно вырезать кость вдоль стреловидного шва, поддерживая позицию спинной.
- Удалить кости с обеих сторон сагиттального шва подвергать мозг с помощью щипцов. Осторожно снимите твердую мозговую оболочку, чтобы избежать дAmage.
- Осторожно вставьте тупой лопаточкой, чтобы вентральной стороне мозга и удалить мозг мягко.
- После исправить весь одночасье мозга в PFA на 4 ° С. Переключите мозг до 0,05 М фосфатного буфера (PB) и хранить при температуре 4 ° C.
4. Разрезание мозг в тангенциальном разделах
- Возьмите мозг из 0,05 М PB и положил его на фильтровальной бумаге, обращенной кпереди. Используйте острый лезвие, чтобы отрезать мозжечок вдоль фронтальной плоскости и отделить полушария разрезанием вдоль по середине сагиттальной плоскости.
- Применить суперклей на монтажной платформе и смонтировать левое полушарие на его сагиттальной плоскости с передней облицовки прав. Закрепите монтажную платформу под углом 45 ° на Vibratome и погрузить мозг в 0,05 М PB.
- Безопасность лезвие на Vibratome и убедитесь, что первый контакт с поверхностью мозга находится в середине передне-задней плоскости полушарии. Вырезать 24 100 мкмсекций и собрать их в 24-луночный планшет, содержащий 0,05 M Pb.
5. Гистологические процедуры
- Выполнение гистологические протоколы для окрашивания цитохромоксидазы 24 и авидин-биотин-пероксидаза способа в соответствии с ранее описанными методами 25. Дополнительно: визуализировать biocytin используя флуоресцентный авидин / стрептавидин-Alexa конъюгатов. Это дополнительно позволяет двойного окрашивания с ретроградных или Антероградная методов розыска.
- Разделы Wash 5 х 5 мин 0,05 М PB и подготовить 3,-3'-диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB), содержащего решение для цитохромоксидазы окрашивания, чтобы визуализировать баррелей в слое 4 (L4) из S1 (см. таблицу 2 для решений и реагенты). Выдержите разделы 6-12 из Пиа в разогретой решения для 30-45 мин при 37 ° С
- Промыть разделы с 0,05 М PB для 6 х 5 мин и утолить активности эндогенной пероксидазы путем инкубации все разделы в 3% H 2 2 в 0,05 М PB в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
- Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин. Выдержите разделы в ABC-решения (см. таблицу 3 для решений и реагентов) в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин и подготовить DAB-решение для визуализации biocytin заполненные нейрона (см. таблицу 4 для растворов и реагентов). Инкубируйте разделы в отфильтрованного раствора в течение 45-60 мин при комнатной температуре.
- Промыть секции с 0,05 М PB для 5 х 10 мин. Mount разделы по микроскопа и крышки скольжения с Mowiol (см. таблицу 5 для растворов и реактивов).
- Определить качество маркировки с использованием световой микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Детальное знание на 3D структуры отдельных нейронов имеет решающее значение для выяснения организационные принципы нейронных сетей. Наш метод включает в себя трубопровод для достижения высокого качества biocytin маркировку от подготовки в естественных условиях, что позволяет постфактум нейронов классификацию и подробную реконструкцию дендритных и аксонов архитектуры отдельных нейронов с высоким разрешением. В зависимости от качества juxtasomal маркировки, нейроны извлекают с различными DAB-интенсивностями в диапазоне от слабого до сильных сигналов DAB в положениях, которые очень точно соответствуют положению записи 19,26. В нашей лаборатории, обучены экспериментатор работает на успех-ставке 30-40% в уретановых наркозом грызунов. Это означает, что один нейрон выбирается для дендритных и аксонов реконструкции в один из трех экспериментов, которые затем отвечает следующим критериям: 1) только один нейрон заполнено в мозге, 2) отличного качества маркировки,3) biocytin сигнал постоянен вдоль аксонов прогнозов и не не уменьшается в дистальных окончаний, 4) Цит C контрастного успешно разрешить нейронов регистрации, и 5) без ущерба для срезах мозга во время гистологии. Сдерживающим фактором является, как правило, недостаточно biocytin маркировки, а это означает, что в ~ 80% всех экспериментах (под наркозом и / или активных), записанный нейрон будут восстановлены (сому и дендриты). Этого достаточно для типа клеток классификации, но не для надежной и полной реконструкции аксонов архитектуры. На рисунке 3 показано, два примера biocytin меченных нейронов с сигналом DAB после соответствующей juxtasomal маркировки; один колючий пирамидальный нейрон (рис. 3А) и один интернейронов (рис. 3В). Реконструкция смежных касательных секций позволяет серийный реконструкцию, чтобы получить полный нейронов морфологии 18,22,23,27,28. Кроме того, гистологическое окрашивание анатомических отсчета (например, впервичная соматосенсорной коры) позволяет регистрации отдельных нейронов в стандартизированных систем отсчета 4,19. Два примера, представленные здесь, отражают оптимальные условия для классификации и впоследствии реконструировать морфологические свойства с ручной или автоматизированной системы (рис. 4) 15,20,29-31.
Рисунок 1. Характеристики электродов для juxtasomal biocytin маркировки. (A) Электрод для juxtasomal записи корковых нейронов на 300-500 глубине мкм по отношению к мягкой мозговой оболочки поверхности. (В) Электрод для juxtasomal записи корковых нейронов в 1500-1800 глубины записи мкм. Обратите внимание на разницу в длине конусной между панелями (А) и (В). (
Рисунок 2. Электрофизиологические свойства во время заполнения biocytin. (А, В) Спонтанные потенциалы действия наблюдаются при применении прямоугольных импульсов (200 мс, вкл / выкл) с положительного тока, но с недостаточной амплитудой загрузить нейрон с biocytin. (C) Увеличение текущих результатов амплитуды в открытии мембраны нейронов, позволяя biocytin-погрузки, видно в трассировке как фазовой автоподстройки пакетном-пики в течение по-фазы Oе пульс. (D) шип сигнала при заполнении показывает повышенный ширину и уменьшается после гиперполяризации. Амплитуда Спайк нормализуется к резкому амплитуду в B для сравнения. (E, F) После успешного восстановления нейрона последующего к заправочной сессии можно наблюдать нормальная ширина и частота шип. Амплитуда Спайк нормализуется к резкому амплитуду в B для сравнения. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Маркировка Biocytin-DAB от juxtasomally заполненных нейронов в первичной соматосенсорной коре уретановых наркозом крыс. (А), пирамидальный нейрон в касательнойвид. Обратите внимание на заметную разницу в размерах диаметром дендритов и аксонов. (В) Фаст-пики интернейрон в касательной зрения. Обратите внимание на структуру бисером дендритов и аксонов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Цифровая реконструкция juxtasomally надписью нейрона. (А) Нейрон проецирования изображения с высоким разрешением (но малом увеличении), полученный из 100 мкм касательной ломтик слой 6 нейрона крыс первичной соматосенсорной коры с использованием полуавтоматических трубопровод изображения. (Б) То же изображение, как в (А) с автоматизированной цифровой реконструкции обложил (аксон в синем, dendrITE в красный, соответственно). (C) Кронштейн коробки из (B) увеличено, чтобы проиллюстрировать надежность аксонов реконструкции с использованием juxtasomal маркировку. Примечание аксона бутоны всей длине аксона; два бутоны выделены черными стрелками. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| мМ | г / л | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl 2 | 0.2033 |
| 5 | HEPES | 1,1915 |
| Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью NaOH | ||
| Добавить 20 mg/ml-1 biocytin |
Таблица 1. Нормальная Крыса звонка Дополнен Biocytin.
| 8 мг | Цитохром С от лошадиного сердца |
| 8 мг | Catalasэ из бычьей печени |
| 265 мкл | 75 мг / мл DAB |
| Растворите в 40 мл 0,05 М PB | |
| Фильтр и подогрева раствора при 37 ° С | |
Таблица 2. Раствор для цитохрома окрашивания С оксидазы.
| 1 капля | Реагент |
| 1 капля | Реагент В |
| 0,5 мл | 10% Тритон X100 |
| РАВО = стиль "21" = "высота: 21px;"> Растворите в 9,5 мл 0,05 М PB (45 мин заранее) | |
| Добавить 410 мкл раствора / лунку | |
| Протокол ABC-раствора в течение одного 24-луночного планшета. | |
Таблица 3. Решение с Vectastain стандартной ABC-комплекта.
| 265 мкл | 75 мг / мл DAB |
| 13,4 мкл | 30% H 2 O 2 |
Таблица 4. Раствор для окрашивания DAB.
| 6 г | Аналитической чистоты глицерина |
| 2,4 г | Mowiol 4-88 |
| Вручную размешать 10 минут до пальто Mowiol с глицерином | |
| 6 мл | Дистиллированную Н2О |
| Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов | |
| 12 мл | 0,2 М Triс рН 8,5 |
| Выдержите в 50 ° C на водяной бане в течение 1 часа - O / N, помешивать | |
| Центрифуга 15 мин при 5000 мкг, аликвоты и хранить при температуре -20 ° C | |
Таблица 5. Решение Mowiol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод juxtasomal позволяет записывать в естественных потенциала действия пики от отдельных единиц по всей поведенческих условий (под наркозом, проснулся голова фиксированной или свободно перемещаться) с возможностью biocytin маркировки записанного нейрон для почтового типа Прямое клеток классификации и / или 3D-реконструкции. Основным преимуществом является получение физиологических параметров во внеклеточной (таким образом неинвазивной) конфигурации, но будучи в состоянии обозначить нейрон внутри клетки с biocytin 16,17,32. В дополнение к biocytin маркировки, этот метод может быть использован для введения нейронов с ДНК, РНК, белков, или флуоресцентных красителей 33,34. Наиболее очевидным недостатком этого подхода является, пожалуй, отсутствие визуального контроля качества маркировки, и, таким образом нет возможности проверить качество маркировки во время эксперимента. Тем не менее, условия съемки и особенно потенциал действия форма может быть использована для оценки успешности процедуры маркировки. Для неустойчивостисть, вероятность восстановления нейрон с плотной этикетке biocytin-DAB возрастает, когда частота пики во время импульсов тока резко возрастает, сопровождается исчезновением после гиперполяризации и расширения потенциала действия сигнала (см. рисунок 2). Кроме того, качество biocytin маркировки напрямую зависит от суммарной длины отдельных сессий маркировки, так что несколько длинных сессий наполнения (> 60 сек) приведет к улучшению гистологической качества по сравнению с индивидуальной короткой сессии наполнения (<30 сек) . Наконец, время выживания для диффузии меченых будет критически определить интенсивность маркировки дистальных отсеков. В общем, время выживания 1 ч после высококачественного электропорации обеспечивает достаточную маркировки большой дальности интракортикальных аксонов прогнозов. Одним из примеров таких долгосрочных прогнозов являются нейроны от первичной соматосенсорной коре выступающие в среднюю соматосенсорной коры или dysgranularзоны, таким образом, проектирование с областями, не несколько миллиметров от маркировки сайте 4,20. Когда аксонов проекции даже больших размеров исследуются (например, таламокортикальных проекций), время выживания должна быть увеличена 15. Важно понимать, что электропорации нейрона окажет глубокое влияние на физиологическое состояние нейрона из-за чрезмерного притока натрия из раствора электрода. Таким образом, настоятельно рекомендуется смешивать заполнения эпизоды с покоящихся эпизодов, чтобы позволить полное восстановление потенциала действия пики и мониторинга условий записи после заполнения сессий, когда biocytin допускается диффундировать вдоль дендритов и аксонов arborizations 12,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
В authros нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить проф. Huibert Mansvelder и Берт Sakmann за всестороннюю поддержку, доктор Марсель Оберлендер за плодотворные обсуждения и предоставления нейронов трассировку и Брендан Лоддер для оказания технической помощи. Данные были приобретены с помощью ntrode VI для LabVIEW, щедро предоставленную Р. Бруно (Колумбийский университет., Нью-Йорк, США). Это исследование было поддержано Общества Макса Планка и Бернштейна Центра вычислительной неврологии, Тюбинген (финансируемого Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF; ФКЗ: 01GQ1002)) (RTN), Центр Neurogenomics и когнитивных исследований (CNCR) , неврологии Campus Амстердам (НКА), финансирование CPJdK (СВО-ALW # 822.02.013 и ENC-сеть # P3-c3) и VU университета Амстердама.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O'Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
