Summary
Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.
Abstract
Die Hirnrinde von mehreren Schichten und viele verschiedene Zelltypen, die zusammen als ein Netzwerk für viele höhere kognitive Funktionen einschließlich Entscheidungen, sensorischen geführte Verhalten oder Speicher verantwortlich ist. Um zu verstehen, wie solche komplizierten neuronalen Netzwerken erfüllt die Aufgaben, ist ein wichtiger Schritt, um die Funktion (oder elektrische Aktivität) der einzelnen Zelltypen innerhalb des Netzes zu bestimmen, wenn das Tier bevorzugt ist die Durchführung einer entsprechenden kognitiven Aufgabe. Zusätzlich ist es ebenso wichtig, die anatomische Struktur des Netzwerks und der morphologischen Architektur der einzelnen Neuronen zu ermöglichen Reverse Engineering des kortikalen Netzwerks zu bestimmen. Technische Durchbrüche heute ermöglichen die Aufnahme Zellaktivität bei wachen, sich verhaltenden Tier mit der wertvollen Möglichkeit, Post-hoc-Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen. Hier zeigen wir die juxtasomal Biocytin Markierungstechnik, die Aufzeichnungsaktion Potentiometer beinhaltetal Spick in der extrazellulären (oder lose-Patch)-Konfiguration mit herkömmlichen Patch-Pipetten. Die juxtasomal Aufnahmekonfiguration ist relativ stabil und zutreffend über Verhaltensbedingungen, einschließlich betäubt, betäubt, wach Kopf befestigt, und auch in der frei beweglichen Tier. Somit ermöglicht diese Methode die Verknüpfung Zelltyp-spezifische Aktionspotential Spick während das Verhalten der Tiere, um die Rekonstruktion der einzelnen Nervenzellen und letztlich der gesamten kortikalen Mikroschalt. In diesem Video-Manuskript, zeigen wir, wie einzelne Nervenzellen im juxtasomal Konfiguration kann mit Biocytin in der Urethan-narkotisierten Ratten für Post-hoc-Identifikation und morphologische Rekonstruktion gekennzeichnet werden.
Introduction
Neuronale Netzwerke bestehen aus mehreren Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, hochspezifische morphologische und physiologische Eigenschaften 1-7. Als eine Folge einzelner Zelltypen führen spezialisierte Aufgaben im Netzwerk (siehe beispielsweise Gentet et al. 8 und Burgalossi et al. 9). Wir sind erst am Anfang, um die Zelltyp-spezifische Funktionen in neuronalen Netzwerken zu verstehen und ist immer noch viel zu entdecken. Zu diesem Zweck sind viele Labors experimentelle Ansätze anwenden, die die Analyse von morphologischen Eigenschaften des gleichen neuronalen Population, aus der physiologischen Parameter wurden erhalten, 1,10-15 ermöglichen. Hier zeigen wir die juxtasomal Markierungstechnik 16,17, die elektrophysiologischen Ableitungen geht mit herkömmlichen Patch-Pipetten in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration in Kombination mit der Elektroporation aufgezeichnet Neuron mit Biocytin. Diegroße Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die nicht-invasive Natur sorgt dafür, dass Aktionspotential Spicken von einzelnen Neuronen ohne Veränderung (zB Dialyse) den intrazellulären Inhalt der Zelle aufgezeichnet. Gefolgt durch Elektroporation bietet die juxtasomal Ansatz die Möglichkeit, Post-hoc-Zell-Identifikation und Rekonstruktion der Funktion (Physiologie), um die Struktur (Morphologie) zu verknüpfen. Typischerweise beinhaltet morphologische Rekonstruktion Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Morphologie, die Quantifizierung der Wirbelsäule und / oder bouton Dichten oder auch Rekonstruktion von neuronalen Morphologie im Nanometerauflösung mittels Elektronenmikroskopie erweitert werden kann. Die juxtasomal Aufzeichnungstechnik kann für die in vivo-Aufnahmen von verschiedenen Zelltypen in kortikalen Schichten oder subkortikale Bereiche in einer Reihe von Arten verwendet werden, obwohl die meisten Studien haben die Technik in kleine Nagetiere wie Mäuse oder Ratten angewendet. Unsere Forschung ist auf die Aufnahme und Kennzeichnung Neuronen konzentriertaus Ratten primären somatosensorischen Kortex (S1) und beinhaltet visuelle Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen 18, dendritische Rekonstruktionen in Kombination mit präzise Erfassung in einem standardisierten Referenzrahmen Reverse Engineering kortikaler Netzwerke 4,19 und detaillierte Rekonstruktion der axonalen Architektur zur Charakterisierung Zelltyp-spezifische lokale und langfristige Projektion richtet 20.
Im Vergleich zu alternativen In-vivo-Aufnahmetechniken (intrazelluläre oder ganze Zellen), sind juxtasomal Aufnahmen relativ stabil und können daher über Verhaltenszustände einschließlich betäubt 21,22 angewendet werden, sediert 14, wach kopffesten 23 oder sogar frei beweglichen Tieren 9 . Hier zeigen wir juxtasomal Kennzeichnung S1 eines Urethan-narkotisierten Ratten, obwohl wir betonen die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik auf viele Vorbereitungen der Wahl.
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Protocol
1. Vorbereitung der Tiere
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem niederländischen Gesetz und nach der Auswertung von einer lokalen Ethikkommission an der VU University Amsterdam, Niederlande, durchgeführt.
- Betäuben einer Wistar-Ratte (P25-P45, ♂ / ♀) mit Isofluran (2-3% in Sauerstoff) und anschließend mit Urethan (20% in 0,9% NaCl, 1,6 bis 1,7 g / kg) durch intraperitoneale Injektion. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose durch Überwachung Prise Entzug, Augenlid Reflexe und Bewegungen Tasthaare.
- Verwalten Sie eine zusätzliche Dosis von Urethan (10% der Anfangsdosis) im Falle das Tier nicht ausreichend Narkosetiefe zu erreichen, oder wenn Tasthaare Zuckungen im Verlauf des Experiments beobachtet.
- Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der stereotaktischen Rahmen mit einem Heizkissen ausgestattet, legen rektale Temperatursonde und die Körpertemperatur des Tieres zu halten, bei 37,5 ± 0,5 ° C durch ein Heizkissen.
- Injizieren Sie 100 ul 1% Lidocain (in 0,9% NaCl) subkutan zur Lokalanästhesie an der Einsatzstelle und warten 3-5 min. Entfernen Sie die Haut, die die Oberfläche des Schädels durch Schneiden in der Schwanz-to-rostrale Richtung und reinigen Sie die restlichen Gewebe.
- Reinigen Sie den Schädel ausgiebig mit 0,9% NaCl und saugfähige Tupfer.
- Bestimmen der Koordinaten des Zielbereichs auf der linken Hemisphäre (zum primären somatosensorischen Kortex (S1): 2,5 mm posterior und 5,5 mm lateral zum Bregma). Markieren Sie die Stelle auf den Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift.
- Abkratzen Knochen sanft von einem Zahnbohrer aus der Region von Interesse, bis der Knochen wird transparent und Blutgefäße sind deutlich sichtbar.
- Einen 0,5 mm x 0,5 mm Kraniotomie, indem ein Fenster in der ausgedünnten Schädel mit einem Skalpell (Nr. 11), die Vermeidung von Schäden an der Dura materund Blutgefäße. Optional: Markieren Sie die Kanten der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift, um die Sichtbarkeit zu verbessern.
- Tragen Sie eine dünne Schicht der Sekundenkleber auf die Trocken Schädel und Zahnzement, ein Bad (dh die Aufnahme Kammer), die den Kraniotomie zu konstruieren.
- Trimmen der Whisker an der kontralateralen Seite genau 5 mm von der Whisker Follikel. Optional: Markieren Sie die Barthaare getrimmt mit schwarzer Mascara.
2. Juxtasomal Recordings und Biocytin Labeling
- Machen Patch-Pipetten aus Borosilikatglas mit innen Spitzendurchmesser von ~ 1 um bis Elektroden mit 3-5 MOhm Widerstand zu erhalten. Hinweis: Die ideale Pipette Morphologie für die juxtasomal Aufnahme ist eine allmähliche Verjüngung schlank, eine niedrige Konuswinkel, und a ~ 1 um Spitze (Abbildung 1).
- In Abhängigkeit von der Aufzeichnungstiefe (bezogen auf die Pia-Oberfläche), sollten die Abmessungen der Verjüngung der Aufzeichnungselektrode eingestellt werden. Von entscheidender Bedeutung ist, dass ter verjüngen Durchmesser sollte weniger als 75 um bereits am Eintrittspunkt in das Gehirn, um mechanische Beschädigungen oder Stress auf den Aufnahmebereich zu vermeiden. Dies zeigt, daß bei oberflächlichen kortikalen Aufnahmen, eine Verjüngung von 300-500 &mgr; m mit einem Außendurchmesser von maximal 75 &mgr; m erforderlich ist (Fig. 1A), während die Aufnahmen von relativ tiefen kortikalen Schichten erfordern eine längere Verjüngung 1.500-1.800 &mgr; m, wieder mit maximaler Außen Durchmesser von 75 &mgr; m (1,800 &mgr; m an der Elektrodenspitze).
- Laden Sie die Patch-Pipette mit normalem Ratten Rufton (NRR), ergänzt mit 2% Biocytin (siehe Tabelle 1 für Lösungen und Reagenzien) und montieren Sie die Patch-Pipette auf einem Kopf Stufe auf einen Mikromanipulator befestigt.
- Den Winkel des Elektrodenhalters bis 34 ° in Bezug auf die Sagittalebene, um gezielt die Kolonne D2 von Ratten-S1.
- Schließen Sie das Kopfstufe mit einem Verstärker in Brücke-Modus (dh Stromzange).
- Positionieren Sie den Patchpipettieren, in der Nähe der Kraniotomie. Füllen Sie die Badewanne mit 0,9% NaCl und bestimmen den Elektrodenwiderstand, der zwischen 3-5 MOhm, durch Anlegen einer Rechteckimpuls mit positiven Stromeinspeisung (1 nA, 200 ms an / aus) bewertet sein sollten.
- Stellen Überdruck von 100 bis 150 mbar und vorab die Patch-Pipette in ein um Schritte, während die Anwendung positiver Strom als Rechteckimpulse (1 nA, 200 ms an / aus). Überwachen Sie die robuste Widerstandsänderung bei der Kontaktaufnahme mit der Dura mater. An diesem Punkt setzen die Koordinaten der Mikromanipulator auf "Null", um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen.
- Geleistete in 1 um Schritt-Modus, bis der Patch-Pipette durchdringt die von einem plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstand angegeben Dura mater. Entfernen des Haltedrucks der Pipette.
- Suche nach einzelnen Einheiten beim Vorrücken in 1 um Schritte. Überwachung der Elektrodenwiderstand kontinuierlich durch Anlegen von 200 msec ein / aus-Impulse. Eine Erhöhung der Elektrodenwiderstand typicVerbündeter zeigt die Nähe eines einzelnen Neurons. Schieben Sie die Elektrode, bis positive Aktionspotential (AP) Wellenformen von ~ 2 mV aufgezeichnet (2A und 2B).
- Optional: Nimmt die spontane Spiking Muster der Neuronen zu bestimmen und Whisker-evozierte Spiking von, zum Beispiel, nach kaudal Ablenken einzelnen Whisker für 200 ms unter einem Winkel von 3,3 º mit einer piezoelektrischen Vorrichtung 18.
- Schieben Sie die Elektrode bis der Widerstand ist 25-35 MOhm und Spikes Amplituden von 3-8 mV optimale Bedingungen für juxtasomal Füllung erhalten. Starten des juxtasomal Füllung durch Anlegen von Rechteckimpulsen positiver Strom (1 nA, 200 ms EIN / AUS). Langsam und schrittweise Erhöhung der Strom, der durch Stufen von 0,1 nA, während die Überwachung der AP-Wellenform und Frequenz (2A und 2B).
- Überwachen Sie die Membranöffnung als eine klare Zunahme der AP-Frequenz während der Ein-Phase des Blockimpuls (2C (2C und 2D). Weitere Parameter sind eine erhöhte Lärm oder eine kleine (1-5 mV) negativen DC-Verschiebung.
- Erhöhen oder verringern den Strom (1 nA) beim Ausfüllen stabile Biocytin Infusion erhalten. Reduzieren oder stoppen Sie die Stromimpulse auf plötzlichen Anstieg der AP-Frequenz, um die Toxizität durch Über Zustrom von extrazellulären Ionen wie Natrium-Ionen zu vermeiden. Hinweis: jedes Neuron wird unterschiedlich auf die Stromeinspeisung und juxtasomal Kennzeichnung Parameter müssen je nach individuellen Aufnahmebedingungen angepasst werden reagieren.
- Das Signal nach dem Stoppen der Stromeinspeisung genau beobachten. Die Spitzen-Wellenform nach einer Füllung Sitzung ist in der Regel erweitert und zeigt eine Hyperpolarisation nach stark reduziert. Warten für die Wiederherstellung der Neuronen, die offensichtlich ist, wenn die Spitzen-Wellenform wieder seine ursprünglichen Eigenschaften (dh Gegenwartnormal nach-Hyperpolarisation, Abbildung 2).
- Wiederholen Biocytin Sitzungen zum Ausfüllen nach der vollständigen Wiederherstellung des Neurons zu Biocytin Last für eine verbesserte Qualität der Färbung zu erhöhen.
- Fahren Sie die Patch-Pipette in Schritten von 1 um, bis die Spitze Amplitude abnimmt, um mechanische Spannungen auf die Zelle zu reduzieren. Warten Sie mindestens 1 Stunde für die Biocytin intrazellulär diffundieren dabei eng Überwachung der Körpertemperatur des Tieres und die Atmung.
3. Perfusion der Tier-und Ausbau des Gehirns
- Bereiten Sie die Setup-Perfusion, spülen, und Vorspannung der Schlauch mit 0,9% NaCl.
- Positionieren Sie das Tier auf einem OP-Tray und mit Standard-Etikettenband. Für ausreichende Tiefe der Narkose; Fuß Prise Augenlid und Reflexe sollten nicht vorhanden sein.
- Machen Sie eine medial Schnitt (5-6 cm) durch die Bauchwand direkt unter dem Brustkorb seitlich und fahren in posterior-anterior Richtung, um das Brustbein aus.Ziehen Sie das Brustbein nach vorne und vorsichtig die Leber von der Membran.
- Einen kleinen Einschnitt in der Membran, durch die unteren Rippen geschnitten und weiter den Schnitt entlang der gesamten Länge der Bauchhöhle, um das Herz freizulegen.
- Entfernen Sie den Herzbeutel.
- Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und einen Einschnitt in den rechten Vorhof. Perfusion mit 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) bis zur Entfärbung der Leber vollständig ist.
- Schalten Sie die Infusions bis 4% Paraformaldehyd (PFA), bis Steifigkeit des Vorderpfote und Unterkiefer ist offensichtlich.
- Enthaupten die Ratte mit einer Schere
- Entfernen Sie die restlichen Nackenmuskulatur und setzen den Schädel komplett.
- Positionieren Sie die Schere im Hirnstamm auf der Rückenseite und schneiden Sie die Knochen vorsichtig entlang der Pfeilnaht, die Aufrechterhaltung der Rückenlage.
- Entfernen der Knochen von beiden Seiten der Pfeilnaht um das Gehirn freizulegen mit einer Pinzette. Die Dura vorsichtig entfernen, um zu vermeiden, dAmage.
- Einem stumpfen Spachtel vorsichtig in die Bauchseite des Gehirns und das Gehirn zu entfernen sanft.
- Post-fix das gesamte Gehirn über Nacht in PFA bei 4 ° C Schalten Sie das Gehirn, um 0,05 M Phosphatpuffer (PB) und lagern bei 4 ° C
4. Slicing the Brain in Tangential Sections
- Nehmen Sie das Gehirn aus dem 0,05 M PB und legte es auf ein Filterpapier zugewandten vorderen. Mit einem scharfen Rasierklinge schneiden Sie das Kleinhirn entlang der Frontalebene und trennen Sie die Hemisphären durch Schneiden entlang der mittlere Sagittalebene.
- Sekundenkleber auf der Montageplattform und montieren Sie die linke Hemisphäre auf der Sagittalebene mit Front nach rechts. Die Montageplattform in einem Winkel von 45 ° auf einem Vibratom und tauchen das Gehirn in 0,05 M PB.
- Sicherung einer Rasierklinge auf dem Vibratom und sicherstellen, dass der erste Kontakt mit der Hirnoberfläche ist in der Mitte der anterior-posterioren Ebene der Halbkugel. Cut 24 100 umAbschnitte und sammeln sie in einer 24-Well-Platte mit 0,05 M PB.
5. Die histologische Verfahren
- Führen histologischen Protokolle für die Cytochrom-Oxidase-Färbung 24 und der Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren nach zuvor beschriebenen Verfahren 25. Optional: visualisieren Biocytin mit fluoreszierenden Avidin / Streptavidin-Konjugate Alexa. Dies ermöglicht zusätzlich Doppelfärbung mit retrograde oder anterograde Tracing-Techniken.
- Wash Abschnitte 5 x 5 min mit 0,05 M PB und bereiten die 3-3'-Diaminobenzidin (DAB)-haltigen Lösung für die Cytochrom-Oxidase-Färbung Fässer in Schicht 4 (L4) von S1 zu visualisieren (siehe Tabelle 2 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte 6-12 von Pia im vorgewärmten Lösung für 30-45 min bei 37 ° C.
- Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 6 x 5 min und stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubation alle Abschnitte in 3% H 2 2 in 0,05 M PB für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Abschnitte in ABC-Lösung inkubiert (siehe Tabelle 3 für Lösungen und Reagenzien) über Nacht bei 4 ° C
- Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 5 x 10 min und bereiten die DAB-Lösung, um die Biocytin gefüllten Neuron visualisieren (siehe Tabelle 4 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte in gefilterten Lösung inkubieren 45-60 min bei RT.
- Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Berg Abschnitte auf Objektträger und Deckgläschen mit Mowiol (siehe Tabelle 5 nach Lösungen und Reagenzien).
- Bestimmen Sie Etikettierqualität mittels Lichtmikroskopie.
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Representative Results
Detaillierte Kenntnisse über 3D-Struktur der einzelnen Nervenzellen ist entscheidend für die Aufklärung Organisationsprinzipien neuronaler Netzwerke. Unsere Methode beinhaltet eine Pipeline, um qualitativ hochwertige Biocytin Kennzeichnung von einem in-vivo-Herstellung zu erreichen, wodurch post hoc neuronalen Klassifizierung und detaillierte Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur einzelner Neurone bei hoher Auflösung. Abhängig von der Qualität des juxtasomal Etikettierung werden Neuronen mit unterschiedlichen DAB-Intensitäten im Bereich von schwach bis stark DAB-Signale an Positionen, die sehr genau auf die Aufzeichnungsstelle 19,26 entsprechen gewonnen. In unserem Labor arbeitet ein ausgebildeter Experimentator an einer Erfolgsrate von 30-40% in der Urethan narkotisiert Nagetiere. Dies zeigt, dass ein Neuron für dendritischen und axonalen Rekonstruktion in einem von drei Experimenten, die dann erfüllt die folgenden Kriterien ausgewählt: 1) nur ein Neuron im Gehirn, 2) ausgezeichnete Qualität Etikettierung gefüllt,3) Biocytin Signal konstant entlang axonale Projektionen und nicht an ihren distalen Enden zu verringern, 4) Cyt C-Gegen erfolgreich neuronale Registrierung zu ermöglichen, und 5) keine Schäden an Hirnschnitten in der Histologie. Der limitierende Faktor ist typischerweise unzureichend Biocytin Kennzeichnung, was bedeutet, dass in ~ 80% der Experimente (anästhesiert und / oder wach), wird das aufgenommene Neurons gewonnen werden (Soma und Dendriten). Dies ist für die Zelltypklassifizierung, aber nicht für eine zuverlässige und vollständige Rekonstruktion des axonalen Architektur ausreichend. In Abbildung 3 zeigen wir zwei Beispiele von Biocytin-markierten Neuronen mit DAB-Signal nach entsprechender Kennzeichnung juxtasomal, einer stacheligen Pyramidenzelle (3A) und ein Interneuron (3B). Wiederaufbau von benachbarten tangentialen Abschnitte ermöglicht Serien Wiederaufbau voll neuronale Morphologie 18,22,23,27,28 erhalten. Zusätzlich histologischen Färbung von anatomischen Referenzrahmen (beispielsweise in derprimären somatosensorischen Kortex) ermöglicht die Registrierung einzelner Neuronen zu standardisierten Referenzrahmen 4,19. Die beiden hier vorgestellten Beispiele beziehen sich auf optimale Bedingungen zu klassifizieren und anschließend rekonstruieren die morphologischen Eigenschaften mit einem manuellen oder automatisierten System (Abbildung 4) 15,20,29-31.
Abbildung 1. Elektrodeneigenschaften für juxtasomal Biocytin Kennzeichnung. (A)-Elektrode für juxtasomal Aufzeichnung von kortikalen Neuronen bei 300-500 um Tiefe in Bezug auf Pia-Oberfläche. (B) Elektrode für juxtasomal Aufzeichnung von kortikalen Neuronen bei 1.500-1.800 um Aufzeichnungstiefe. Man beachte den Unterschied in der Kegellänge zwischen den Platten (A) und (B). (
2. Elektrophysiologische Eigenschaften während Biocytin Füllung. (A, B) Spontane Aktionspotentiale bei der Applikation von Rechteckimpulsen (200 ms EIN / AUS) mit einem positiven Strom, aber mit ungenügender Amplitude beobachtet, um das Neuron mit Biocytin laden. (C) Die Erhöhung der Stromamplitude Ergebnisse bei der Öffnung der neuronalen Membran ermöglicht Biocytin-Laden, in der Spur als Phase-Locked-Burst-Spicken während der Ein-Phase o sichtbarf die Impuls. (D) Die Spitzen-Wellenform während der Füllung zeigt eine erhöhte Breite und nach der Hyperpolarisation reduziert. Spike-Amplitude zu Amplitude normiert in B zum Vergleich Spitze. (E, F) Nach erfolgreicher Wiederherstellung der Neuronen im Anschluss an den Füll-Sitzung eine normale Spitzenbreite und Frequenz beobachtet werden. Spike-Amplitude zu Amplitude normiert in B zum Vergleich Spitze. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Biocytin-DAB Kennzeichnung von juxtasomally gefüllt Neuronen im primären somatosensorischen Kortex von Urethan-narkotisierten Ratten. (A) Pyramiden-Neuron in tangentialenBlick. Beachten Sie den Unterschied im Durchmesser prominente Größe der Dendriten und Axone. (B) Fast-Spiking Intern in Tangentialansicht. Beachten Sie die Perlen Struktur der Dendriten und Axone. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Digitale Rekonstruktion juxtasomally markierten Neurons. (A) Neuron Projektionsbild bei hoher Auflösung (aber geringer Vergrößerung) von 100 um tangentiale Scheibe der Schicht 6 Neuronen von Ratten primären somatosensorischen Kortex mit halbautomatischen Bild Pipeline erhalten. (B) Das gleiche Bild wie in (A) mit automatisierten digitalen Rekonstruktion überlagert (Axon in blau, dendrite in rot, beziehungsweise). (C) Bracket-Box von (B) in herausgezoomt, um die Zuverlässigkeit der axonalen Rekonstruktion mit juxtasomal Kennzeichnung zu veranschaulichen. Beachten Sie die Axon Boutons über die gesamte Länge des Axons, zwei Boutons sind durch schwarze Pfeile markiert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| mM | g / ltr | |
| 135 | NaCl | 7,8894 |
| 5.4 | KCl | 0,40257 |
| 1.8 | CaCl | 0,26464 | |
| 1 | MgCl 2 | 0,2033 |
| 5 | HEPES | 1,1915 |
| PH-Wert auf 7,2 mit NaOH | ||
| In 20 mg/ml-1 Biocytin |
Tabelle 1. Normale Ratten-Ringer mit Biocytin ergänzt.
| 8 mg | Cytochrom C aus Pferdeherzens |
| 8 mg | Catalase aus Rinderleber |
| 265 ul | 75 mg / ml DAB |
| Löst in 40 ml 0,05 M PB | |
| Filter und vorwärmen-Lösung bei 37 ° C | |
Tabelle 2. Lösung für Cytochrom C-Oxidase-Färbung.
| 1 Tropfen | Reagenz A |
| 1 Tropfen | Reagenz B |
| 0,5 ml | 10% Triton X100 |
| ight = "21" style = "height: 21px;"> löst in 9,5 ml 0,05 M PB (45 Minuten im Voraus) | |
| In 410 ul Lösung / Vertiefung | |
| Protokoll für die ABC-Lösung für eine 24-Well-Platte. | |
Tabelle 3. Lösung mit Standard-Vectastain ABC-Kit.
| 265 ul | 75 mg / ml DAB |
| 13,4 ul | 30% H 2 O 2 |
Tabelle 4. Lösung für DAB-Färbung.
| 6 g | Analytical Grade Glycerin |
| 2,4 g | Mowiol 4-88 |
| Manuelles rühren 10 min zu beschichten Mowiol mit Glycerin | |
| 6 ml | Destilliertes H 2 O |
| Inkubation bei RT für 2 h | |
| 12 ml | 0,2 M Tris pH-Wert 8,5 |
| Inkubation in 50 ° C im Wasserbad für 1 Stunde - O / N, gelegentlich umrühren | |
| Zentrifuge 15 min bei 5.000 g, aliquoten und bei -20 ° C | |
Tabelle 5. Mowiol-Lösung.
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Discussion
Die juxtasomal Verfahren ermöglicht die Aufnahme in vivo Aktionspotential Spicken von einzelnen Einheiten über Verhaltensbedingungen (narkotisiert, wach Kopf-fest oder frei zu bewegen) mit der Option der Biocytin-Beschriftung der aufgezeichneten Neuron für Post-hoc-Zelltyp Klassifizierung und / oder 3D-Rekonstruktion. Der große Vorteil ist, um physiologische Parameter in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration zu erhalten, noch in der Lage, das Neuron intrazellulär mit Biocytin 16,17,32 beschriften. Zusätzlich zur Kennzeichnung Biocytin, kann diese Technik verwendet werden, um Nervenzellen mit DNA, RNA, Proteine, oder Fluoreszenzfarbstoffe 33,34 injizieren. Der offensichtlichste Nachteil dieses Ansatzes ist vielleicht das Fehlen von visuellen Kontrolle des Markierungsqualität, und somit keine Möglichkeit zur Überprüfung der Kennzeichnung Qualität während des Experiments. Allerdings können Aufnahmebedingungen und insbesondere Aktionspotential Form verwendet werden, um den Erfolg der Markierungsverfahren zu beurteilen. Für instance, die Wahrscheinlichkeit der Wiederherstellung eines Neurons mit dichten Biocytin-DAB-Label zu, wenn die Aufstockfrequenz während Stromimpulse dramatisch erhöht, begleitet Verschwinden der Nach-Hyperpolarisation und Verbreiterung der Aktionspotentialwellenform (siehe Abbildung 2). Zusätzlich wird die Qualität der Biocytin-Kennzeichnung direkt an die summierte Länge der einzelnen Kennzeichnungseinheiten korreliert, so dass mehrere lang Füllung Einheiten (> 60 Sek.) in bessere histologische Qualität führen im Vergleich zu einem einzelnen kurzen Füll-Sitzung (<30 sec) . Schließlich wird die Überlebenszeit für die Tracer-Diffusionsmarkierungsintensität des distalen Kammern kritisch zu bestimmen. Im allgemeinen Überlebenszeit von 1 Stunde nach hochwertigen Elektroporation sorgt für ausreichende Kennzeichnung von Langstrecken-intrakortikale axonalen Projektionen. Ein Beispiel einer solchen langfristigen Projektionen sind Neuronen aus primären somatosensorischen Kortex zur sekundären somatosensorischen Kortex oder dysgranular vorstZonen damit auf Gebiete, die mehrere Millimeter weg von der Markierungsstelle sind 4,20 vorsteht. Wenn axonale Projektionen noch größeren Dimensionen (wie thalamokortikalen Vorsprünge) untersucht, sollte die Überlebenszeit 15 erhöht werden. Wichtig zu wissen ist, dass die Elektroporation des Neurons wird eine tiefgreifende Wirkung auf den physiologischen Zustand des Neurons durch zu hohe Natrium-Einstrom von der Elektrode Lösung zu haben. So ist es sehr zu empfehlen, Füllung vermischen Episoden mit Ruhe Episoden eine volle Deckung der Aktionspotential ermöglichen Spick-und Überwachungsaufnahmebedingungen nach dem Befüllen Sitzungen, wenn Biocytin darf entlang der dendritischen Verzweigungen und axonalen 12,31 diffundieren.
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Disclosures
Die authros haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Profs danken. Huibert Mansvelder und Bert Sakmann für umfangreiche Unterstützung, Dr. Marcel Oberländer für fruchtbare Diskussionen und die Bereitstellung neuronalen Tracing und Brendan Lodder für technische Unterstützung. Die Daten wurden mit Hilfe des ntrode VI für LabView, großzügig von Bruno R. (Columbia Univ., NY, USA) zur Verfügung gestellt erworben. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und des Bernstein Zentrums für Computational Neuroscience, Tübingen unterstützt (vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Zentrum für Neurogenomik und Kognitionsforschung (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), die Finanzierung zu CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 und ENC-Network # p3-c3) und der VU University Amsterdam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SM-6 control system | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, Austin, TX, USA | LabView acquisition software | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY | ||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
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