Summary
다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.
Abstract
많은 세포 과정은 multisubunit 단백질 복합체에 의해 제어된다. 자주하는이 단지는 일시적으로 형성하고 조립하는 네이티브 환경을 필요로합니다. 따라서, 이러한 기능성 단백질 복합체를 식별하기 위해서는 세포 용해 및 후속 정제 전의 생체들을 안정화시키는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 Drosophila의 배아에서 대형 선의의 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 용이하게 세포막을 통과 할 수 알데히드의 낮은 농도를 사용하여 생체 내 가교에 의해 배아 내부 복합체 배아 permeabilization과 안정화에 기초한다. 이어서, 관심의 단백질 복합체는 겔 정제하여 질량 분석계로 분석 immunopurified된다. 우리는 생식 개발을위한 필수적인 튜더 단백질 복합체의 정화를 사용하여이 방법을 보여줍니다. 작은 - 튜더 여러 튜더 도메인을 포함하는 큰 단백질이며,표적 단백질의 메틸화 아르기닌 또는 리신과 상호 작용 모듈. 이 방법은 다른 생물과 조직에서 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
multisubunit 단백질 어셈블리 및 DNA 또는 RNA-단백질 복합체의 분리는 단백질 복합체, DNA-결합 규제 단백질이나 RNA 결합 단백질의 RNA의 대상으로 인식 게놈 유전자 좌를 식별하기 위해 수행된다. 다른 방법은 특정 RNA 결합 단백질 (CLIP-서열) 2와 관련된 전사 인자 또는 염색질 단백질 (칩 - 서열) 1 RNA의 대상으로 인식 DNA 사이트의 게놈 전체의 식별을 할 수 있습니다. RNA 유래의 cDNA 또는 DNA의 대상 라이브러리는 다음 깊이 순서가됩니다. 이러한 방법은 화학 물질 또는 UV-유도 공부 착체의 단백질 성분에 대한 항체로 면역 침전 (IP)이어서 복합체를 안정화하는 가교를 사용한다.
생물체의 개발 과정에서 많은 단백질 복합체가 일시적으로 형성한다. 따라서, 어플을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생체 내에서 이러한 복합체 조성물 및 기능을 분석하는 데있어 매우 중요elopment. 이 상호 작용하는 구성 요소와 체외에서 세포의 생화학 적 환경의 기본 농도를 재현하는 것은 사실상 불가능하기 때문에 이러한 생체 분석은 체외 방법이 뛰어난 것입니다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 Drosophila의 배아에서 큰 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 생체 내 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법에서, 살아있는 배아 단백질 복합체는 저 알데히드 농도 및 후속 또한 단백질 복합체가 행 착체 및 질량 분광 분석의 겔 정제하여 착물의 알려진 성분에 대한 항체와 IP에 의해 절연되어 가교 아르 알 수없는 복잡한 구성 요소를 식별합니다. 포름 알데히드는 세포막을 투과 할 수 있으며, 2.3-2.7 3의 가교 범위를 가지고 있기 때문에, 단백질 복합체는 생체 내에서 가교 결합 될 수 있고, 복잡한 구성 요소는 서로에 근접 할 가능성이있다. 이 문서에 우리의예를 들어 튜더 (TUD) 단백질 복합체의 분리를 사용하여이 방법을 설명합니다. TUD는 생식 개발 4-7 필수적인 생식 단백질이다. 이 단백질은 다른 폴리 펩타이드 8-10의 메틸화 아르기닌 또는 라이신과 상호 작용하는 것으로 알려져 11 TUD 도메인이 포함되어 있습니다.
이전에, 우리는 기능 TUD 5 HA-태그를 표현하기 때문에, 특정 항-HA 항체 가교 후 TUD 단지를 아래로 당겨하는 데 사용되는 형질 전환 초파리 라인을 생성했다.
단백질 - 단백질 가교뿐만 아니라, 포름 알데히드는 핵산 - 단백질 가교를 생성 할 수 및 칩 SEQ 실험에 사용된다. 또한, 초파리, 포름 알데히드 가교 생체 내에서 바사 RNA 헬리 케이즈 단백질 (11)의 RNA 대상의 식별을 허용했다.
이 문서에서 우리는 생체 가교 PUR하는 방법을 설명하는 동안Drosophila의 배아에서 단백질 복합체의 ification,이 방법은 다른 생물과 조직에 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 큰 사과 주스 한천 플레이트를 준비
- 4 판을 만들려면, 1,000 ㎖의 플라스크에 375 ㎖의의 H 2 O, 12,375 g 플라이 한천 및 교반 막대를 추가합니다. 이 느슨하게 액체 제품에 대해 하나의 30 분 멸균 사이클에 덮인 플라스크의 뚜껑 믹스 A. 오토 클레이브 믹스입니다.
- 500 ㎖ 비커에 125 ㎖의 사과 주스, 12.5 g 테이블 설탕 및 교반 막대를 추가합니다. 믹스의 고압 증기 멸균이 완료 될 때까지 약 70 ° C의 교반 및 온도를 유지하면서 가열 된 플랫폼에서 혼합 B. 열 믹스 B입니다.
- 혼합이 완료되면 고압 증기 멸균, A. 부드럽게 결합 교반 유지 혼합하는 혼합 B를 전송하고 15 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 를 통해 냉각 및 방부제를 첨가하기 전에 결과 한천 응고하지 마십시오.
- 에탄올 10 % (중량 / 부피) 메틸 4 - 히드 록시 솔루션을합니다. 이 방부제 역할을합니다. 위의 사과 주스 한천의 혼합물에 용액의 3.75 ML을 추가합니다. anothe 교반 유지5 분 R.
- 각 300cm 2 플라스틱이나 스티로폼 판에 방부제와 125 ㎖의 사과 주스 한천 혼합물을 부어. 이 실온으로 냉각 및 응고 보자. 붓는 동안 기포의 형성을 피할 것.
참고 : 사과 주스 한천 플레이트 즉시 사용할 준비가 된 것입니다. 분명 랩으로 사용하지 않는 접시를 덮고 주까지 4 ℃에서 저장한다.
2. 초파리 배아의 수집 및 사전 가교 처리
- 배아가 수집 될에서 약 40,000 ~ 50,000 파리와 인구 케이지를 넣습니다.
- 두 접시 각 매체 (12) 표준 옥수수 가루-당밀 125 ㎖에 포함을 확인하고 각각의 접시에 건조 빵 효모의 약 4g을 뿌린다. 파리를 살찌하는 48 시간을위한 25 ° C의 배양기에서 인구 케이지에이 판을 놓습니다.
- 25 ° C.에 따뜻한 2 사과 주스 한천 플레이트 각 건조 빵 효모의 약 1g을 뿌려판. 0-1 시간 된 배아를 수집을 시작하는 인구 케이지의 2 판을 놓습니다.
- 1 시간 수집의 끝에서 접시를 꺼내. 컬렉션의 또 다른 라운드가 필요한 경우 2 개의 새 번호판으로 교체합니다.
- 플레이트를 커버하고 미세한 페인트 브러시로 부드럽게 배아를 재현 탁하기에 충분한 물을 추가합니다. 스테인리스 철망으로 만들어진이 층 체를 재현 탁 배아를 붓는다.
참고 : 상단 층이 배아를 통해시키면서 큰 플라이 부분을 수집 매체의 기공 크기 (850 μm의) 메쉬 만든다. 바닥 층은 효모와 물을 통해시키면서 배아를 수집 미세 메시 (75 μM)로 만든다. - 50 ML 튜브 및 미세 나일론 메쉬로 만든 컬렉션 바구니에 수집 된 배아를 전송하는 미세 페인트 브러시를 사용합니다. 물로 간단히 배아를 씻어 후 건조 종이 타월에 메쉬를 얼룩.
- 3 분 동안 부드러운 소용돌이와 50 %의 표백제에서 배아를 담근다. 철저한 린스LY 물에 남아있는 표백제를 제거합니다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
- (이것은 이상 30 초를 복용해서는 안된다) 15 초 동안 교반과 이소프로판올 또는 다중 배아 덩어리의 붕괴까지 dechorionated 배아를 담가. 완전히 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
- 재 부유를 유지하기 위해 배아에 헵탄을 스트리밍 할 수있는 피펫을 사용하는 동안 5 분 헵탄의 배아를 담근다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
- 3 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 (PBST)를 포함하는 인산염 완충 생리 식염수, 산도 7.4 (PBS)의 스트림으로 배아를 씻어.
- 컬렉션 바구니를 분해하고 10 ㎖의 PBST를 포함하는 15 ML 튜브에 메쉬와 함께 배아를 전송합니다. 메시 떨어져 배아를 씻어 부드럽게 튜브를 반전.
- 튜브에서 메시를 제거합니다. 수직 위치에 튜브를 넣어 태아가 중력에 의해 튜브의 바닥에 가라 앉을 수 있습니다.
참고 : 약 100-300배아 ㎕의 하나 케이지에서 1 시간 수집을 위해 예상된다. - PBST를 제거하고 즉시 가교 수행을 계속합니다.
수집 된 배아의 3. 생체 가교
- 사용 직전에 PBST에서 0.2 %의 포름 알데히드를 준비합니다. 배아에 포름 알데히드 정착액의 10 mL를 넣고 10 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다. 하루의 끝에서 사용하지 않는 정착을 폐기하십시오.
- 가교 반응을 켄 칭하고
- 가교의 끝에서, 배아는 튜브의 바닥에 가라하자.
- 포름 알데히드 용액을 제거합니다. 즉시 가교 반응을 종결 PBST 0.25 M 글리신 10 ㎖를 추가합니다. 5 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다.
- 배아가 튜브의 바닥에 가라하자. 급냉 솔루션을 제거합니다. PBST 10 ㎖로 3 회 배아를 씻으십시오.
- 완전히 P에게 제거피펫을 사용하여 BST 세척 솔루션입니다. -80 ° C까지 사용에 보관 배아.
4. 단백질 샘플 준비 및 면역 침전
- 2 ml의 용해 완충액에 다운스 균질화기를 사용하여 500 μL 가교 배아 균질화 (0.5 M 우레아, 0.01 % SDS, 2 % 트리톤-X 100, PBS 2 ㎜ 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 [PMSF] 및 프로테아제 억제제 칵테일).
참고 : 별도로 명시하지 않는 한 RT에이 다음과 같은 단계를 수행합니다. - 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 해물을 전송하고 부드럽게 철저한 용해를 보장하기 위해 15 분 동안 회전 플랫폼에 바위. 세포 파편 펠렛 5 분 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기. 깨끗한 15 ML 튜브에 뜨는을 저장합니다.
- 항-HA 아가로 오스 비즈가 뜨는에 슬러리 40 μl를 추가하고 2.5 시간 동안 회전 플랫폼에 품어.
- 5 분 2,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 뜨는을 제거하지만 APPRO를 남겨튜브 ximately 250 μL. 나머지 상층 액에 구슬을 재현 탁하고 10 μm의 기공 필터를 1.5 ml의 스핀 열을 전송할 수 있습니다.
- 10 초 동안 12,000 XG에 스핀 열을 원심 분리를 통해 흐름을 폐기하십시오.
- 200 μL 세척 버퍼 (0.1 M 글리신, 1 M의 NaCl, 1 % IGEPAL CA-630, 0.1 % 트윈 20, PBS에있는)를 추가하여 구슬을 씻으십시오. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리 및 세척을 버린다. 세척이 더 번 반복합니다.
- 비즈 40 μL 용출 버퍼 (2 ㎎ / ㎖ PBS에서 HA-펩타이드)를 추가하고 교반과 5 분마다 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리기 및 용출액을 수집합니다.
- 항-HA 항체 (13)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의한 복합의 용출을 확인합니다.
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Representative Results
웨스턴 블롯 하였다 (도 1에 도시) 7 % 단계 겔 (도 2) - 가교 결합의 효과와 가교 TUD 단백질 착물의 정제는 성공적으로 3 %의 SDS-PAGE로 분석 하였다.
3 %를 사용하는 목적 - 7 % 스텝 겔 착물 잔존 미가 교 TUD 단백질 농도에서 가교 TUD 단백질 복합체의 효과적인 분리를 기반으로한다. 상기 우리 생체 가교 조건 하에서, TUD 단백질의 큰 비율은 미가 교 여전히 남아 있었다. 이 무료 TUD 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리 될 때까지 IP 동안 가교 복합체 copurify 것이다. 분명 유지하지 않고 7 % 국경 - 크기가 큰, TUD 단백질을으로 가교 있지만 (285 kDa의)은 3 %에 걸쳐 마이그레이션합니다. 큰 분자량 가교 TUD 단백질 복합체는 어려움이 일의 결과로, 젤 국경을 넘어 이주를해야합니다 반면전자 단지는 무료 TUD 단백질에서 분리, 따라서 "갇혀"와 국경 근처의 테두리 또는 "미행"에 집중 되 고.
적절한 컨트롤의 포함이 가교 프로토콜의 특이성을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 가교 결합 정도를 모니터링 할 HA-태그 된 GFP 단백질 (14)을 발현하는 배아를 사용했다. 결과 (0.1 % - 0.5 %)의 HA-태그 GFP 및 부품을 표현 배아에 - (2 % 0.1 %) 우리는 다른 포름 알데히드 농도의 파일럿 실험을 수행 한 (그림 3) 여기에 표시됩니다. 그것은 우리의 가교 프로토콜은 임의의 주변 분자 가교 표적 단백질을하지 않는다는 것을 검증하는 처리 된 배아에서 GFP 단백질 (최대 0.5 % 포름 알데히드)의 절대 다수가 비가 교 남아 있음을 알 수있다. uncr에 비해 특히, 0.2 % 포름 알데히드를 처리 (도 3, 레인 5 및 6) 임의의 가교 결합 된 제품을 나타내지 않았다또한이 프로토콜에 0.2 %의 포름 알데히드의 우리의 선택을 정당화 영화의 확장 된 노출 시간에도 불구하고 osslinked 제어 (그림 3, 레인 1과 2). 함께 TUD 복잡한 시료가 IP를 다음과 7 % 스텝 겔 - 그러나, GFP 제어 배아 항상 동일한 조건으로 제어 GFP 단백질 샘플 아래 TUD 복잡한 가교와 병렬로 가교 결합되어야은 3 %에서 실행되어야한다. 또, TUD 착체와 대응 GFP 컨트롤 3 % 양 - 7 % 겔 구역 절제되어야하고 TUD 복합체 밴드와 GFP 제어 모두 존재할 것이다 가양 후보를 결정하기 위해 질량 분석기 분석을 위해 제출했다.
생체 내에서 가교 결합 효과는 미가 교 각각 제어 배아 가교 샘플 (도 2A)로부터 자유 TUD 단백질과 TUD 착체를 비교하여 결정 하였다. 거의 exclusivel 비가 교 제어 배아에서 무료 TUD 단백질국경 지역 (그림 2A, 1 레인) 근처에 유지하여 최소한 7 % 국경 - y는 3 %에 걸쳐 마이그레이션. 7 % 겔 테두리 (도 2A의 레인 2) - 그 반대로, 가교 결합 된 배아는 3 %로 큰 분자량 TUD 가교 결합 된 복합체의 존재를 보여 주었다. 이것은 분명히 우리의 가교 절차가 성공적으로 생체 내에서 상호 작용하는 파트너 (그림 2A 레인 1 비교 2)에 총 TUD 단백질의 약 50 %를 가교 것으로 나타났다.
HA-펩타이드와 경쟁 용출 성공적인 정화를 확인하고 정제 된 TUD의 단백질 복합체 (그림 2B)의 특이성을 강화했다. 7 %의 국경 지역도 무료 TUD 단백질 (그림 2B, 1 레인) - HA-펩타이드에 의한 용출 분획은 3 %에 집중 복잡한 포함되어 있습니다. 다음 SDS 샘플 버퍼 용출 TUD는 (비즈 TUD 단지의 최소 금액에 남아있는 대부분 무료
. 3 %도 1 다이어그램 -. SDS-PAGE에 사용 7 % 스텝 겔 3 % - 7 % 스텝 겔 수동 세 층을 포함하는 방식으로 캐스트된다. 위에서 아래로, 그 층은 3 % 스태킹 겔, 3 % 분리 젤 7 % 분리 젤입니다. 이 원고에 사용 된 미니 프로 테우스 시스템 (바이오 래드)로 작업하려면, 3 % 분리 젤의 높이도에 도시 된 바와 같이 약 1cm로 만들어졌다.
참고 : 3 % 스태킹 젤 3 % 분리 겔 층이 젤을 처리 할 때 그래서이 층의 왜곡을 방지하기 위해 특별한주의를 사용하여 충격에 약합니다.
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.. 그림 2 가교 배아 및 제어 배아의 해물과 IP 패널 A, 레인 1 튜더의 단백질 복합체의 정화의 서양 얼룩 결과, 비가 교 제어 배아의 조단백질 해물; 레인 2, 포름 알데히드 가교 배아에서 조단백질 해물. 패널 B, 레인 1, 가교 배아 해물에서 IP 후 HA-펩타이드에 의한 용출; 레인 2, 초기 HA 펩타이드 용출 후에 2 개의 x SDS 시료 완충액 용출. SDS-PAGE는 3.5 시간 동안 200 V에서 실행되었습니다. 항-HA 항체 (1:1000)를 웨스턴 블롯에 사용 하였다.
그림 3. HA-태그 GFP를 표현하는 가교 배아 및 제어 배아의 웨스턴 블롯 결과. 레인 1, 조단백질 해물 오F 비가 교 제어 태아에게; 레인 1 만 배의 금액과 동일 차선 2,; 레인 3, 0.1 % 포름 알데히드를 사용하여 가교 결합 된 배아의 조단백질 파쇄물; 레인 3 만 양의 두 배와 같은 레인 4,; 레인 5, 0.2 % 포름 알데히드를 사용하여 가교 배아의 조단백질 해물; 레인 5 만 양의 두 배와 같은 차선 6; 레인 12, 0.3 %의 포름 알데히드를 사용하여 가교 결합 된 배아의 조단백질 파쇄물; 레인 7 만 양의 두 배와 같은 레인 8. 레인 9, 0.5 % 포름 알데히드를 사용하여 가교 결합 된 배아의 조질 용 해물. 15 % 그라데이션 젤 - SDS-PAGE는 4 %에서 45 분 동안 200 V에서 실행되었습니다. 항-HA 항체 (1:1000)를 웨스턴 블롯에 사용 하였다.
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Discussion
포름 알데히드는 일반적으로 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산 상호 작용을 식별하기위한 가교제로서 사용되고있다. 함께 하류 질량 분석 절차와 호환성과의 우수한 용해도 및 세포막 투과성은, 세포 내 가교 애플리케이션 3,15-17 알데히드 이상적인 후보 약제 만든다. 특히, 성공적 바사, 초파리 (11)에서 중요한 생식 세포 RNA 헬리 카제와 관련된 mRNA를 식별하는 데 사용되었다. 가까이에 존재하는 단 분자 표적 단백질의 상호 작용 파트너의 특이성을 강화하고, 적절한 조건 하에서 가교 결합 될 수 있음을 의미 시판 가교제들 - (2.7 2.3), 또, 포름 알데히드는 최단 스페이서 아암 중 하나가 여기 . 상술 된 이유로, 포름 알데히드는 우리 프로토콜 가교제로서 선택되었다. 그러나,이 U이 제외 안된다Drosophila의 배아에 대한 생체 내 응용 프로그램의 다른 가교제의 sefulness. 그러나, 우리는 더 명백 TUD는 디티 오비스 (숙신 이미 딜 프로 피오 네이트) (DSP), 자주 연구에서는 포름 알데히드를 대체하기 위해, 칩 분석법 17,18 포름 알데히드와 병용 N-히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 에스테르 계열의 가교제를 사용하려하지했지만 복잡한이 한편이 가교제로 얻은 DSP는 사례별로 결정해야합니다 다른 단백질 복합체에 효과적 일 수 있습니다. 배아 추출물을 만들었다 후 생체 가교 방법 외에도 bismaleimidohexane (BMH) 패밀리로부터 체외 가교제는 초파리 배아 14,19에 단백질 - 단백질 상호 작용을 캡쳐하는 효과가 도시되어 있지만, 이러한 실험에서 가교가 발생했습니다.
가교 시간, 온도 및 포름 알데히드의 농도는 세 가지 주요 FAC 아르가교 효율에 영향을 TORS. 우리의 프로토콜은 각각의 개별 요소에 대한 파일럿 실험 가교 복합체의 특이성과의 위험 사이의 균형을 유지하면서, 따라서 그것은, TUD 단백질의 가교 결합 및 생체 내 초파리 배아에서의 상호 협력을 위해 최적화 된를 사용하여 시험되었다 특이 분자를 가교. 비특이적 가교 컴플렉스의 오탐 (false positive)의 존재에 이르게하고 신중하게 우리의 실험에 사용 된 예 GFP를 위해, 관련이없는 단백질 컨트롤을 제어 할 수 있어야합니다. 또, 최적의 가교 조건이 상이한 타겟 분자로 변할 수있다. 따라서, 시작점, 최적의 가교 시간, 온도 및 포름 알데히드의 농도로 우리 프로토콜을 사용하는 것은 또한 관련 단백질 복합체에 대해 결정되어야 할 것이다.
최적의 가교 조건이 설정되면 그것은 FO하는 것이 중요합니다정확하게 배아 비특이적 가교 결합을 최소화하기 위해 가교 결합 할 때마다 그들을 llow. 추가 중요한 단계는 배아 추출물의 구슬 관련이없는 단백질의 비특이적 결합을 줄이기 위해 높은 염화나트륨의 농도 (1 M) 두 세제 (IGEPAL CA-630 트윈 20)와 IP 후 구슬을 세척한다.
우리 프로토콜은 표적 단백질과 IP 중에 단백질 복합체를 풀다운하기 위해 사용 된 항체 사이의 친화력에 의존한다. 따라서, 표적 단백질의 항체의 항원 가교에 의해 파괴되지 않아야하고 IP 동안 항체에 액세스 할 수 있어야합니다. 또, 항체 표적 단백질 상호 작용은 비특이적 백그라운드 단백질의 감소를 목표 엄격한 세척을 견딜 것. 성공적인 IP에 대한 이러한 요구 사항은 특정 항체 - 항원의 조합을 사용 하나를하지 못할 수도 있습니다, 그러나, 그것은 관심의 단백질에 적합한 항체 - 항원 쌍을 발견 할 수 있어야한다. 특히, HA-태그 에피토프 및 대응하는 항체가 성공적으로이 프로토콜에 사용되었습니다.
기술 된 프로토콜은 상이한 발육 단계 동안 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 다른 조직에서 사용될 수있다. 우리가 초파리이 방법을 보여줍니다 있지만, 우리의 프로토콜은 다른 생물에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는이 연구와 기술적 도움 요르단 데이비스, 야니 린, 에릭 샤 들러와 Jimiao 청 감사합니다. 이 작품은 ALA에 MCB-1054962에게 부여는 NSF 경력에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
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