Summary
Многокомпонентные белковые комплексы играют важнейшую роль в процессе клеточного функции и развития. Здесь мы описываем способ, используемый для изоляции нативные белковые комплексы из эмбрионов Drosophila после сшивания в естественных условиях с последующей очисткой сшитых комплексов для последующего анализа структуры и функции.
Abstract
Многие клеточные процессы управляются мультисубъединичных белковых комплексов. Часто эти комплексы образуют временно и требуют родную среду собираться. Поэтому идентифицировать эти функциональных белковых комплексов важно стабилизации им в естественных лизиса до и последующем очистки. Здесь мы опишем метод, используемый для выделения больших добросовестных белковые комплексы из эмбрионов дрозофилы. Этот метод основан на эмбриона проницаемости и стабилизации комплексов внутри эмбрионов в естественных условиях по сшивки с использованием низкую концентрацию формальдегида, который может легко через клеточную мембрану. Затем белковый комплекс, представляющий интерес, иммунологически последующей гелевой очисткой и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Проиллюстрируем этот метод, используя очистку белкового комплекса Tudor, что очень важно для развития зародышевой линии. Тудор большой белок, который содержит несколько доменов Тудор - маленькиймодулей, которые взаимодействуют с метилированных аргинина или лизина целевых белков. Этот способ может быть адаптирован для выделения нативных белковых комплексов из различных организмов и тканей.
Introduction
Выделение мультисубъединичных белковых агрегатов и ДНК-или РНК-белковых комплексов выполняется для выявления белковых комплексов, геномной локусов признанный ДНК-связывающих регуляторных белков или РНК-мишеней РНК-связывающих белков. Различные методы позволяют генома выявления участков ДНК, признанных факторов транскрипции или белков хроматина (чип-SEQ) 1 и РНК-мишеней, связанных с данным РНК-связывающего белка (CLIP-след) 2. Библиотеки РНК, полученных кДНК или целей ДНК затем глубоко секвенировали. Эти методы используют химическую или ультрафиолетовым излучением сшивания для стабилизации комплексов с последующим иммунопреципитации (IP) с антителом против белкового компонента исследуемого комплекса.
Во время развития организма, многие белковые комплексы образуют временно. Поэтому, крайне важно проанализировать состав и функции этих комплексов в естественных условиях, чтобы понять молекулярные механизмы, которые управляют Development. Такой анализ в естественных условиях было бы лучше, экстракорпоральное подхода в так как практически невозможно воспроизвести родной концентрации взаимодействующих компонентов и сотовой биохимической среде в пробирке. Здесь мы продемонстрировать естественных условиях подход в том, что мы успешно использовать для изоляции больших белковых комплексов из эмбрионов дрозофилы. В этом способе белковые комплексы в живых эмбрионов сшиты с низкой концентрацией формальдегида и впоследствии белковые комплексы, представляющие интерес, выделяют IP с антителом против известного компонента комплексов с последующим очисткой на геле комплексов и масс-спектрометрического анализа в идентифицировать неизвестные сложные компоненты. Так как формальдегид способен проникать через клеточную мембрану и имеет сшивающий спектр 2,3-2,7 A 3, белковые комплексы могут быть сшиты в естественных условиях и сложные компоненты, вероятно, будут близки друг к другу. В этой статье мыописать этот метод, используя изоляцию Тудор (Tud) белкового комплекса в качестве примера. Tud является зародышевой линии белок, который имеет важное значение для развития зародышевой линии 4-7. Этот белок содержит 11 TUD домены известных взаимодействовать с метилированных аргинина или лизина других полипептидов 8-10.
Ранее мы сформировали трансгенного Drosophila линию, выражающую HA-меткой функциональная Tud 5 и поэтому, конкретных анти-HA антитела используется для снести TUD комплекс после сшивания.
В дополнение к белок-белковых сшивок, формальдегид может генерировать нуклеиновых кислот белковых сшивок и используется в чип-след экспериментов. Кроме того, у дрозофилы, в естественных условиях сшивания с формальдегидом позволило выявить РНК цели Васа РНК геликазы белка 11.
В то время как в этой статье мы опишем метод в естественных условиях сшивки и пурфикация белковых комплексов из эмбрионов Drosophila, этот метод может быть адаптирован для других организмов и тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка большая яблочный сок-агаром
- Чтобы 4 пластины, добавить 375 мл Н 2 О, 11.25 г летучей агар и мешалку, чтобы колбу 1000 мл. Это Mix А. автоклав Mix с крышкой колбу неплотно закрывают на один цикл 30 мин-стерилизации жидких товаров.
- Добавить 125 мл яблочного сока, 12,5 г столового сахара и мешалку в 500 мл стакан. Это Смесь Б. тепловой Mix B в нагретую платформу при перемешивании а поддерживать температуру ° приблизительно 70 C пока автоклавирование смешивать никогда закончено.
- После завершения Mix автоклаве, трансфер Mix B Смешать А. Продолжайте размешивать комбинированную смесь аккуратно и дайте ему остыть в течение 15 минут. Избегать чрезмерно охлаждения и затвердевания агара в результате перед добавлением консерванта.
- Сделать 10% (масса / объем) метил-4-гидроксибензоата раствор в этаноле. Это будет действовать в качестве консерванта. Добавить 3,75 мл раствора к вышеуказанному яблочный сок-агар смеси. Продолжайте размешивать для соседнийг 5 мин.
- Налейте 125 мл яблочного сока-агар смеси с консервантом в каждой 300 см 2 пластика или пенополистирола пластины. Пусть ему остыть до комнатной температуры и затвердеть. Избегайте формирования пузырьков воздуха при заливке.
Примечание: яблочный сок-агаром готовы сразу же использовать. Обложка неиспользуемые пластины с четкими обертывания и хранить при температуре 4 ° С в течение до недели.
2. Дрозофилы эмбрионов и Pre-сшивки Лечение
- Загрузите клетку населения с примерно 40.000 до 50.000 мух, из которых будут собраны эмбрионы.
- Сделать две тарелки каждый из которых содержит 125 мл стандартных фуражное зерно-патоки среднего 12 и посыпать примерно 4 г дрожжей сушат пекаря на каждой пластине. Поместите эти пластины в клетку населения в 25 ° C инкубаторе в течение 48 часов, чтобы откормить мух.
- Теплые 2 яблочный сок-агаром до 25 ° С. Посыпать примерно 1 г дрожжей сушат пекаря на каждомпластина. Поместите 2 тарелки в клетке населения, чтобы начать собирать 0-1 HR-старый эмбрионов.
- Вынуть пластины в конце сбора 1 час. Замените 2 новых пластин, если другой раунд сбора не требуется.
- Добавить достаточно воды, чтобы покрыть пластины и ресуспендируйте эмбрионов осторожно тонкой кистью. Налейте ресуспендированные эмбрионов через два слоя сито, изготовленные из нержавеющей стали проволочной сетки.
Примечание: Верхний слой изготовлен из среднего размера пор (850 мкм) сетки, который собирает большую часть мух, позволяя через эмбрионов. Нижний слой сделан из мелкой сеткой (75 мкм), который собирает эмбрионов, позволяя через дрожжей и воды. - Используйте тонкую кисть, чтобы передать собранные эмбрионов в корзину для сбора, полученного с 50 мл трубки и тонкой нейлоновой сетки. Промыть эмбрионы кратко водой, затем промокните сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
- Погрузитесь эмбрионов в 50% гипохлоритом натрия с нежным закрученного в течение 3 мин. Промыть тщательнолы с водой для удаления остатков отбеливателя. Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
- Погрузите dechorionated эмбрионов в изопропанола при легком помешивании в течение 15 сек или до пробоя нескольких эмбрионов сгустки (это не должно занять больше времени, чем 30 сек). Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы полностью высохнуть.
- Погрузитесь эмбрионов в гептана в течение 5 мин, пока с помощью пипетки, чтобы поток гептан за эмбрионов, чтобы держать их Ресуспендированный. Пятно сетку на бумажные полотенца, чтобы высохнуть.
- Промыть эмбрионы с потоками забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4 (PBS), содержащим 0,1% Тритон Х-100 (PBST) в течение 3 мин.
- Разберите корзины сбора и передачи эмбрионов вместе с сеткой в 15 мл пробирку, содержащую 10 мл PBST. Переверните пробирку осторожно мыть эмбрионов от сетки.
- Удалить сетку из трубки. Поместите трубки в вертикальном положении, и пусть эмбрионы опускаются на дно трубки под действием силы тяжести.
Примечание Приблизительно 100 - 300мкл эмбрионов, как ожидается, для коллекции 1 час от одной клетки. - Снимите PBST и продолжать выполнять сшивания сразу.
3. В естественных условиях Сшивание Сборник эмбрионов
- Подготовка 0,2% формальдегида в PBST непосредственно перед использованием. Добавьте 10 мл формальдегида фиксатором для эмбрионов и инкубировать при 25 ° С при осторожном перемешивании на роторном шейкере в течение 10 мин. Отбросить неиспользуемые фиксатор к концу дня.
- Quench реакцию сшивания
- В конце сшивки, пусть эмбрионы опускаются на дно пробирки.
- Снимите раствор формальдегида. Сразу добавляют 10 мл 0,25 М глицина в PBST для гашения реакции сшивания. Инкубируют при 25 ° С при осторожном перемешивании на роторном шейкере в течение 5 мин.
- Пусть эмбрионы опускаются на дно пробирки. Снимите закалки решение. Вымойте эмбрионов с 10 мл PBST три раза.
- Полностью удалить рBST промывочного раствора с помощью пипетки. Магазин эмбрионы при -80 ° С до использования.
4. Белок Подготовка образцов и Иммунопреципитация
- Однородный 500 мкл сшитые эмбрионов с использованием гомогенизатора Даунса в 2 мл лизирующего буфера (0,5 М мочевины, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 мМ фенилметансульфонилфторид [PMSF] и коктейль ингибиторов протеаз в PBS).
Примечание: Выполните это и следующие шаги при комнатной температуре, если не указано иное. - Перенести лизата до 1,5 мл центрифужные пробирки и осторожно встряхнуть на вращающейся платформе в течение 15 мин, чтобы обеспечить тщательное лизис. Центрифуга лизат при 16000 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток. Сохранить супернатант в чистую пробирку 15 мл.
- Добавить 40 мкл анти-HA агарозы суспензии к супернатанту и инкубировать на вращающейся платформе в течение 2,5 часов.
- Гранул шарики центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант, но оставить соответствуюximately 250 мкл в трубке. Ресуспендируют бусины в оставшейся супернатанта и трансфер в спин колонки 1.5 мл с пор фильтра 10 мкм.
- Центрифуга столбец отжима при 12000 мкг в течение 10 сек и отбросить поток через.
- Промыть шарики путем добавления 200 мкл промывочного буфера (0,1 М глицина, 1 М NaCl, 1% Igepal CA-630, 0,1% Твин-20, в PBS). Центрифуга столбец при 12000 мкг в течение 10 сек и выбросьте стирки. Повторите стирке еще два раза.
- Добавить 40 мкл буфера для элюции (2 мг / мл HA-пептид в PBS) с гранулами и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин при осторожном перемешивании каждые 5 мин. Центрифуга столбец при 12000 мкг в течение 10 сек и собирать элюата.
- Подтвердите вымывание комплекса по Вестерн-блот анализ с использованием анти-HA антитела 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность сшивки и успешное очистка сшитого белкового комплекса Туд анализировали с помощью SDS-PAGE на 3% - 7% геле (шаг, показанном на фиг.1) с последующим вестерн-блоттинга (фиг. 2).
Цель с помощью 3% - 7% шага гель на основе эффективного разделения сшитого белкового комплекса Туд от остающегося несшитых белка Туд и концентрации комплекса. По нашим в естественных условиях, упомянутых выше условиях сшивания, большая часть Туд белка может по-прежнему остаются несшитый. Этот свободный белок Tud не будет copurify с сшитого комплекса во время ИС до разделения по SDS-PAGE. Хотя большого размера, несшитых TUD белок (285 кДа) мигрирует через 3% - 7% границы без очевидного сохранением. В то время как сшитый белковый комплекс Tud с большим молекулярным весом будет трудно мигрирующих через границу гель, в результате чего гоэ комплекс «неловушечности" и концентрировали на границе или "хвостов", недалеко от границы, и поэтому, отделившись от свободного белка Туд.
Включение должного контроля имеет решающее значение для проверки специфичности этого протокола сшивания. Поэтому мы использовали эмбрионы, выражающие HA-меткой GFP белка 14 для мониторинга степень сшивания. Мы провели пилотные эксперименты различных концентрациях формальдегида (0,1% - 2%) на эмбрионах, выражающих HA-меткой GFP и часть результатов (0,1% - 0,5%) показаны здесь (рис. 3). Очевидно, что абсолютное большинство GFP белка в обработанных эмбрионов (до 0,5% формальдегида) оставалась несшитой, что подтверждено, что наш протокол сшивание не сшивки белка-мишени для случайных окружающих молекул. В частности, 0,2% формальдегида лечение (фиг. 3, дорожка 5 и 6) не показали каких-либо сшитых продуктов по сравнению с UNCRosslinked управления (рис. 3, полоса 1 и 2), несмотря на длительное время экспозиции пленки, что еще оправдано наш выбор 0,2% формальдегида в этом протоколе. Однако эмбрионы управления GFP всегда должны быть сшиты параллельно с Туд сложной сшивания при тех же условиях и образцов белка управления GFP должен быть запущен на 3% - 7% шага геля вместе с Tud сложные образцы следующих IP. Кроме того, как комплекс Tud и соответствующий контроль GFP 3% - 7% области гель должны быть изъяты и представлены для масс-спектрометрического анализа, чтобы определить, ложноположительные кандидатов, которые будут присутствовать в обоих Туд сложной полосы и контроля GFP.
Эффективность в естественных условиях сшивания определяли путем сравнения свободного белка TUD и TUD комплекс из несшитых контроля и сшитых образцов эмбрионов соответственно (рис. 2а). Бесплатный Tud белок из несшитых контрольных эмбрионов почти exclusivelу мигрировали через 3% - 7% границы с минимальным количеством остаточного вблизи приграничной зоне (рис. 2А, дорожка 1). В противоположность этому, сшитые эмбрионы показали наличие большой молекулярной массой Туд сшитого комплекса на 3% - гель границе 7% (рис. 2, дорожка 2). Это ясно показывает, что наша процедура сшивания успешно сшитые примерно 50% от общего белка Туд с его в естественных условиях взаимодействующих партнеров (ср. рис 2а дорожка 1 и 2).
Конкурсная элюирование HA-пептида подтвердил успешную очистку и укрепление специфику очищенного белкового комплекса Туд (рис. 2В). Вымывание доля на HA-пептида содержится комплекс концентрируется вокруг 3% - пограничной области 7%, а также бесплатный TUD белок (рис. 2В, дорожка 1). Ниже буфер образец SDS элюировали основном бесплатно Tud оставаясь на шариках и минимальным количеством Туд комплекса (
. Рисунок 1 Схема 3% -. 7% шага геля, используемого для SDS-PAGE 3% - 7% шаг гель вручную литой таким образом, что она содержит три слоя. От верха до низа, эти слои 3% концентрирующий гель, 3% разделения гель и 7% разделения гель. Для работы с мини-Превращение системы (Bio-Rad), используемого в этой рукописи, высота 3% разделяющей геля было сделано, чтобы быть примерно на 1 см, как показано на схеме.
Примечание: 3% концентрирующий гель и 3% разделительные слои геля очень хрупкие, поэтому используйте дополнительные меры предосторожности при обращении гель для предотвращения искажения этих слоев.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. Рисунок 2 Западные результаты блот сшитых эмбрионов и контрольных эмбрионов лизатов и очистки белкового комплекса Tudor по IP панели А, переулок 1, сырого протеина лизат несшитых контрольных эмбрионов.; дорожка 2, сырого протеина лизата от формальдегида сшитых эмбрионов. Панель В, полоса 1, элюирования по HA-пептида после ИС от сшитого эмбриона лизата; дорожка 2, элюирование от 2 х SDS образцового буфера после первоначального HA-пептида элюции. SDS-PAGE проводили при 200 В в течение 3,5 часов. Анти-HA антитела (1:1000) использовали вестерн-блоттинга.
Рисунок 3. Вестерн-блот результаты сшитых эмбрионов и контрольных эмбрионов, выражающих HA-меткой GFP. Дорожка 1, сырого протеина лизата ое несшитые контрольных эмбрионов; дорожка 2, так же, как переулок 1, но два раза больше; полоса 3, сырого протеина лизата сшитых эмбрионов с использованием 0,1% формальдегида; переулок, 4, такой же, как переулок 3, но два раза больше; дорожка 5, сырого протеина лизата сшитых эмбрионов с использованием 0,2% формальдегида; дорожка 6, так же, как переулок 5, но два раза больше; дорожка 7: сырого протеина лизата сшитых эмбрионов с использованием 0,3% формальдегида; полоса 8, так же, как переулок 7, но два раза больше. Lane 9, сырой лизат из сшитых эмбрионов с использованием 0,5% формальдегида. SDS-PAGE проводили при 200 В в течение 45 мин в 4% - 15% градиентном геле. Анти-HA антитела (1:1000) использовали вестерн-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Формальдегид широко применяется в качестве сшивающего реагента для выявления белок-белковых взаимодействий и белок-нуклеиновая кислота. Его хорошую растворимость и проницаемость клеточной мембраны вместе с совместимостью с процедурами ниже по течению масс-спектрометрии, чтобы формальдегид идеальным кандидатом агент для сшивания внутриклеточных приложений 3,15-17. В частности, он был успешно использован для идентификации мРНК, связанные с Vasa, критической зародышевых клеток РНК геликазы у дрозофилы 11. Кроме того, формальдегид имеет один из самых коротких ножек (2.3 - 2.7) среди имеющихся в продаже сшивателей, что предполагает, что только молекулы, которые существуют в непосредственной близости будут сшиты в надлежащих условиях, укрепление специфику взаимодействующих партнеров белка-мишени . По причинам, указанным выше, формальдегид был выбран в качестве сшивающего агента в нашей протокола. Тем не менее, это не должно исключать Usefulness других сшивающих агентов в естественных условиях применения в течение эмбрионов дрозофилы. Тем не менее, мы не пытались использовать дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), N-гидроксисукцинимид (NHS) эфир семья сшивающего часто используется в комбинации с формальдегидом в ChIP анализов 17,18, заменить формальдегид в нашем исследовании, но никакого очевидного Tud Комплекс был получен с этим сшивателя С другой стороны, DSP может быть эффективным для других белковых комплексов, которые необходимо будет определяться на случая к случаю. В дополнение к в естественных условиях сшивания подхода, сшивающие в пробирке из bismaleimidohexane (ВМН) семьи, как было показано, чтобы быть эффективным в захвате белок-белковых взаимодействий в дрозофилы эмбрионов 14,19, однако, в этих экспериментах сшивание произошло после были сделаны эмбрион экстракты.
Время сшивания, температура и концентрация формальдегида являются три основных факТЗ, которые влияют сшивания эффективность. Наш протокол был протестирован с использованием контрольных экспериментов для каждого отдельного фактора, поэтому, было оптимизировано для сшивания Туд белка и его взаимодействующих партнеров в эмбрионах дрозофилы в естественных условиях, сохраняя при этом баланс между спецификой сшитого комплекса и риском сшивания неспецифические молекулы. Неспецифическое сшивание приводит к наличию ложных срабатываний в комплексе и необходимо тщательно контролировать с несвязанной управления белка, например, GFP, который был использован в наших экспериментах. Кроме того, оптимальные условия сшивающие может изменяться в зависимости от молекул-мишеней. Таким образом, с помощью нашего протокола в качестве отправной точки, оптимального времени сшивки, температуры и концентрации формальдегида должны быть определены для данного белкового комплекса, представляющего интерес.
Как только оптимальные условия сшивания устанавливаются очень важно FOLlow их точно каждый раз эмбрионы сшитый чтобы свести к минимуму неспецифическое сшивание. Дополнительная важным шагом является промывки гранул после ИС с высокой концентрацией NaCl (1 м) и двух моющих средств (IGEPAL CA-630 и Твин-20), чтобы уменьшить неспецифическое связывание несвязанных белков из эмбриональных экстрактов с гранулами.
Наш протокол зависит от высоким сродством между белком-мишенью и антитела, используемого снести белкового комплекса во IP. Таким образом, антитело эпитоп в белке-мишени не должны быть уничтожены путем сшивки и должны быть доступны для антитела в течение IP. Кроме того, взаимодействие белка антитело-мишень должна выдерживать жесткие моет, направленные на снижение неспецифических фоновых белков. Эти требования для успешного IP может помешать один из использованием определенной комбинации антитело-эпитоп, однако, она должна быть возможность найти подходящее антитело-эпитоп пара для белка, представляющего интерес. В частности, эпитоп HA-тег и соответствующий антитела были успешно использованы в данном протоколе.
Описанный протокол может быть использован для выделения нативных белковых комплексов на разных стадиях развития и в различных тканях. Хотя мы показали, этот метод для Drosophila, наш протокол может быть адаптирован для других организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Иордания Дэвис, Яньнянь Лин, Эрик Schädler и Jimiao Чжэн за техническую помощь в этом исследовании. Эта работа была поддержана NSF КАРЬЕРА предоставить MCB-1054962 для ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
