Summary
Flerkomponentproteinkomplex spelar avgörande roller under cellfunktion och utveckling. Här beskriver vi en metod som används för att isolera nativa proteinkomplex från Drosophila embryon efter in vivo tvärbindning, följt av rening av de tvärbundna komplex för efterföljande analys struktur-funktion.
Abstract
Många cellulära processer regleras av multisubunit proteinkomplex. Ofta dessa komplex bildar övergående och kräver ursprungliga miljö att montera. Därför, för att identifiera dessa funktionella proteinkomplex, är det viktigt att stabilisera dem in vivo före cellys och efterföljande rening. Här beskriver vi en metod som används för att isolera stora seriösa proteinkomplex från Drosophila embryon. Denna metod är baserad på embryo permeabilisering och stabilisering av komplexen inuti embryon genom in vivo tvärbindning med användning av en låg koncentration av formaldehyd, som lätt kan korsa cellmembranet. Därefter proteinkomplexet av intresse immunrenades följt av gelrening och analyserades genom masspektrometri. Vi illustrerar denna metod med rening av en Tudor proteinkomplex, vilket är avgörande för könsceller utveckling. Tudor är ett stort protein, som innehåller flera Tudor domäner - smallmoduler som interagerar med denaturerad argininer eller lysiner av målproteiner. Denna metod kan anpassas för isolering av nativa proteinkomplex från olika organismer och vävnader.
Introduction
Isolering av multisubunit protein församlingar och DNA-eller RNA-proteinkomplex utförs för att identifiera proteinkomplex, genomisk lokus igen av DNA-bindande regulatoriska proteiner eller RNA-mål av RNA-bindande proteiner. Olika metoder tillåter genomet hela identifiering av DNA-platser som känns igen av transkriptionsfaktorer eller kromatin proteiner (Chip-punkter) 1 och RNA-mål i samband med en given RNA-bindande protein (CLIP-seq) 2. Biblioteken i RNA-härledda cDNA eller DNA-målen sedan djupt sekvens. Dessa metoder använder kemiska eller UV-inducerad tvärbindning för att stabilisera komplexen följt av immunoprecipitation (IP) med en antikropp mot en proteinkomponent av den studerade komplex.
Vid utvecklingen av en organism, många proteinkomplex bildas gående. Därför är det viktigt att analysera sammansättningen och funktionen av dessa komplex in vivo för att förstå de molekylära mekanismer som styr deveckling. Ett sådant in vivo analys skulle vara överlägsen in vitro-metod, eftersom det är nästan omöjligt att återge infödda koncentrationer av de samverkande komponenter och cellulära biokemiska miljö in vitro. Här visar vi en in vivo-metod som vi med framgång använder för att isolera stora proteinkomplex från Drosophila embryon. I denna metod är proteinkomplex i levande embryon som tvärbundits med en låg koncentration av formaldehyd och därefter proteinkomplex av intresse isoleras genom IP med en antikropp mot en känd del av komplexen följt av gelrening av komplexen och masspektrometrianalys till identifiera okända komplexa komponenter. Eftersom formaldehyd kan tränga igenom cellmembranet och har en tvärbindnings intervallet 2,3-2,7 Å 3, kan proteinkomplex tvärbindas in vivo och de komplexa komponenter kommer sannolikt att vara nära varandra. I denna artikel kommer vibeskriva denna metod med användning av isoleringen av Tudor (TuD) proteinkomplex som exempel. TUD är en könsceller protein som är viktigt för könsceller utveckling 4-7. Detta protein innehåller 11 TUD domäner kända för att interagera med denaturerad argininer eller lysiner av andra polypeptider 8-10.
Tidigare har vi genererat en transgen Drosophila linje som uttrycker HA-märkta funktionella TUD 5 och därför är specifika anti-HA-antikropp som används för att dra ner TUD komplex efter tvärbindning.
Förutom protein-protein-tvärbindningar, kan formaldehyd generera nukleinsyra-protein-tvärbindningar och används i Chip-seq experiment. Dessutom, i Drosophila, in vivo tvärbindning med formaldehyd har gjort identifieringen av en RNA-mål på Vasa RNA-helikas protein 11.
Även i den här artikeln beskriver vi en metod för in vivo tvärbindning och purkation av proteinkomplex från Drosophila embryon, kan detta förfarande anpassas för andra organismer och vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Stora Apple Juice-agarplattor
- För att göra fyra plattor, lägg 375 ml H2O, 11,25 g fluga agar och en omrörare till en 1000 ml kolv. Det här är Mix A. Autoklav Mix A med kolven locket löst tak på en 30 min-steriliseringscykel för flytande varor.
- Addera 125 ml äppeljuice, 12,5 g strösocker och en omrörare till en 500 ml bägare. Detta är Mix B. Värme Mix B på en uppvärmd plattform under omröring och hålla temperaturen vid cirka 70 ° C till dess att autoklavering av Mix A är klar.
- Efter slutförandet av Mix En autoklavering, överföra Mix B till Mix A. Håll omrörning den kombinerade blandningen försiktigt och låt den svalna i 15 minuter. Undvik att kyla och det resulte agar stel före tillsats av konserveringsmedel.
- Gör 10% (vikt / volym) metyl-4-hydroxibensoat-lösning i etanol. Detta kommer att fungera som ett konserveringsmedel. Lägg till 3,75 ml av lösningen på ovanstående äppeljuice-agar blandning. Håll omrörning under another 5 min.
- Häll 125 ml äppeljuice-agar blandning med konserveringsmedel i var 300 cm 2 plast eller frigolit platta. Låt den svalna till rumstemperatur och stelna. Undvik bildandet av luftbubblor medan man häller.
Obs: äppeljuice-agarplattor är redo att användas direkt. Täck oanvända plattorna med tydliga wraps och förvara vid 4 ° C i upp till en vecka.
2. Drosophila embryosamlings och Pre-tvärbindande behandling
- Ladda en befolkning bur med cirka 40.000 till 50.000 flugor från vilka embryon kommer att samlas in.
- Gör två plattor vardera innehållande 125 ml av standardmajsmjöl-melass medel 12 och strö cirka 4 g torkad bagerijäst på varje platta. Placera dessa plåtar i befolkningen buren i en 25 ° C inkubator i 48 timmar för att göda flugorna.
- Varm 2 Äppeljuice-agarplattor till 25 ° C. Strö ca 1 g torkad bagerijäst på varjeplattan. Placera 2 plattor i befolkningen buren för att börja samla 0-1 hr gamla embryon.
- Ta ut plattorna vid slutet av en timme samling. Ersätt med 2 nya plattor om det behövs ytterligare en runda av samlingen.
- Lägg tillräckligt med vatten för att täcka plattorna och suspendera embryon försiktigt med en fin pensel. Häll resuspenderade embryon genom en två lager sil gjord av rostfritt ståltrådsnät.
Obs: Det översta lagret består av medel porstorlek (850 nm) mesh som samlar stora fluga delar samtidigt låta genom embryon. Det understa lagret är tillverkad i fint nät (75 nm) som samlar embryon samtidigt låta genom jäst och vatten. - Använd fin målarpensel för att överföra de uppsamlade embryona in i en uppsamlings korg gjordes med en 50 ml tub och fint nylonnät. Skölj embryon snabbt med vatten sedan blot mesh på hushållspapper för att torka.
- Doppa embryona i 50% blekmedel under försiktig virvling under 3 min. Skölj grundligly med vatten för att avlägsna eventuellt kvarvarande blekmedel. Blot mesh på hushållspapper för att torka.
- Sänk de dechorionated embryon i isopropanol under försiktig omrörning i 15 sekunder eller tills nedbrytningen av flera embryo klumpar (detta bör inte ta längre än 30 sek). Blot mesh på hushållspapper för att torka ordentligt.
- Doppa embryona i heptan i 5 min när du använder en pipett att strömma heptan över embryon för att hålla dem suspenderade. Blot mesh på hushållspapper för att torka.
- Skölj embryon med strömmar av fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (PBS) innehållande 0,1% Triton X-100 (PBST) under 3 min.
- Ta isär uppsamlingskorg och överföra embryon tillsammans med maskan till ett 15 ml rör innehållande 10 ml PBST. Invertera röret försiktigt för att tvätta embryona utanför mesh.
- Ta bort nätet från röret. Placera röret i vertikalt läge och låter embryona sjunka till botten av röret genom självtryck.
OBS: Cirka 100-300il av embryon förväntas för en 1 hr samling från en bur. - Ta bort PBST och fortsätta att utföra tvärbindning omedelbart.
3. In vivo Tvärbindning av Samlade Embryon
- Bered 0,2% formaldehyd i PBST omedelbart före användning. Tillsätt 10 ml av formaldehyd fixativ till embryona och inkubera vid 25 ° C med försiktig skakning på en roterande skakanordning under 10 min. Kassera oanvänd fixativ i slutet av dagen.
- Släck tvärbindningsreaktionen
- Vid slutet av den tvärbindning, låt embryona sjunka till botten av röret.
- Avlägsna formaldehydlösning. Tillsätt omedelbart 10 ml av 0,25 M glycin i PBST för att släcka tvärbindningsreaktionen. Inkubera vid 25 ° C med försiktig skakning på en roterande skakanordning under 5 min.
- Låt embryona sjunka till botten av röret. Avlägsna kylningslösningen. Tvätta embryon med 10 ml PBST tre gånger.
- Helt ta bort PBST tvättlösning med användning av en pipett. Store embryon vid -80 ° C tills användning.
4. Proteinprovberedning och Immunoutfällning
- Homogenisera 500 jil tvärbundna embryon med användning av en Dounce-homogenisator i 2 ml lyseringsbuffert (0,5 M urea, 0,01% SDS, 2% Triton-X 100, 2 mM fenylmetansulfonylfluorid [PMSF] och proteasinhibitorcocktail i PBS).
Observera: Utför detta och följande steg vid RT om inte annat anges. - Överför lysatet till 1,5 ml centrifugrör och skaka försiktigt på en roterande plattform under 15 min för att säkerställa grundlig lys. Centrifugera lysatet vid 16.000 x g under 5 min för att pelletera cellrester. Spara supernatanten i ett rent 15 ml rör.
- Addera 40 pl anti-HA-agarospärlor uppslamningen till supematanten och inkubera på en roterande plattform under 2,5 timmar.
- Pelle pärlorna genom centrifugering vid 2500 x g under 5 min. Avlägsna supernatanten men lämna lämpligaximately 250 | il i röret. Återsuspendera pärlorna i den återstående supernatanten och överför till en 1,5 ml spinnkolonn med 10 | im por-filter.
- Centrifugera spinnkolonn vid 12000 x g under 10 sek och kassera genomflödet.
- Tvätta kulorna genom att tillsätta 200 | il tvättbuffert (0,1 M glycin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 i PBS). Centrifugera kolonnen vid 12000 x g under 10 sek och kassera tvätt. Upprepa tvätta två gånger till.
- Addera 40 pl elueringsbuffert (2 mg / ml HA-peptid i PBS) till pärlorna och inkubera vid 37 ° C under 15 min med försiktig skakning var 5: e min. Centrifugera kolonnen vid 12000 x g under 10 sek och samla in eluatet.
- Bekräfta eluering av komplexet av western-blot-analys med hjälp av anti-HA 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av tvärbindning och den framgångsrika reningen av det tvärbundna TuD proteinkomplexet analyserades med SDS-PAGE på en 3% - 7% steg gel (som illustreras i figur 1), följt av Western blöt (fig 2).
Syftet med att använda 3% - 7% steg gel är baserad på effektiv åtskillnad av tvärbunden TUD proteinkomplex från den kvarvarande icke tvärbundna TUD protein och koncentration av komplexet. Under våra in vivo tvärbindnings villkor som nämns ovan, kan en stor del av TUD protein fortfarande otvärbunden. Detta fria TUD protein skulle samrena med det tvärbundna komplexet under undersökningsperioden till separation genom SDS-PAGE. Även stora, ej tvärbunden TUD protein (285 kDa) vandrar över 3% - gränsen 7% utan uppenbar retention. Av följande skäl: tvärbunden TUD proteinkomplex med större molekylvikt skulle ha svårt att migrera över gelen gränsen, vilket resulterar i the komplex är "instängda" och koncentreras vid gränsen eller "svans" nära gränsen och därmed separera från den fria TUD-proteinet.
Införandet av en ordentlig kontroll är avgörande för att validera specificiteten hos denna tvärbindningsprotokoll. Därför använde vi embryon som uttrycker HA-märkt GFP-proteinet 14 för att övervaka omfattningen av tvärbindning. Vi har utfört pilotförsök med olika formaldehydkoncentrationer (0,1% - 2%) på embryon som uttrycker HA-märkta GFP och en del av resultaten (0,1% - 0,5%) Här visas (Figur 3). Det är tydligt att den absoluta majoriteten av GFP protein i de behandlade embryona (upp till 0,5% formaldehyd) förblev icke tvärbundna, som validerats att vår tvärbindningsprotokoll inte tvärbinder målprotein för slumpmässiga omgivande molekyler. Framför allt gjorde den 0,2% formaldehydbehandling (Figur 3, rad 5 och 6) inte några tvärbundna produkter jämfört med uncrosslinked kontroll (Figur 3, spår 1 och 2), trots den förlängda exponeringstid av filmen, vilket ytterligare motiverade vårt val av 0,2% formaldehyd i detta protokoll. Dock bör de GFP kontroll embryon alltid tvärbindas parallellt med TUD komplexa tvärbindning på samma villkor och kontroll GFP protein prover ska köras på 3% - 7% steg gel tillsammans med TUD komplexa prover följande IP. Dessutom har både TUD komplex och motsvarande GFP kontroll 3% - bör 7% gel områden skäras och lämnas in för masspektrometrianalys att bestämma falska positiva kandidater som kommer att finnas i både TUD komplexa band och GFP kontroll.
Effektiviteten hos vivo tvärbindning i bestämdes genom att jämföra fri TuD protein och TUD komplexet från icke-tvärbunden kontroll och tvärbundna embryon prover respektive (Figur 2A). Gratis TUD protein från icke-tvärbundna styr embryon nästan exclusively migrerat över 3% - gränsen 7% med minimal mängd behålls nära gränsområdet (Figur 2A, rad 1). I motsats till att de tvärbundna embryon visade närvaron av stora molekylvikt TuD tvärbundet komplex på 3% - 7% gel kant (Figur 2A, rad 2). Detta visade tydligt att vår tvärbindningsförfarande framgångsrikt tvärbunden cirka 50% av den totala TUD protein med dess in vivo samverkande partner (jämför figur 2A körfält 1 och 2).
Konkurrens eluering med HA-peptid bekräftade den framgångsrika reningen och stärkt specificiteten hos det renade TUD proteinkomplex (Figur 2B). Den elueringsfraktion av HA-peptid innehöll den koncentrerade runt 3% komplexet - gränsområdet 7% och även gratis TUD protein (Figur 2B, rad 1). Följande SDS provbuffert elueras mestadels gratis TUD kvar på pärlorna och minimalt med TUD-komplex (
. Figur 1 Diagram av 3% -. 7% steg gel användes för SDS-PAGE Den 3% - 7% steg gelén manuellt gjutna på ett sådant sätt att den innehåller tre skikt. Från toppen till botten, dessa skikt är 3% stackgelen, 3% separerande gel och 7% separerande gel. Att arbeta med Mini-PROTEAN systemet (Bio-Rad) som används i detta manuskript, var höjden på 3% separerande gel gjord för att vara ca 1 cm som visas i diagrammet.
Obs: 3% stapling gel och 3% separerande gel lager är extremt sköra så extra försiktig vid hantering av gelen för att förhindra en snedvridning av dessa lager.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. Figur 2 Western blot resultat från tvärbundna embryon och embryon kontroll lysat och rening av Tudor proteinkomplex från IP panel A, spår 1, råprotein lysat av icke tvärbundna kontroll embryon.; bana 2, råprotein lysat från formaldehyd tvärbundna embryon. Panel B, bana 1, eluering av HA-peptid efter IP från tvärbunden embryo lysat; lane 2, eluering med 2 x SDS-provbuffert efter den initiala HA-peptid eluering. SDS-PAGE kördes vid 200 V under 3,5 tim. Anti-HA-antikropp (1:1000) användes i Western blot.
Figur 3. Western blot resultat av tvärbundna embryon och embryon kontroll uttrycker HA-märkta GFP. Lane 1, råprotein lysat of otvärbundna kontroll embryon; bana 2, samma som spår 1, men dubbelt så mycket; bana 3, råprotein lysat av tvärbundna embryon som använder 0,1% formaldehyd; spår 4, samma som spår 3, men dubbelt så mycket; bana 5, råprotein lysat av tvärbundna embryon med hjälp av 0,2% formaldehyd; spår 6, samma som spår 5, men dubbelt så mycket; spår 7, råprotein lysat av tvärbundna embryon med hjälp av 0,3% formaldehyd; lane 8, samma som spår 7, men den dubbla mängden. Lane 9, rålysat av tvärbundna embryon med hjälp av 0,5% formaldehyd. SDS-PAGE kördes vid 200 V under 45 min i en 4% - 15% gradientgel. Anti-HA-antikropp (1:1000) användes i Western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formaldehyd har vanligen används som ett tvärbindningsreagens för att identifiera protein-protein och protein-nukleinsyra-interaktioner. Dess bra löslighet och cellmembranpermeabilitet tillsammans med kompatibilitet med nedströms masspektrometri rutiner, gör formaldehyd en idealisk kandidat agent för intracellulära tvärbindningsapplikationer 3,15-17. I synnerhet var det med framgång använts för att identifiera mRNA i samband med Vasa, en kritisk könsceller RNA-helikas i Drosophila 11. Dessutom har formaldehyd en av de kortaste distansarmarna (2,3-2,7 a) som kommersiellt tillgängliga tvärbindningsmedel, vilket innebär att endast molekyler som finns i närheten skulle tvärbindas under rätta förhållanden, stärka specificitet samverkande partner i målprotein . Av de skäl som anges ovan, formaldehyd valdes som tvärbindningsmedel i våra protokoll. Men detta bör inte utesluta usefulness av andra tvärbindande medel i in vivo-applikation för Drosophila-embryon. Vi har dock försökt att använda ditiobis (succinimidylpropionat) (DSP), en N-hydroxisuccinimid (NHS) ester familj tvärbindningsmedel används ofta i kombination med formaldehyd chip analyser 17,18, för att ersätta formaldehyd i vår studie, men ingen uppenbar TUD komplex erhölls med denna tvärbindare Å andra sidan kan DSP vara effektivt för andra proteinkomplex som måste avgöras från fall till fall. Förutom in vivo tvärbindning ansats har in vitro-tvärbindare från bismaleimidohexane (BMH)-familjen visat sig vara effektiva i att fånga protein-proteininteraktioner i Drosophila embryon 14,19 emellertid i dessa experiment tvärbindnings inträffade efter embryoextrakt gjordes.
Den tvärbindande tid, temperatur och formaldehydkoncentrationen är de tre stora faktorerrer som påverkar tvärbindningseffektiviteten. Vår protokoll har testats med hjälp av pilotförsök för varje enskild faktor, därför har det varit optimerad för tvärbindningen av TUD protein och dess samverkande partners i Drosophila embryon in vivo, samtidigt som balansen mellan den särskilda karaktären hos den tvärbundna komplex och risken för tvärbindning ospecifika molekyler. Icke-specifik tvärbindning leder till förekomsten av falska positiva i den komplexa och måste kontrolleras noggrant med icke proteinkontroll, t.ex. GFP, som användes i våra experiment. Dessutom kan de optimala tvärbindningsbetingelser variera med olika målmolekyler. Därför kommer att använda våra protokoll som utgångspunkt, den optimala tvärbindnings tid, temperatur och formaldehydkoncentrationen måste bestämmas för en given proteinkomplex av intresse.
När den optimala tvärbindningsbetingelser etableras är det kritiskt att follow dem exakt varje gång embryona tvärbunden för att minimera icke-specifik tvärbindning. Ytterligare avgörande steget tvättning av pärlorna efter IP med hög koncentration av NaCl (1 M) och två rengöringsmedel (IGEPAL CA-630 och Tween-20) för att minska ospecifik bindning av obesläktade proteiner från embryonala extrakt till pärlorna.
Vår protokoll är beroende av hög affinitet mellan målprotein och antikropp som används för att dra ner på proteinkomplex under undersökningsperioden. Därför bör antikroppens epitop i målproteinet inte förstöras av tvärbindning och måste vara tillgängliga för antikroppen under undersökningsperioden. Dessutom bör proteininteraktion den antikroppsmålet motstå stringenta tvättarna som syftar till en minskning av icke-specifika bakgrundsproteiner. Dessa krav för framgångsrik IP kan hindra en från att anställa en viss antikropp-epitop kombination dock bör det vara möjligt att hitta en lämplig antikropp-epitop par för ett protein av intresse. I synnerhet har HA-tag-epitopen och den motsvarande antikroppen med framgång används i detta protokoll.
Det beskrivna protokollet kan användas för isolering av nativa proteinkomplex under olika utvecklingsstadier och i olika vävnader. Även om vi demonstrera denna metod för Drosophila kan våra protokoll anpassas för andra organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler och Jimiao Zheng för deras tekniska hjälp med denna studie. Detta arbete stöddes av NSF KARRIÄR bevilja MCB-1054962 till ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
