Summary
Multikomponent proteinkomplekser spiller avgjørende roller i cellulær funksjon og utvikling. Her beskriver vi en fremgangsmåte til å isolere opprinnelige proteinkomplekser fra Drosophila embryo etter in vivo tverrbinding etterfulgt av rensing av de tverrbundne komplekser for etterfølgende struktur-funksjonsanalyse.
Abstract
Mange cellulære prosesser som er styrt av multisubunit proteinkomplekser. Ofte disse kompleksene danne forbigående og krever opprinnelige miljø å montere. Derfor, for å identifisere disse funksjonelle proteinkomplekser, er det viktig for å stabilisere dem in vivo før cellelysering, og etterfølgende rensing. Her beskriver vi en metode som brukes for å isolere store bona fide protein komplekser fra Drosophila embryoer. Denne metoden er basert på embryo permeabilization og stabilisering av de komplekser inne i embryoer ved in vivo tverrbinding ved hjelp av en lav konsentrasjon av formaldehyd, noe som lett kan krysse cellemembranen. Deretter blir proteinkompleks av interesse immunopurified etterfulgt av gel-rensing og analysert ved massespektrometri. Vi illustrerer denne fremgangsmåte ved hjelp av rensing av et Tudor proteinkompleks, som er avgjørende for kimlinje utvikling. Tudor er et stort protein, som inneholder flere Tudor domener - litenmoduler som samhandler med denaturert arginines eller lysines av target proteiner. Denne fremgangsmåte kan tilpasses for isolering av fremmedproteinkomplekser fra forskjellige organismer og vev.
Introduction
Isolering av multisubunit proteinsammensetningene og DNA-eller RNA-proteinkomplekser er utført for å identifisere proteinkomplekser, genomiske loci gjenkjent av DNA-bindende regulatoriske proteiner eller RNA-mål på RNA-bindende proteiner. Ulike metoder tillate genome-wide identifikasjon av DNA sider anerkjent av transkripsjonsfaktorer eller kromatin proteiner (chip-SEQ) for en og RNA mål knyttet til en gitt RNA-bindende protein (CLIP-seq) 2. Bibliotekene av RNA-avledet cDNAs eller DNA målene blir så dypt sekvensert. Disse metodene brukes kjemiske eller UV-indusert tverrbinding for å stabilisere komplekser fulgt av immunoutfelling (IP) med et antistoff mot et protein-komponenten av de studerte kompleks.
Under utvikling av en organisme, mange protein-komplekser dannes forbigående. Derfor er det viktig å analysere sammensetningen og funksjonen til disse kompleksene in vivo for å forstå de molekylære mekanismer som styrer development. En slik in vivo-analyse ville være overlegne i forhold til in vitro metode siden det er praktisk talt umulig å reprodusere opprinnelige konsentrasjoner av de samvirkende komponenter og cellulær biokjemiske miljø in vitro. Her viser vi en in vivo tilnærming som vi lykkes med å bruke til å isolere store proteinkomplekser fra Drosophila embryoer. I denne metoden, blir proteinkomplekser i de levende embryoer tverrbundet med en lav konsentrasjon av formaldehyd og etterfølgende protein-komplekser av interesse blir isolert ved IP med et antistoff mot en kjent komponent av kompleksene, etterfulgt av gel-rensing av kompleksene og massespektrometri-analyse til identifisere ukjente komplekse komponenter. Siden formaldehyd er i stand til å trenge gjennom cellemembranen og har et tverrbindingsområde av 2,3 til 2,7 Å. 3, kan proteinkomplekser kan fornettes in vivo, og de komplekse komponenter er sannsynlig å være nær hverandre. I denne artikkelen har vibeskrive denne metode med bruk av isolering av Tudor (Tud) protein-komplekset som et eksempel. Tud er en kimlinje protein som er essensielt for utvikling av kimlinje 4-7. Dette proteinet inneholder 11 Tud domener som interagerer med denaturert arginines eller lysines av andre polypeptider 8-10.
Tidligere har vi generert en transgen Drosophila linje som uttrykker HA-merket funksjonell Tud 5 og derfor er spesifikk anti-HA antistoff brukes til å trekke ned Tud kompleks etter kryssbinding.
I tillegg til protein-protein-tverrbindinger, kan formaldehyd generere nukleinsyre-protein-tverrbindinger, og som brukes i chip-seq eksperimenter. Videre, i Drosophila, in vivo kryssbinding med formaldehyd har muliggjort identifisering av en RNA target for Vasa RNA helicase protein 11.
Mens i denne artikkelen beskriver vi en metode for in vivo kryssbinding og purification av protein komplekser fra Drosophila embryo, kan denne metoden være tilrettelagt for andre organismer og vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder stort eple Juice-agar plater
- For å gjøre fire tallerkener, legg 375 ml H 2 O, 11.25 g fly agar og en rørepinne til en 1000 ml kolbe. Dette er Mix A. Autoclave Mix A med kolben lokket løst avkortet på en 30 min-steriliseringssyklus for flytende varer.
- Legg 125 ml eplejuice, 12,5 g sukker og en rørepinne til et 500 ml begerglass. Dette er Blanding B. Varme Mix B på en oppvarmet plattform under omrøring og opprettholde temperaturen på ca 70 ° C inntil det autoklavering av blanding A er ferdig.
- Ved ferdigstillelse av Mix En autoklavering, overføre Mix B til Mix A. Hold røring kombinert blandingen forsiktig og la den avkjøles i 15 min. Unngå over-avkjøling, og det resulterende agar størkning før tilsetning av konserveringsmiddel.
- Lag 10% (vekt / volum) metyl-4-hydroksybenzoat-løsning i etanol. Denne vil fungere som et konserveringsmiddel. Til 3,75 ml av oppløsningen til den ovenfor eplejuice-agar-blanding. Hold omrøring i another 5 min.
- Hell 125 ml eplejuice-agar blanding med konserveringsmiddel i hver 300 cm 2 plast eller styrofoam plate. La den avkjøles til romtemperatur og stivne. Unngå dannelse av luftbobler mens helle.
Merk: Den eplesaft-agar plater er klare til bruk umiddelbart. Dekk ubrukte plater med klare wraps og oppbevar ved 4 ° C i opp til en uke.
2. Drosophila Embryo Collection og Pre-kryssbindings Treatment
- Legg i en befolkning bur med ca 40.000 til 50.000 fluer som embryo vil bli samlet inn.
- Lag to plater som hver inneholder 125 ml av standard cornmeal-melasse medium 12 og dryss ca 4 g tørket bakegjær på hver plate. Plasser disse plater inn i populasjonen bur i en 25 ° C inkubator i 48 timer for å fete fluene.
- Varm 2 eplesaft-agar plater til 25 ° C. Strø omtrent 1 g av tørket bakegjær på hvertplate. Plasser de to platene i befolkningen buret for å begynne å samle 0-1 hr gamle embryoer.
- Ta ut platene ved slutten av 1 time samlingen. Skift ut med to nye plater hvis en ny runde med innsamling er nødvendig.
- Legg nok vann til å dekke platene og resuspender embryoene forsiktig med en fin pensel. Hell de resuspenderte embryoer gjennom en to-lags sil laget av rustfritt stål netting.
Merk: Det øverste laget er laget av medium porestørrelse (850 mikrometer) mesh som samler store flue deler samtidig som gjennom embryoer. Bunnlaget er laget av fin mesh (75 mikrometer) som samler embryoer samtidig som gjennom gjær og vann. - Bruk den fine pensel til å overføre de innsamlede embryo til en samling kurv laget med en 50 ml tube og fin nylon mesh. Skyll embryoene kort med vann og tørk den mesh på tørkepapir for å tørke.
- Fordyp embryoene i 50% blekemiddel med forsiktige virvel for 3 min. Skyll grundigly med vann for å fjerne eventuelle gjenværende blekemiddel. Blot mesh på tørkepapir for å tørke.
- Fordyp de dechorionated embryoer i isopropanol med forsiktig omrøring i 15 sekunder eller til nedbryting av multi-embryo klumper (dette bør ikke ta lenger enn 30 sek). Blot mesh på tørkepapir for å tørke grundig.
- Fordyp embryoene i heptan for 5 min mens du bruker en pipette til å streame heptan over embryo for å holde dem resuspendert. Blot mesh på tørkepapir for å tørke.
- Skyll embryoene med strømmer av fosfatbufret saltvann, pH 7,4 (PBS) inneholdende 0,1% Triton X-100 (PBST) i 3 min.
- Demonter samling kurv og overføre embryoene sammen med mesh til en 15 ml tube inneholder 10 ml PBST. Snu røret forsiktig å vaske embryoene av mesh.
- Fjern mesh fra røret. Plasser røret i vertikal stilling og la embryoene synke til bunnen av røret ved hjelp av gravitasjon.
Merk: Ca 100 - 300mL av embryoer er forventet for en 1 hr samling fra et bur. - Fjern PBST og fortsette å utføre kryssbinding umiddelbart.
Tre. In vivo Crosslinking av innsamlet embryo
- Forbered 0,2% formaldehyd i PBST umiddelbart før bruk. Tilsett 10 ml av formaldehyd fiksativ til embryoene, og inkuber ved 25 ° C med forsiktig omrøring på en rotasjonsrister i 10 min. Kast ubrukt fiksativ ved slutten av dagen.
- Slukke tverrbindingsreaksjon
- Ved slutten av tverrbindingen, la embryoene synke til bunnen av røret.
- Fjern formaldehydoppløsning. Umiddelbart tilsett 10 ml av 0,25 M glysin i PBST å stanse kryssbindingsreaksjon. Inkuber ved 25 ° C med forsiktig omrøring på en rotasjonsrister i 5 min.
- La embryoene synke til bunnen av røret. Fjern slukke løsning. Vask embryoene med 10 ml av PBST tre ganger.
- Fullstendig fjerne PBST vaskeløsning ved hjelp av en pipette. Oppbevar embryoer ved -80 ° C inntil bruk.
4. Protein Prøvepreparering og Immunoutfelling
- Homogen 500 mL tverrbundede embryoer ved hjelp av en Douce-homogenisator i 2 ml lyseringsbuffer (0,5 M urea, 0,01% SDS, 2% Triton-X-100, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluor [PMSF], og protease-inhibitor cocktail i PBS).
Merk: Utfør denne og de følgende steg RT mindre annet er spesifisert. - Overfør lysatet til 1,5 ml sentrifugerør og rist på en roterende plattform i 15 minutter for å sikre grundig lysis. Sentrifuger lysatet ved 16.000 xg i 5 min for å pelletere celleavfall. Ta vare på supernatanten i en ren 15 ml tube.
- Legg 40 pl anti-HA agarosekuler oppslem til supernatanten og inkuberes på en roterende plattform i 2,5 timer.
- Pellet perlene ved sentrifugering ved 2500 xg i 5 min. Fjern supernatanten men la hensiktsximately 250 Ul røret. Resuspender perlene i den gjenværende supernatant, og overføring til et 1,5 ml spinnkolonne med 10-um pore-filter.
- Sentrifuger spin kolonne på 12 000 xg i 10 sek og kast flyten gjennom.
- Vask kulene ved tilsetning av 200 pl vaskebuffer (0,1 M glycin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 i PBS). Sentrifuger kolonnen på 12 000 xg i 10 sek og kast vask. Gjenta vask to ganger til.
- Legg 40 pl elueringsbuffer (2 mg / ml HA-peptidet i PBS) til perlene og inkuberes ved 37 ° C i 15 min med forsiktig omrøring hvert 5 min. Sentrifuger kolonnen ved 12 000 xg i 10 sek, og samler eluatet.
- Bekreft eluering av komplekset av western-blot analyse ved hjelp av anti-HA antistoff 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten av tverrbinding og en vellykket rensing av den tverrbundne Tud proteinkompleks ble analysert ved SDS-PAGE på en 3% - 7% gel trinn (se figur 1), etterfulgt av western blot (Figur 2).
Hensikten med å bruke 3% - 7% trinn gel er basert på den effektive separering av tverrbundet Tud proteinkomplekset fra den gjenværende ikke-kryssbundet Tud protein og konsentrasjonen av komplekset. Under våre in vivo tverrbindingsforhold som er nevnt ovenfor, kan en stor andel av Tud protein fortsatt uncrosslinked. Denne frie Tud protein ville copurify med kryssbundet kompleks ved IP til separasjon ved hjelp av SDS-PAGE. Skjønt store i størrelse, tverrbundet Tud protein (285 kD) vandrer tvers over 3% - 7% grensen uten åpenbar retensjon. Mens krysskoblet Tud protein kompleks med større molekylvekt ville ha problemer med å migrere over gel grensen, noe som resulterer i the kompleks blir "fanget" og konsentrert ved grensen eller "tailing" nær grensen og dermed, skille fra den frie Tud protein.
Inkluderingen av en passende kontroll er kritisk for å validere spesifisiteten av dette tverrbindings protokollen. Derfor har vi brukt embryoer som uttrykker GFP-merket HA-protein 14 for å overvåke graden av tverrbinding. Vi har utført pilotforsøk med forskjellige formaldehydkonsentrasjoner (0,1% - 2%) av embryoer som uttrykker HA-merket GFP og en del av de resultater (0,1% - 0,5%) er vist her (fig. 3). Det er klart at den absolutte flertall av GFP protein i de behandlede embryoer (opp til 0,5% formaldehyd) forble ikke-kryssbundet, noe som bekreftet at vår tverrbindings protokollen ikke kryssbindings målprotein til tilfeldige liggende molekylene. Spesielt har den 0,2% formaldehyd-behandling (figur 3, felt 5 og 6) viser ingen tverrbundne produkter sammenlignet med uncrosslinked kontroll (figur 3, felt 1 og 2) til tross for den lengre eksponeringstiden av filmen, noe som ytterligere begrunnet valget av 0,2% formaldehyd i denne protokollen. Imidlertid bør de GFP kontroll embryoer alltid fornettes parallelt med Tud komplekse tverrbinding under samme forhold og kontroll GFP proteinprøver skal kjøres på 3% - 7% trinn gel sammen med Tud komplekse prøver følgende IP. I tillegg er både Tud kompleks og den tilsvarende GFP kontroll 3% - 7% gel bør områdene bli skåret ut og underkastet massespektrometri-analyse for å bestemme falske positive kandidater som vil være til stede i både Tud kompleks bandet og GFP-kontroll.
Effektiviteten av in vivo-tverrbinding ble bestemt ved å sammenligne fri Tud protein og Tud komplekset fra ikke-kryssbundet kontroll og tverrbundne embryoer prøvene henholdsvis (figur 2A). Gratis Tud protein fra uncrosslinked kontroll embryoer nesten exclusively migrert over 3% - grensen 7% med minimal mengde beholdt nær grenseområdet (figur 2A, kolonne 1). I motsetning til dette, de tverrbundne embryoene viste tilstedeværelse av store molekylvekt Tud kryssbundet kompleks ved 3% - 7% gel kant (figur 2A, kolonne 2). Dette viste tydelig at vår tverrbindings prosedyren ble krysskoblet ca 50% av total Tud protein med sine in vivo samhandlende partnere (sammenligne Figur 2A kjørefelt 1 og 2).
Konkurranse eluering med HA-peptid bekreftes vellykket rensing og forsterket spesifisiteten av det rensede Tud proteinkompleks (figur 2B). Den eluering fraksjon av HA-peptid inneholdt komplekset konsentrert rundt 3% - 7% grenseområdet, og også fri Tud protein (figur 2B, kolonne 1). Følgende SDS prøvebuffer elueres hovedsakelig fri Tud igjen på perlene og minimal mengde Tud kompleks (
. Figur 1. Diagram av 3% -. Steg 7% gel som brukes for SDS-PAGE Den 3% - 7% trinn gel er manuelt støpt på en slik måte at den inneholder tre lag. Fra topp til bunn, disse lagene er 3% stabling gel, 3% separering av gelen og 7% separering av gelen. For å arbeide med mini-Protean system (Bio-Rad) som brukes i dette manuskriptet, ble høyden på 3% separering gel laget for å være omtrent 1 cm som vist på tegningen.
Merk: 3% stabling gel og de 3% som skiller gel lag er ekstremt skjør så vær ekstra forsiktig når du håndterer gel for å hindre forvrengning av disse lagene.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. Figur 2 Western blot resultatene av krysskoblet embryoer og kontroll embryoer Lysater og rensing av Tudor protein kompleks av IP Panel A, kjørefelt 1, råprotein lysatet av uncrosslinked kontroll embryoer.; felt 2, råprotein lysat fra formaldehyd tverrbundede embryoer. Panel B, kolonne 1, eluering av HA-peptid etter IP fra tverrbundet embryo lysat; felt 2, eluering med 2 x SDS-prøvebuffer etter den første HA-peptid-eluering. SDS-PAGE ble utført ved 200 V i 3,5 timer. Anti-HA antistoff (1:1.000) ble brukt i western blot.
Figur 3. Western blot resultatene av krysskoblet embryoer og kontroll embryoer uttrykker HA-merket GFP. Lane 1, råprotein lysate of uncrosslinked kontroll embryoer; felt 2, samme som kolonne 1, men det dobbelte; kjørefelt 3, råprotein lysatet av krysskoblet embryoer som bruker 0,1% formaldehyd; kjørefelt 4, samme som kjørefelt 3, men dobbelt så mye; kjørefelt 5, råprotein lysatet av krysskoblet embryoer som bruker 0,2% formaldehyd; lane 6, samme som kjørefelt fem, men dobbelt så mye; kjørefelt 7, råprotein lysatet av krysskoblet embryoer som bruker 0,3% formaldehyd; kjørefelt 8, samme som kjørefelt 7, men dobbelt så mye. Lane 9, rå lysate av krysskoblet embryoer som bruker 0,5% formaldehyd. SDS-PAGE ble utført ved 200 V i 45 min i en 4% - 15% gradient-gel. Anti-HA antistoff (1:1.000) ble brukt i western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formaldehyd har blitt vanlig benyttet som kryssbindings reagens for å identifisere protein-protein og protein-nukleinsyre interaksjoner. Dens god oppløselighet og cellemembranen permeabilitet, sammen med kompatibiliteten med nedstrøms massespektrometri prosedyrer, gjør formaldehyd en ideell kandidat agent for intracellulære crosslinking applikasjoner 3,15-17. Spesielt ble det med hell brukes til å identifisere mRNA forbundet med Vasa, en kritisk bakterie celle RNA heli i Drosophila 11. I tillegg har formaldehyd en av de korteste avstandsarmene (2.3 til 2.7 a) blant kommersielt tilgjengelige crosslinkers, noe som innebærer at det kun er molekyler som finnes i umiddelbar nærhet ville fornettes under riktige forhold, styrke spesifisitet av de samhandlende partnere av målet protein . Av de grunner som er angitt ovenfor, ble formaldehyd valgt som tverrbindingsmiddel i vårt protokoll. Dette bør imidlertid ikke utelukke usefulness av andre fornetningsmidler i in vivo søknad om Drosophila embryoer. Imidlertid, har vi forsøkt å bruke ditiobis (succinimidyl-propionat) (DSP), en N-hydroksysuksinimid (NHS) ester par tverrbindingsmiddel brukes ofte i kombinasjon med formaldehyd i chip-assays 17,18, for å erstatte formaldehyd i vårt studium, men uten tilsynelatende Tud Komplekset ble oppnådd med dette tverrbindingsmiddel på den annen side kan DSP være effektive for andre proteinkomplekser, som vil måtte fastsettes på fra sak til sak basis. I tillegg til in vivo tilnærming tverrbinding, har in vitro-tverrbindere fra bismaleimidohexane (BMH) familien er vist å være effektiv i å fange protein-protein-interaksjoner in Drosophila embryo 14,19, men i disse eksperimentene tverrbindingen skjedde etter embryoekstrakter ble gjort.
Kryssbindingen tid, temperatur og formaldehydkonsentrasjonen er de tre store factorer som påvirker kryssbindings effektivitet. Vår protokoll er blitt testet ved hjelp av pilotforsøk for hver enkelt faktor, og derfor har det vært optimalisert for tverrbinding av Tud protein og dets samvirkende partnere i Drosophila embryo in vivo, og samtidig opprettholde en balanse mellom spesifisiteten av den tverrbundne kompleks og risikoen for kryssbinding uspesifikke molekyler. Ikke-spesifikk tverrbinding fører til tilstedeværelsen av falske positiver i den komplekse og må nøye styres med en ikke-relatert protein-kontroll, f.eks GFP, som ble benyttet i forsøkene. I tillegg kan de optimale tverrbindingsbetingelser varierer med forskjellige målmolekyler. Derfor vil bruk av vår protokoll som utgangspunkt, det optimale tverrbindings tid, temperatur og formaldehydkonsentrasjonen må bli bestemt for en gitt proteinkompleks av interesse.
Når de optimale tverrbindingsbetingelser er etablert er det viktig å forllow dem nøyaktig hver gang embryoene fornettes å minimere uspesifikke tverrbinding. Ytterligere viktige trinn er å vaske perlene etter IP med høy konsentrasjon av NaCl (1 M) og to vaskemidler (IGEPAL CA-630-og Tween-20) for å redusere ikke-spesifikk binding av ikke-relaterte proteiner fra embryoniske ekstrakter til kulene.
Vår protokoll er avhengig av høy affinitet mellom target-proteiner og antistoff som brukes til å trekke ned proteinkompleks i løpet av IP. Derfor bør det antistoffets epitop i målprotein ikke bli ødelagt av tverrbinding, og må være tilgjengelig for antistoff i løpet av IP. I tillegg bør det antistoff-målet protein interaksjon tåle de strenge vaskinger som tar sikte på å redusere ikke-spesifikk bakgrunn proteiner. Disse krav for vellykket IP kan hindre en fra anvendelse av et spesielt antistoff-epitop kombinasjon, men bør det være mulig å finne en egnet antistoff-epitop par for et protein av interesse. Spesielt har HA-epitop tag og det tilsvarende antistoff med hell blitt brukt i denne protokollen.
Den beskrevne protokoll kan anvendes for isolering av opprinnelige proteinkomplekser i forskjellige utviklingsstadier og i forskjellige vev. Selv om vi viser denne metoden for Drosophila, vår-protokollen kan tilpasses for andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler og Jimiao Zheng for deres teknisk hjelp med denne studien. Dette arbeidet ble støttet av NSF KARRIERE gi MCB-1054962 til ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
