Summary
Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.
Abstract
Molti processi cellulari sono controllati da complessi proteici multisubunit. Spesso questi complessi formano transitoriamente e richiedono ambiente nativo da montare. Pertanto, per identificare questi complessi proteici funzionali, è importante stabilizzarli in vivo prima lisi cellulare e successiva purificazione. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare grandi complessi proteici in buona fede da embrioni di Drosophila. Questo metodo si basa su embrione permeabilizzazione e stabilizzazione dei complessi all'interno degli embrioni in vivo reticolazione usando una bassa concentrazione di formaldeide, che può facilmente attraversare la membrana cellulare. Successivamente, il complesso proteina di interesse è immunopurified seguita da purificazione gel e analizzato mediante spettrometria di massa. Illustriamo questo metodo utilizzando la purificazione di un complesso proteico Tudor, che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale. Tudor è una grande proteina, che contiene più domini Tudor - piccolomoduli che interagiscono con arginine metilate o lysines delle proteine target. Questo metodo può essere adattato per l'isolamento di complessi proteina nativa da organismi e tessuti differenti.
Introduction
Isolamento delle assemblee proteine multisubunit e-DNA o RNA-proteina complessi viene effettuata per identificare complessi proteici, loci genomici riconosciuto da proteine regolatrici che legano il DNA o RNA target di proteine leganti RNA. Diversi metodi permettono l'identificazione genoma dei siti del DNA riconosciuti da fattori di trascrizione o proteine della cromatina (ChIP-Seq) 1 e gli obiettivi di RNA associate a un determinato RNA-binding protein (CLIP-ss) 2. Le librerie di cDNA RNA derivati da o bersagli di DNA sono poi profondamente sequenziati. Questi metodi utilizzano chimica o indotto da UV reticolazione a regolarizzare i complessi seguita da immunoprecipitazione (IP) con un anticorpo contro un componente proteica del complesso studiato.
Durante lo sviluppo di un organismo, molti complessi proteici formano transitoriamente. Pertanto, è fondamentale per analizzare la composizione e la funzione di questi complessi in vivo per comprendere i meccanismi molecolari che controllano development. Tale analisi in vivo sarebbe superiore al metodo in vitro dato che è praticamente impossibile riprodurre concentrazioni nativi dei componenti interagenti e ambiente biochimico cellulare in vitro. Qui mostriamo un approccio in vivo che usiamo con successo per isolare grandi complessi proteici da embrioni di Drosophila. In questo metodo, complessi proteici negli embrioni viventi sono reticolati con una bassa concentrazione di formaldeide e successivamente complessi proteici di interesse sono isolati da IP con un anticorpo contro un componente noto dei complessi seguita da purificazione gel dei complessi e analisi di spettrometria di massa a identificare i componenti complessi sconosciuti. Poiché formaldeide è in grado di permeare la membrana cellulare e ha un raggio di reticolazione 2.3-2.7 Å 3, complessi proteici possono essere reticolati in vivo e le componenti complessi sono suscettibili di essere vicini l'uno all'altro. In questo articolodescrivere questo metodo usando l'isolamento di Tudor (Tud) complesso proteico come esempio. Tud è una proteina germinale che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale 4-7. Questa proteina contiene 11 domini Tud noti per interagire con arginines denaturato o lysines di altri polipeptidi 8-10.
In precedenza, abbiamo generato una linea di Drosophila transgenica che esprime HA-tagged funzionale Tud 5 e, quindi, specifici anticorpi anti-HA viene utilizzato per abbattere complesso Tud dopo reticolazione.
Oltre a legami crociati tra proteine, formaldeide può generare acido nucleico reticola-proteina e viene usato in esperimenti di ChIP-seq. Inoltre, in Drosophila, in vivo reticolazione con formaldeide ha permesso l'identificazione di un target di RNA di Vasa RNA elicasi proteine 11.
Mentre in questo articolo descriviamo un metodo per reticolazione in vivo e purria del complessi proteici da embrioni di Drosophila, questo metodo può essere adattato per altri organismi e tessuti.
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Protocol
1. Preparare grande mela Piastre Juice-agar
- Per fare 4 piastre, aggiungere 375 ml di H 2 O, 11,25 g fly agar e un bar mescolare in un pallone di 1.000 ml. Questo è il Mix A. Autoclave Mix A con il coperchio pallone liberamente ricoperto da un ciclo di 30 min-sterilizzazione per le merci liquide.
- Aggiungere 125 ml di succo di mela, 12,5 g di zucchero da tavola e un ancoretta ad un bicchiere da 500 ml. Questo è Mix B. calore Mix B su una piattaforma riscaldata sotto agitazione e mantenere la temperatura a circa 70 ° C fino alla autoclave di Mix A è terminata.
- Al completamento di Mix A autoclave, trasferire Mix B Mix A. Continuate a mescolare il composto unito delicatamente e lasciate raffreddare per 15 minuti. Evitare di raffreddamento e la solidificazione agar portato prima dell'aggiunta di conservante.
- Prova del 10% (peso / volume) metil 4-idrossibenzoato soluzione in etanolo. Questo agirà come conservante. Aggiungere 3,75 ml della soluzione alla miscela succo-agar mela sopra. Continuate a mescolare per another 5 min.
- Versare 125 ml di succo di mela miscela-agar con conservanti in ciascuna di plastica 300 centimetri 2 o lastra di polistirolo. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente e solidificare. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il versamento.
Nota: Le piastre di agar succo di mela sono pronti per l'uso immediato. Coprire le piastre utilizzate con impacchi chiari e conservare a 4 ° C per un massimo di una settimana.
2. Drosophila Embryo raccolta e il trattamento pre-reticolazione
- Caricare una gabbia popolazione con circa 40.000 a 50.000 mosche da cui verranno raccolti embrioni.
- Fare due piastre contenenti ciascuno 125 ml di farina di mais-melassa standard, medie 12 e cospargere di circa 4 g di lievito di birra essiccato su ogni piatto. Mettere questi piatti nella gabbia della popolazione in un incubatore a 25 ° C per 48 ore per ingrassare le mosche.
- Warm 2 piastre di succo di mela-agar a 25 ° C. Cospargere circa 1 g di lievito di birra essiccato su ognipiatto. Posizionare le 2 piastre nella gabbia popolazione di iniziare a raccogliere 0-1 embrioni hr-old.
- Estrarre le piastre alla fine dell'insieme 1 hr. Sostituire con 2 nuove piastre se è necessario un altro giro di raccolta.
- Aggiungere acqua sufficiente a coprire le piastre e risospendere gli embrioni delicatamente con un pennello fine. Versare gli embrioni risospeso attraverso un setaccio a doppio strato, fatto di rete metallica in acciaio inox.
Nota: Lo strato superiore è realizzato in dimensioni medie dei pori (850 micron), maglia che raccoglie gran parte della mosca mentre lascia passare embrioni. Lo strato inferiore è realizzata in maglia fine (75 micron), che raccoglie gli embrioni pur lasciando passare lievito e acqua. - Usare il pennello ammenda di trasferire gli embrioni raccolti in un cestino di raccolta realizzato con un tubo da 50 ml e rete di nylon fine. Sciacquare gli embrioni brevemente con acqua, quindi asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
- Immergere gli embrioni nel 50% di candeggina con agitando delicatamente per 3 min. Risciacquare approfonditaly con acqua per rimuovere qualsiasi residuo di candeggina. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
- Immergere gli embrioni dechorionated in isopropanolo con leggera agitazione per 15 secondi o fino a quando la ripartizione dei cespi multi-embrione (questo non dovrebbe richiedere più di 30 secondi). Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare completamente.
- Immergere gli embrioni in esano per 5 minuti mentre usando una pipetta per lo streaming eptano negli embrioni per tenerli risospeso. Asciugare la rete su carta assorbente per asciugare.
- Lavare gli embrioni con i flussi di Soluzione tampone fosfato, pH 7.4 (PBS) contenente 0,1% Triton X-100 (PBST) per 3 min.
- Smontare il cestello di raccolta e trasferire gli embrioni con la maglia di una provetta da 15 ml contenente 10 ml PBST. Capovolgere delicatamente il tubo per lavare gli embrioni fuori la rete.
- Rimuovere la maglia dal tubo. Inserire il tubo in posizione verticale e lasciare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta per gravità.
Nota: Circa 100-300microlitri di embrioni è previsto per una raccolta 1 ora da una gabbia. - Rimuovere il PBST e continuare a funzionare reticolazione immediatamente.
3. Nel vivo reticolazione degli embrioni raccolti
- Preparare 0,2% di formaldeide in PBST immediatamente prima dell'uso. Aggiungere 10 ml di fissativo formaldeide per gli embrioni e incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 10 min. Scartare fissativo inutilizzato alla fine della giornata.
- Placare la reazione di reticolazione
- Al termine della reticolazione, lasciare che gli embrioni si depositano sul fondo della provetta.
- Rimuovere la soluzione di formaldeide. Immediatamente aggiungere 10 ml di 0,25 M glicina in PBST per placare la reazione di reticolazione. Incubare a 25 ° C con agitazione su un agitatore rotante per 5 min.
- Affittare gli embrioni si depositano sul fondo della provetta. Rimuovere la soluzione di abbattimento. Lavare gli embrioni con 10 ml di PBST tre volte.
- Rimuovere completamente il PSoluzione di lavaggio BST con una pipetta. Conservare embrioni a -80 ° C fino al momento dell'uso.
4. Proteine preparazione del campione e Immunoprecipitation
- Omogeneizzare 500 microlitri embrioni reticolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in 2 ml di tampone di lisi (0.5 M urea, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro [PMSF] e cocktail inibitore di proteasi in PBS).
Nota: Eseguire questa e le seguenti operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente specificato. - Trasferire il lisato a 1,5 ml provette da centrifuga e rock delicatamente su una piattaforma rotante per 15 minuti al fine di garantire lisi approfondita. Centrifugare il lisato a 16.000 xg per 5 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Salvare il surnatante in un ambiente pulito tubo da 15 ml.
- Aggiungere 40 microlitri anti-HA agarosio impasto nel surnatante e incubare su piattaforma rotante per 2,5 ore.
- Agglomerare le perline per centrifugazione a 2500 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante ma lasciare approximately 250 microlitri nel tubo. Risospendere le sfere nel surnatante rimanente e trasferire in una colonna di spin 1,5 ml con 10 micron di filtro pori.
- Centrifugare la colonna di spin a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il flusso attraverso.
- Lavare le perline aggiungendo 200 microlitri di tampone di lavaggio (0,1 M glicina, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20, in PBS). Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 secondi e scartare il lavaggio. Ripetere il lavaggio altre due volte.
- Aggiungere 40 microlitri tampone di eluizione (2 mg / ml di HA-peptide in PBS) per le perline e incubare a 37 ° C per 15 minuti con agitazione ogni 5 min. Centrifugare la colonna a 12.000 xg per 10 sec e raccogliere l'eluato.
- Confermare eluizione del complesso mediante analisi western-blot utilizzando anticorpi anti-HA 13.
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Representative Results
L'efficacia della reticolazione e la purificazione successo del reticolato complesso proteico Tud sono stati analizzati mediante SDS-PAGE su un 3% - 7% gel fase (illustrata in figura 1), seguita da Western blot (Figura 2).
Lo scopo di utilizzare il 3% - gel passaggio 7% si basa sulla separazione effettiva del reticolato complesso proteico Tud dalla restante proteina non reticolato Tud e concentrazione del complesso. Nelle nostre condizioni di reticolazione in vivo di cui sopra, una grande proporzione di proteina Tud potrebbe ancora rimanere non reticolato. Questa proteina libera Tud sarebbe copurify con il complesso reticolato durante IP fino a separazione mediante SDS-PAGE. Anche se di grandi dimensioni, non reticolato proteina Tud (285 kDa) migra attraverso il 3% - 7% confine senza ritenzione evidente. Considerando che reticolato complesso proteico Tud con peso molecolare maggiore avrebbe difficoltà migrazione attraverso il confine gel, con conseguente the complesso essere "intrappolati" e concentrata alla frontiera o "coda", vicino al confine e, quindi, la separazione dalla proteina libera Tud.
L'inclusione di un controllo corretto è fondamentale per convalidare la specificità di questo protocollo reticolazione. Pertanto, abbiamo utilizzato embrioni esprimenti HA-tag proteina GFP 14 per controllare l'entità della reticolazione. Abbiamo effettuato esperimenti pilota di diverse concentrazioni di formaldeide (0,1% - 2%) sugli embrioni che esprimono GFP HA-tag e parte dei risultati (0,1% - 0,5%) sono mostrati qui (Figura 3). E 'chiaro che la maggioranza assoluta di proteine GFP negli embrioni trattati (fino a 0,5% di formaldeide) è rimasto non reticolato, che ha convalidato che il nostro protocollo reticolazione non reticolazione proteina bersaglio di molecole circostanti casuali. In particolare, il 0,2% trattamento con formaldeide (Figura 3, corsia 5 e 6) non ha mostrato alcun prodotto reticolati rispetto al uncrcontrollo osslinked (Figura 3, corsia 1 e 2), nonostante il tempo di esposizione estesa del film, che giustifica ulteriormente la nostra scelta dello 0,2% di formaldeide in questo protocollo. Tuttavia, gli embrioni controllo GFP dovrebbero sempre essere reticolati in parallelo con il Tud complesso reticolazione nelle stesse condizioni e campioni di proteine GFP controllo dovrebbe essere eseguito al 3% - gel passaggio 7% unitamente Tud campioni complessi seguente IP. Inoltre, sia complesso Tud e il corrispondente controllo GFP 3% - aree gel 7% devono essere asportati e sottoposti ad analisi di spettrometria di massa per determinare i candidati falsi positivi che saranno presenti in entrambi i complessi banda Tud ed il controllo GFP.
L'efficacia del vivo reticolazione in è stato determinato confrontando gratuito proteine Tud e complesso Tud dal controllo non reticolato ed embrioni campioni reticolati rispettivamente (Figura 2A). Proteine gratuita Tud da embrioni di controllo non reticolato quasi exclusively migrato attraverso il 3% - 7% confine con importo minimo trattenuto vicino alla zona di confine (Figura 2A, corsia 1). Contrariamente a ciò, gli embrioni reticolati hanno mostrato la presenza di un gran peso molecolare complesso reticolato Tud al 3% - bordo 7% gel (Figura 2A, corsia 2). Questo ha chiaramente dimostrato che la nostra procedura di reticolazione reticolato con successo circa il 50% delle proteine totali Tud con i suoi partner che interagiscono in vivo (confronta figura 2A corsia 1 e 2).
L'eluizione competitivi con HA-peptide confermato la purificazione successo e rafforzato la specificità del complesso proteico purificato Tud (Figura 2B). La frazione di eluizione per HA-peptide contenente il complesso concentrato intorno al 3% - zona di frontiera del 7% e anche gratis Tud proteine (Figura 2B, corsia 1). Di seguito tampone campione SDS eluita per lo più gratuiti Tud rimanendo sulle perline e quantità minima di complessi Tud (
. Figura 1 Schema del 3% -. Gel passaggio 7% utilizzato per SDS-PAGE Il 3% - gel passaggio 7% viene colato manualmente in modo tale che essa contiene tre strati. Dall'alto verso il basso, questi strati sono 3% gel impilabili, 3% gel di separazione e il 7% gel di separazione. Per lavorare con il sistema Mini-PROTEAN (Bio-Rad) utilizzato in questo manoscritto, l'altezza del gel di separazione 3% è stato fatto per essere circa 1 cm come illustrato nel diagramma.
Nota: Il impilabile gel 3% e il 3% che separano strati di gel sono estremamente fragili in modo da utilizzare estrema cautela nel maneggiare il gel per evitare la distorsione di questi strati.
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. Figura 2 risultati Western Blot di embrioni reticolati ed embrioni di controllo lisati e purificazione di Tudor proteina complessa da IP Panel A, corsia 1, greggio proteine lisato di embrioni di controllo non reticolato.; corsia 2, greggio proteine del lisato da formaldeide embrioni reticolati. Pannello B, corsia 1, eluizione di HA-peptide dopo IP dal reticolato embrione lisato; corsia 2, eluizione da 2 x tampone campione SDS dopo l'iniziale HA-peptide eluizione. SDS-PAGE è stato eseguito a 200 V per 3,5 ore. Anticorpi anti-HA (1:1.000) è stato utilizzato in Western Blot.
Figura 3. Risultati Western Blot di embrioni reticolati ed embrioni di controllo che esprimono GFP HA-tag. Corsia 1, proteina grezza lisato of embrioni di controllo non reticolato; corsia 2, stessa corsia 1 ma il doppio della quantità; corsia 3, greggio proteine lisato di embrioni reticolati con 0,1% di formaldeide; corsia 4, stessa corsia 3, ma il doppio della quantità; corsia 5, greggio proteine lisato di embrioni reticolati con 0,2% di formaldeide; corsia 6, stessa corsia 5 ma doppio dell'importo; corsia 7, greggio proteine lisato di embrioni reticolati con 0,3% di formaldeide; corsia 8, stessa corsia 7, ma il doppio dell'importo. Corsia 9, lisato grezzo di embrioni reticolati con 0,5% di formaldeide. SDS-PAGE è stato eseguito a 200 V per 45 minuti in un 4% - gel pendenza del 15%. Anticorpi anti-HA (1:1.000) è stato utilizzato in Western Blot.
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Discussion
La formaldeide è stato comunemente usato come reagente di reticolazione per identificare proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. La sua buona solubilità e permeabilità della membrana cellulare, unitamente alla compatibilità con valle procedure di spettrometria di massa, rendono formaldeide un agente candidato ideale per applicazioni di reticolazione intracellulari 3,15-17. In particolare, è stato usato con successo per identificare mRNA associati Vasa, un critico elicasi RNA di cellule germinali in Drosophila 11. Inoltre, la formaldeide è uno dei più brevi bracci distanziatori (2,3-2,7 a) nella reticolanti disponibili in commercio, il che implica che solo le molecole che esistono in prossimità sarebbero reticolati in condizioni adeguate, rafforzando la specificità dei partner interagenti della proteina bersaglio . Per le ragioni sopra esposte, la formaldeide è stata scelta come agente reticolante nel nostro protocollo. Tuttavia, questo non deve escludere la usefulness di altri agenti di reticolazione a in applicazione vivo di embrioni di Drosophila. Tuttavia, abbiamo cercato di utilizzare ditiobis (succinimidil propionato) (DSP), un N-idrossisuccinimmide (NHS) estere crosslinker famiglia spesso usato in combinazione con formaldeide in saggi ChIP 17,18, per sostituire la formaldeide nel nostro studio, ma senza apparente Tud complesso è stato ottenuto con questa reticolante D'altra parte, DSP potrebbe essere efficace per altri complessi proteici che dovranno essere determinati caso per caso. Oltre a approccio in vivo reticolazione, reticolanti in vitro da bismaleimidohexane (BMH) famiglia hanno dimostrato di essere efficaci nel catturare le interazioni proteina-proteina in Drosophila embrioni 14,19, tuttavia, in questi esperimenti si è verificato dopo la reticolazione sono stati inviati estratti embrionali.
Il tempo di reticolazione, la temperatura e la concentrazione di formaldeide sono tre principali fattoritori che influenzano reticolazione efficienza. Il nostro protocollo è stato testato con esperimenti pilota per ogni singolo fattore, pertanto, è stato ottimizzato per la reticolazione delle proteine Tud e dei suoi partner interagenti in embrioni di Drosophila in vivo, pur mantenendo l'equilibrio tra la specificità del complesso reticolato e il rischio di reticolazione le molecole non specifici. Reticolazione aspecifica porta alla presenza di falsi positivi nel complesso e deve essere attentamente controllata con un controllo proteina non correlata, per esempio GFP, che è stato utilizzato nei nostri esperimenti. Inoltre, le condizioni ottimali di reticolazione possono variare con differenti molecole bersaglio. Pertanto, utilizzando il protocollo come punto di partenza, il tempo ottimale di reticolazione, la temperatura e la concentrazione di formaldeide dovrà essere determinato per un dato complesso della proteina di interesse.
Una volta stabilite le condizioni ottimali di reticolazione è fondamentale foLlow con precisione ogni volta che gli embrioni sono reticolati per minimizzare reticolazione aspecifica. Ulteriori passo cruciale sta lavando le perline dopo IP con alta concentrazione di NaCl (1 M) e due detergenti (IGEPAL CA-630 e Tween-20) per ridurre il legame aspecifico di proteine non correlate da estratti embrionali ai talloni.
Il nostro protocollo dipende dalla alta affinità tra la proteina bersaglio e l'anticorpo utilizzato per abbassare il complesso proteico durante IP. Pertanto, epitopo della anticorpo nella proteina target non deve essere distrutto mediante reticolazione e deve essere accessibile per l'anticorpo durante IP. Inoltre, l'interazione proteina-anticorpo bersaglio deve sopportare i lavaggi stringenti finalizzate alla riduzione delle proteine di fondo non specifica. Questi requisiti per IP successo potrebbero impedire una dall'impiego di una particolare combinazione anticorpo-epitopo, tuttavia, dovrebbe essere possibile trovare una coppia anticorpi epitopo adatto per una proteina di interesse. In particolare, HA-epitopo e il corrispondente anticorpo sono stati utilizzati con successo in questo protocollo.
Il protocollo descritto può essere usato per l'isolamento di complessi proteina nativa durante le diverse fasi di sviluppo e in differenti tessuti. Anche se dimostriamo questo metodo per Drosophila, il nostro protocollo può essere adattato per altri organismi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng per il loro aiuto tecnico con questo studio. Questo lavoro è stato supportato da NSF Career Grant MCB-1054962 a ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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