Summary
مجمعات البروتين متعدد العناصر تلعب دورا حاسما خلال وظيفة الخلوية والتنمية. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل المجمعات البروتين الأصلي من أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي بعد يشابك تليها تنقية المجمعات crosslinked لاحقة تحليل هيكل وظيفة.
Abstract
يتم التحكم في العديد من العمليات الخلوية عن طريق المجمعات البروتين multisubunit. كثيرا ما تشكل هذه المجمعات عابر وتتطلب البيئة المحلية لتجميع. لذلك، لتحديد هذه المجمعات البروتين وظيفية، من المهم لتحقيق الاستقرار لهم في الجسم الحي قبل تحلل الخلايا وتنقية لاحقة. نحن هنا وصف الطريقة المستخدمة لعزل كبير مجمعات البروتين حسن النية من أجنة ذبابة الفاكهة. ويستند هذا الأسلوب على permeabilization الجنين والاستقرار في المجمعات داخل الأجنة في الجسم الحي بواسطة يشابك باستخدام تركيز منخفض من الفورمالديهايد، والتي يمكن بسهولة عبر غشاء الخلية. في وقت لاحق، وimmunopurified مجمع البروتين من الفائدة تليها تنقية جل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. نحن لتوضيح هذه الطريقة باستخدام تنقية مجمع البروتين تيودور، وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية. تيودور هو بروتين كبيرة، والذي يحتوي على مجالات متعددة تيودور - الصغيرةالوحدات التي تتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينات المستهدفة. هذه الطريقة يمكن تكييفها لعزل المجمعات البروتين الأصلي من الكائنات الحية والأنسجة المختلفة.
Introduction
يتم تنفيذ عزل التجمعات البروتين multisubunit والمجمعات الحمض النووي RNA أو البروتين لتحديد المجمعات البروتين، ومواضع الجيني معترف بها من قبل البروتينات التنظيمية ملزمة الحمض النووي RNA أو أهداف من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي. طرق مختلفة تسمح تحديد على نطاق الجينوم الحمض النووي من المواقع المعترف بها من قبل عوامل النسخ أو البروتينات لونين (رقاقة وما يليها) 1 وأهداف RNA يرتبط مع بروتين ملزمة الحمض النووي الريبي معين (CLIP وما يليها) 2. ثم يتم التسلسل عميق مكتبات cDNAs المستمدة من الحمض النووي الريبي DNA أو أهداف. استخدام هذه الأساليب الكيميائية أو عبر ربط لتحقيق الاستقرار في المجمعات تليها مناعي (IP) مع الأجسام المضادة ضد أحد مكونات البروتين من مجمع درس الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية.
خلال تطوير كائن حي، وكثير من المجمعات البروتين تشكيل عابر. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحليل تكوين وظيفة هذه المجمعات في الجسم الحي لفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديفelopment. ان مثل هذا التحليل في الجسم الحي تكون متفوقة على النهج في المختبر لأنه يكاد يكون من المستحيل لإعادة إنتاج تركيزات مواطن من مكونات التفاعل والبيئة البيوكيميائية الخلوية في المختبر. نحن هنا إثبات وجود في الجسم الحي النهج التي نستخدمها بنجاح لعزل البروتين المجمعات الكبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة. في هذه الطريقة، crosslinked المجمعات البروتين في الأجنة الحية مع تركيز منخفض من الفورمالديهايد، وبعد ذلك يتم عزل المجمعات البروتين من الفائدة عن طريق IP مع الأجسام المضادة ضد عنصر معروف من المجمعات تليها هلام تطهير المجمعات وتحليل الطيف الكتلي ل تحديد مكونات معقدة غير معروفة. منذ الفورمالديهايد قادرة على تتخلل غشاء الخلية ويبلغ مداه يشابك من 2،3-2،7 Å 3، مجمعات البروتين يمكن crosslinked في الجسم الحي، ويحتمل أن تكون قريبة من بعضها البعض في مكونات معقدة. في هذه المادة ونحنتصف هذه الطريقة باستخدام عزلة تيودور (TUD) بروتين معقد كمثال على ذلك. TUD هو بروتين سلالة الجرثومية وهو أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية 4-7. هذا البروتين يحتوي على 11 المجالات TUD معروفة للتفاعل مع arginines أو lysines ميثليته من البروتينية الأخرى 8-10.
في السابق، ونحن قد ولدت خط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر HA الموسومة الوظيفية TUD 5 وبالتالي، يتم استخدام محددة لمكافحة HA الأجسام المضادة لهدم مجمع TUD بعد يشابك.
بالإضافة إلى crosslinks البروتين البروتين، يمكن أن الفورمالديهايد توليد النووي crosslinks حمض البروتين ويستخدم في التجارب رقاقة وما يليها. علاوة على ذلك، في ذبابة الفاكهة، في الجسم الحي مع يشابك الفورمالديهايد سمحت تحديد هدف الحمض النووي الريبي من البروتين RNA helicase فاسا 11.
بينما في هذه المادة ونحن تصف طريقة لفي الجسم الحي يشابك وبورification المجمعات البروتين من أجنة ذبابة الفاكهة، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للكائنات والأنسجة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد كبيرة عصير التفاح لوحات أجار
- لجعل 4 لوحات، إضافة 375 مل من H 2 O، 11.25 غرام ذبابة أجار وبقضيب إلى قارورة 1،000 مل. هذا هو مزيج A. A الأوتوكلاف ميكس مع غطاء قارورة توج فضفاضة على دورة واحدة و 30 دقيقة التعقيم للبضائع السائلة.
- إضافة 125 مل عصير التفاح، 12.5 غرام سكر المائدة وبقضيب إلى كوب 500 مل. هذا هو ميكس ميكس الحرارة B. B على منصة ساخنة مع التحريك والحفاظ على درجة الحرارة عند حوالي 70 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من التعقيم من مزيج A.
- عند الانتهاء من خلط التعقيم، ونقل ميكس ميكس A. B لنضع الخليط مع التحريك مجتمعة بلطف واتركها تبرد لمدة 15 دقيقة. تجنب الإفراط في التبريد والتصلب أجار نتج قبل إضافة المواد الحافظة.
- جعل 10٪ (وزن / حجم) الميثيل الحل 4-hydroxybenzoate في الايثانول. وهذا التصرف كمادة حافظة. إضافة 3.75 مل من الحل إلى ما سبق التفاح خليط عصير أجار. الحفاظ على التحريك لمدة anotheص 5 دقائق.
- صب 125 مل عصير التفاح أغار خليط مع المواد الحافظة في كل 300 سم 2 أو لوحة من البلاستيك الستايروفوم. اتركها تبرد لRT ويصلب. تجنب تشكيل فقاعات الهواء بينما تتدفق.
ملاحظة: التفاح وعصير لوحات أجار تكون جاهزة للاستخدام فورا. تغطية لوحات غير المستخدمة مع يلف واضحة وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
2. ذبابة الفاكهة الأجنة جمع ومعالجة ما قبل يشابك
- تحميل قفص السكان مع ما يقرب من 40،000 إلى 50،000 الذباب التي سيتم جمعها الأجنة.
- جعل اثنين من لوحات كل منها يحتوي على 125 مل من معيار دقيق الذرة، دبس المتوسطة 12 ويرش حوالي 4 غرام من خميرة الخباز المجففة على كل لوحة. وضع هذه اللوحات في قفص السكان في الحاضنة 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتسمين الذباب.
- 2 التفاح الدافئ لوحات عصير أجار إلى 25 درجة مئوية. رش حوالي 1 غرام من خميرة الخباز المجففة على كللوحة. وضع لوحات 2 في القفص السكان للبدء في جمع 0-1 الأجنة ساعة قديمة.
- تأخذ بها لوحات في نهاية جمع 1 ساعة. استبدال لوحات جديدة 2 إذا كان هناك حاجة جولة أخرى من المجموعة.
- إضافة كمية كافية من الماء لتغطية لوحات و resuspend الأجنة برفق باستخدام فرشاة الطلاء بشكل جيد. صب الأجنة معلق من خلال غربال اثنين من طبقة مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة أسلاك الفولاذ.
ملاحظة: تتكون الطبقة العليا من متوسطة حجم المسام (850 ميكرون) عيون الذي يجمع أجزاء كبيرة ذبابة حين السماح من خلال الأجنة. تتكون طبقة السفلي من شبكة غرامة (75 ميكرون) الذي يجمع أجنة في حين ترك من خلال الخميرة والماء. - استخدام فرشاة الطلاء غرامة لنقل الأجنة التي تم جمعها في سلة جمع مصنوعة من أنبوب 50 مل وغرامة شبكة من النايلون. شطف الأجنة لفترة وجيزة مع الماء ثم صمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
- تزج الأجنة في التبييض 50٪ مع يحوم طيف لمدة 3 دقائق. شطف شامللاي بالماء لإزالة أي مواد التبييض المتبقية. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
- تزج الأجنة dechorionated في الأيزوبروبانول مع الإثارة لطيف لمدة 15 ثانية أو حتى انهيار كتل متعددة الجنين (هذا لا ينبغي أن تستغرق وقتا أطول من 30 ثانية). وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف تماما.
- تزج الأجنة في هيبتان لمدة 5 دقائق أثناء استخدام ماصة لتيار هيبتان أكثر من الأجنة لابقائهم معلق. وصمة عار شبكة على مناشف ورقية لتجف.
- شطف الأجنة مع تيارات من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS) تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (PBST) لمدة 3 دقائق.
- تفكيك سلة جمع ونقل الأجنة إلى جانب شبكة لأنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل PBST. عكس الأنبوب برفق لغسل الأجنة خارج شبكة.
- إزالة شبكة من الأنبوب. وضع أنبوب في وضع عمودي، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية.
ملاحظة: ما يقرب من 100-300ومن المتوقع لمجموعة 1 ساعة من قفص واحد ميكرولتر من الأجنة. - إزالة PBST والاستمرار في أداء يشابك على الفور.
3. في الجسم الحي يشابك من الأجنة التي يتم جمعها
- إعداد 0.2٪ الفورمالديهايد في PBST فورا قبل الاستخدام. إضافة 10 مل من تثبيتي الفورمالديهايد إلى الأجنة واحتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 10 دقيقة. تجاهل تثبيتي غير المستخدمة في نهاية اليوم.
- إخماد رد فعل يشابك
- في نهاية يشابك، والسماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب.
- إزالة الحل الفورمالديهايد. إضافة على الفور 10 مل من 0.25 M الجلايسين في PBST لإرواء رد فعل يشابك. احتضان عند 25 درجة مئوية مع الإثارة لطيف على شاكر دوارة لمدة 5 دقائق.
- السماح للأجنة تنزل الى قاع الأنبوب. إزالة الحل إخماد. غسل الأجنة مع 10 مل من PBST ثلاث مرات.
- تماما إزالة Pالحل غسل BST باستخدام ماصة. متجر الأجنة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. إعداد نموذج البروتين ومناعي
- التجانس 500 ميكرولتر الأجنة crosslinked باستخدام الخالط Dounce في 2 مل العازلة تحلل (0.5 M اليوريا، 0.01٪ SDS، 2٪ تريتون X-100، 2 مم phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF] ومثبط البروتياز كوكتيل في برنامج تلفزيوني).
ملاحظة: تنفيذ هذه والخطوات التالية في RT ما لم ينص على خلاف ذلك. - نقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي والصخور بلطف على منصة دوارة لمدة 15 دقيقة لضمان تحلل شامل. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 16،000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوية. حفظ طاف في أنبوب 15 مل نظيفة.
- إضافة 40 ميكرولتر الخرز الاغاروز مكافحة HA الطين لطاف واحتضان على منصة دوارة لمدة 2.5 ساعة.
- بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف ولكن ترك APPROximately 250 ميكرولتر في الأنبوب. resuspend والخرز في طاف المتبقية ونقل إلى عمود الدوران 1.5 مل مع 10 ميكرون فلتر المسام.
- أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران في 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل من خلال تدفق.
- تغسل حبات بإضافة 200 ميكرولتر غسل العازلة (0.1 M الجلايسين، 1 M كلوريد الصوديوم، 1٪ IGEPAL CA-630، 0.1٪ توين 20، في برنامج تلفزيوني). أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وتجاهل غسيل. تكرار غسل مرتين أخريين.
- إضافة 40 ميكرولتر العازلة شطف (2 ملغ / مل HA-الببتيد في برنامج تلفزيوني) إلى الخرز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف كل 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في العمود 12،000 x ج لمدة 10 ثانية وجمع شطافة.
- تأكيد شطف للمجمع عن طريق التحليل الغربي لطخة استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة HA 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تحليل فعالية يشابك وتنقية الناجح للبروتين معقد TUD crosslinked بواسطة SDS-PAGE على 3٪ - 7٪ خطوة هلام (موضح في الشكل 1)، يليه لطخة غربية (الشكل 2).
ويستند 7٪ هلام خطوة على الفصل الفعال للcrosslinked بروتين معقد TUD من البروتين المتبقية uncrosslinked TUD وتركيز المجمع - الغرض من استخدام 3٪. لدينا تحت ظروف في الجسم الحي يشابك المذكورة أعلاه، فإن نسبة كبيرة من البروتين يمكن أن TUD لا تزال uncrosslinked. فإن هذا البروتين TUD الحرة copurify مع مجمع crosslinked خلال IP حتى الفصل من قبل SDS-PAGE. على الرغم كبيرة الحجم، uncrosslinked البروتين TUD (285 كيلو دالتون) يهاجر عبر 3٪ - 7٪ دون الحدود الاحتفاظ اضحة. في حين crosslinked بروتين معقد TUD مع الوزن الجزيئي أكبر ستواجه صعوبة المهاجرة عبر الحدود هلام، مما أدى في اله معقدة يجري "المحاصرين" وتتركز على الحدود أو "المخلفات" بالقرب من الحدود، وبالتالي، فصل من البروتين TUD الحرة.
إدراج الرقابة السليمة أمر بالغ الأهمية للتحقق من صحة خصوصية هذا البروتوكول يشابك. لذلك، كنا أجنة معربا HA الموسومة البروتين GFP 14 لرصد مدى يشابك. لقد أجريت التجارب الرائدة من تركيزات مختلفة الفورمالديهايد (0.1٪ - 2٪) على الأجنة معربا عن GFP الموسومة HA وجزء من النتائج (0.1٪ - 0.5٪) وتظهر هنا (الشكل 3). فمن الواضح أن الأغلبية المطلقة من البروتين GFP في الأجنة المعالجة (تصل إلى 0.5٪ الفورمالديهايد) ظلت uncrosslinked، الذي صدق أن بروتوكول يشابك لدينا لا تشعبي البروتين المستهدف لجزيئات المحيطة عشوائي. على وجه الخصوص، فإن 0.2٪ الفورمالديهايد العلاج (الشكل 3، حارة 5 و 6) لا تظهر أي منتجات crosslinked بالمقارنة مع uncrالسيطرة osslinked (الشكل 3، حارة 1 و 2) على الرغم من وقت التعرض ممتدة من الفيلم، الذي برر مزيد خيارنا من 0.2٪ الفورمالديهايد في هذا البروتوكول. ومع ذلك، ينبغي دائما أن crosslinked الأجنة السيطرة GFP بالتوازي مع يشابك معقدة TUD في ظل نفس الظروف وعينات البروتين GFP السيطرة يجب تشغيل على 3٪ - 7٪ هلام خطوة جنبا إلى جنب مع عينات معقدة TUD التالية IP. بالإضافة إلى ذلك، على حد سواء معقدة TUD وما يقابلها من السيطرة GFP 3٪ - يجب رفعه المناطق هلام 7٪، وقدمت لتحليل الطيف الكتلي لتحديد المرشحين إيجابية كاذبة من شأنها أن تكون موجودة في كل TUD الفرقة المعقدة والتحكم GFP.
تم تحديد فعالية في الجسم الحي يشابك بمقارنة البروتين TUD حرة ومعقدة TUD من السيطرة uncrosslinked والأجنة crosslinked العينات على التوالي (الشكل 2A). البروتين TUD خالية من الأجنة السيطرة uncrosslinked exclusivel تقريباهاجر ذ عبر 3٪ - 7٪ مع الحدود كمية ضئيلة الاحتفاظ بالقرب من المنطقة الحدودية (الشكل 2A، حارة 1). خلافا لذلك، أظهرت الأجنة crosslinked حضور كبير الوزن الجزيئي TUD معقدة crosslinked بنسبة 3٪ ل- 7٪ هلام الحدود (الشكل 2A، 2 لين). هذا وأظهرت بوضوح أن الإجراء يشابك دينا crosslinked بنجاح حوالي 50٪ من البروتين الكلي مع TUD في الجسم الحي شركاء التفاعل (قارن الشكل 2A حارة 1 و 2).
شطف تنافسية مع HA-الببتيد أكد تنقية الناجحة وتعزيز خصوصية المنقى TUD البروتين المعقدة (الشكل 2B). الكسر شطف بواسطة HA-الببتيد الواردة مجمع تتركز حول 3٪ - 7٪ المنطقة الحدودية وأيضا خالية من البروتين TUD (الشكل 2B، حارة 1). عينة العازلة SDS التالي مزال معظمها الحرة المتبقية TUD على الخرز والحد الأدنى من مجمع TUD (
الشكل 1 مخطط من 3٪ - 7٪ ويلقي خطوة هلام يدويا في مثل هذه الطريقة أنه يحتوي على ثلاث طبقات - 7٪ هلام خطوة تستخدم لSDS-PAGE ال 3٪. من أعلى إلى أسفل، هذه الطبقات هي 3٪ هلام التراص، 3٪ هلام فصل و 7٪ هلام فصل. للعمل مع نظام ميني متلون (بيو راد) المستخدمة في هذه المخطوطة، وجعل ارتفاع 3٪ هلام فصل أن يكون حوالي 1 سم كما هو مبين في الرسم البياني.
ملاحظة: الجل التراص 3٪ و 3٪ هلام فصل طبقات هشة للغاية وذلك باستخدام الحذر عند التعامل مع الجل لمنع تشويه هذه الطبقات.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. الرقم 2 نتائج طخة غربية الأجنة والأجنة crosslinked تحكم لست] وتنقية تيودور معقدة البروتين IP لوحة A، حارة 1، المحللة البروتين الخام من الأجنة السيطرة uncrosslinked؛ 2 لين، المحللة البروتين الخام من الفورمالديهايد الأجنة crosslinked. لوحة ب، حارة 1، شطف بواسطة HA-الببتيد بعد IP من crosslinked الجنين المحللة؛ 2 لين، شطف من 2 × SDS عينة العازلة بعد الأولي شطف HA-الببتيد. تم تشغيل SDS-PAGE عند 200 V مقابل 3.5 ساعة. كان يستخدم لمكافحة HA الأجسام المضادة (1:1،000) في لطخة غربية.
الشكل 3. النتائج طخة غربية الأجنة والأجنة crosslinked السيطرة معربا عن GFP الموسومة HA. لين 1، البروتين الخام المحللة سو الأجنة السيطرة uncrosslinked؛ 2 لين، نفس حارة 1 ولكن ضعف المبلغ؛ حارة 3، المحللة البروتين الخام من الأجنة باستخدام crosslinked 0.1٪ الفورمالديهايد؛ 4 حارات، نفس حارة 3، ولكن ضعف المبلغ؛ حارة 5، المحللة البروتين الخام من الأجنة باستخدام crosslinked 0.2٪ الفورمالديهايد؛ حارة 6، نفس حارة 5 ولكن ضعف المبلغ؛ لين 7، المحللة البروتين الخام من الأجنة باستخدام crosslinked 0.3٪ الفورمالديهايد؛ حارة 8، نفس حارة 7 ولكن ضعف المبلغ. لين 9، المحللة الخام من الأجنة باستخدام crosslinked 0.5٪ الفورمالديهايد. تم تشغيل SDS-PAGE عند 200 V لمدة 45 دقيقة في 4٪ - 15٪ هلام التدرج. كان يستخدم لمكافحة HA الأجسام المضادة (1:1،000) في لطخة غربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد الفورمالديهايد يشيع استخدامها بوصفها كاشف يشابك لتحديد البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. حسن الذوبان ونفاذية غشاء الخلية، جنبا إلى جنب مع التوافق مع الإجراءات مطياف الكتلة المصب، وجعل الفورمالديهايد وكيل المرشح المثالي لتطبيقات الخلايا يشابك 3،15-17. على وجه الخصوص، تم استخدامه بنجاح لتحديد mRNAs والمرتبطة فاسا، وhelicase الحمض النووي الريبي الخلية الجرثومية حاسما في ذبابة الفاكهة 11. بالإضافة إلى ذلك، الفورمالديهايد واحدة من أقصر الأسلحة فاصل (2،3-2،7 Å) بين crosslinkers المتاحة تجاريا، مما يعني أن الجزيئات الوحيدة التي توجد على مقربة من شأنه أن crosslinked في ظل الظروف المناسبة، وتعزيز خصوصية الشركاء التفاعل من البروتين المستهدف . للأسباب المذكورة أعلاه، تم اختيار الفورمالديهايد وكيلا يشابك في بروتوكول لدينا. ومع ذلك، هذا لا ينبغي أن يستبعد يوsefulness من وكلاء يشابك أخرى في الجسم الحي في التطبيق لأجنة ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، حاولنا استخدام dithiobis (succinimidyl بروبيونات) (DSP)، وN-hydroxysuccinimide (NHS) استر crosslinker الأسرة التي يكثر استخدامها في تركيبة مع الفورمالديهايد في فحوصات الشذرة 17،18، ليحل محل الفورمالديهايد في دراستنا، ولكن لا واضحة TUD تم الحصول المعقدة مع هذا crosslinker من ناحية أخرى، DSP قد تكون فعالة للمجمعات البروتين الأخرى التي سوف تحتاج إلى أن تحدد على أساس كل حالة على حدة. بالإضافة إلى نهج يشابك في الجسم الحي، وقد ثبت في المختبر crosslinkers من bismaleimidohexane (BMH) الأسرة أن تكون فعالة في التقاط تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة الأجنة 14،19، ومع ذلك، في هذه التجارب وقعت بعد يشابك قدمت مقتطفات الجنين.
الوقت يشابك، ودرجة الحرارة وتركيز الفورمالديهايد هي القوات المسلحة الكونغولية الرئيسية الثلاثةالاختصاصات التي تؤثر على كفاءة يشابك. وقد تم اختبار باستخدام بروتوكول لدينا تجارب رائدة لكل عامل على حدة، وبالتالي، تم تحسين ذلك ليشابك من البروتين TUD والشركاء التفاعل في أجنة ذبابة الفاكهة في الجسم الحي، مع الحفاظ على التوازن بين خصوصية معقدة crosslinked وخطر يشابك جزيئات غير محددة. يشابك غير محدد يؤدي إلى وجود ايجابيات كاذبة في المجمع ويجب أن تسيطر عليها بعناية مع عنصر تحكم البروتين لا علاقة لها، على سبيل المثال GFP، والتي كانت تستخدم في تجاربنا. بالإضافة إلى ذلك، قد تختلف الظروف يشابك الأمثل مع الجزيئات المستهدفة المختلفة. وبالتالي، سوف تستخدم بروتوكول لدينا كنقطة انطلاق، في الوقت يشابك الأمثل، ودرجة الحرارة وتركيز الفورمالديهايد يتعين تحديد لمجمع بروتين معين من الفائدة.
مرة واحدة وضعت الشروط يشابك الأمثل فمن الأهمية بمكان أن FOllow منهم على وجه التحديد في كل مرة يتم crosslinked الأجنة للتقليل من يشابك غير محددة. خطوة حاسمة إضافية يتم غسل حبات بعد IP مع تركيز عال من كلوريد الصوديوم (1 M) واثنين من المنظفات (IGEPAL CA-630 وتوين 20) لخفض ملزم غير محدد من البروتينات لا علاقة لها من مقتطفات الجنينية إلى الخرز.
بروتوكول لدينا يعتمد على قابلية عالية بين البروتين الهدف والأجسام المضادة المستخدمة لهدم مجمع البروتين خلال IP. لذلك، لا ينبغي أن دمرت حاتمة الأجسام المضادة في البروتين المستهدف من قبل يشابك ويجب أن تكون متاحة للأجسام المضادة خلال IP. بالإضافة إلى ذلك، يجب على الضد المستهدفة التفاعل البروتين الصمود في وجه يغسل صارمة تهدف إلى الحد من البروتينات خلفية غير محددة. هذه المتطلبات لنجاح IP قد منع أحد من توظيف خاصة مزيج الأجسام المضادة حاتمة، ومع ذلك، فإنه ينبغي أن يكون من الممكن العثور على الزوج الضد حاتمة مناسبة للبروتين من الفائدة. على وجه الخصوص، وقد استخدمت HA-العلامة حاتمة والأجسام المضادة المقابلة بنجاح في هذا البروتوكول.
بروتوكول وصف يمكن استخدامها لعزل بروتين المجمعات الأم خلال مراحل النمو المختلفة والأنسجة المختلفة. على الرغم من أننا شرح هذا الأسلوب لذبابة الفاكهة، يمكن تكييفها لدينا بروتوكول للكائنات الحية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر الأردن ديفيس، يانيان لين، اريك شادلر وJimiao تشنغ للمساعدة التقنية مع هذه الدراسة. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني وظيفيه منح MCB-1054962 لALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
