Summary
多组分蛋白复合物的细胞功能和发展过程中发挥关键作用。在这里，我们描述了用于从果蝇胚胎分离的天然蛋白质复合物后，随后交联的复合物用于随后的结构-功能分析的纯化在体内交联的方法。
Abstract
许多细胞过程是由多亚基蛋白复合体的控制。经常这些复合物形成短暂且需要本地环境来组装。因此，能够识别这些功能性蛋白质复合物，其以它们稳定在细胞裂解和随后的纯化前体是很重要的。在这里，我们描述了用于分离大的善意蛋白复合物从果蝇胚胎的方法。此方法是基于使用的甲醛浓度低，它可以很容易地穿过细胞膜由体内交联的胚胎内的复合物的胚胎透化和稳定化。随后，感兴趣的蛋白质复合物被免疫纯化后凝胶纯化并通过质谱法进行分析。我们使用的铎蛋白复合物，它是种系发育必不可少纯化说明这种方法。都铎王朝是一个大的蛋白质，它包含多个域的都铎王朝 - 小模块与靶蛋白的甲基化精氨酸或赖氨酸互动。这个方法可以适用于天然蛋白质复合物从不同的生物体和组织的隔离。
Introduction
的多亚基蛋白装配和DNA或RNA-蛋白质复合物的分离进行识别的蛋白质复合物，通过DNA-结合调节蛋白或RNA结合蛋白的RNA靶标确认的基因位点。不同的方法允许通过具有给定的RNA结合蛋白（CLIP-SEQ）2相关的转录因子或染色质蛋白（芯片起）1和RNA靶标确认的DNA位点的全基因组鉴定。的RNA衍生的cDNA或DNA靶库，然后深深的测序。这些方法使用化学或紫外线诱导的交联，以与针对所研究的复合物的蛋白组分的抗体稳定后跟免疫沉淀（IP）的配合物。
在一个生物体的发展，许多蛋白质复合物形成短暂。因此，关键的是要分析这些复合物在体内的组成和功能，了解控制dev的分子机制elopment。这样的体内分析将优于在体外的方法，因为这几乎是不可能重现交互的组件和细胞生物化学环境体外的天然浓度。在这里，我们表明，我们成功地使用从果蝇胚胎中分离大蛋白复合物在体内的方法。在该方法中，蛋白质复合物中的活胚交联与甲醛的低浓度，其后的兴趣蛋白质复合物被分离出的IP与抗体对复合物随后的复合物和质谱分析的凝胶纯化的已知成分识别未知的复杂组件。由于甲醛是能够渗透细胞膜并具有2.3-2.7埃3的交联范围内，蛋白质复合物可被交联的体内和复杂的组件都可能是彼此接近的。在这篇文章中，我们采用都铎（TUD）蛋白复合物的分离作为一个例子说明这种方法。 TUD是一个种系的蛋白这是种系发育4-7必不可少的。该蛋白含有11已知与其他多肽8-10的甲基化精氨酸或赖氨酸互动TUD域。
以前，我们已经产生的转基因果蝇行其表达HA-标记的功能TUD 5，因此，特定的抗HA抗体用于拉下TUD复杂交联后。
除了蛋白质 - 蛋白质交联，甲醛可产生核酸 - 蛋白质交联，并用于在芯片起实验。此外，在果蝇中 ， 在体内与甲醛交联已经允许瓦萨RNA解旋酶蛋白11的RNA靶的鉴定。
虽然本文中，我们描述了一种用于体内交联和PUR蛋白质复合物从果蝇胚胎的ification，这种方法可以适用于其它生物体和组织。
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Protocol
1，准备大苹果汁琼脂平板
- 为了使4片，加375毫升H 2 O，11.25克飞琼脂和搅拌棒的1000ml的烧瓶中。这是驴友A.高压灭菌混合物A与烧瓶盖子松松地盖上瓶盖在一个30分钟灭菌循环液体货物。
- 添加125毫升苹果汁，12.5克蔗糖和搅拌棒，以500毫升的烧杯中。这是混合B.热混合物B在加热平台，同时搅拌并保持温度在约70℃，直至混合物A的高压灭菌完成。
- 在完成混合的高压灭菌，转移混合物B到A。混合轻轻保持搅拌组合的混合物，让它冷却15分钟。避免过度冷却，并加入防腐剂之前所得到琼脂凝固。
- 使10％（重量/体积）甲基乙醇4 - 羟基苯甲酸溶液。这将作为防腐剂。加3.75毫升解决上述苹果汁琼脂混合物。继续搅拌anothe令第5分钟。
- 倒125毫升苹果汁琼脂混合物，防腐剂为各300 平方厘米的塑料或泡沫塑料板。让它冷却至室温，并巩固。避免气泡的形成，同时浇筑。
注：苹果汁琼脂平板上就可以立即使用。覆盖未使用的板材有明确的包裹，并在4℃下保存长达一个星期。
2， 果蝇胚胎收集和预交联处理
- 加载人口笼约40,000至50,000苍蝇从胚胎将被收集。
- 使每片含125毫升标准玉米面，糖蜜培养基12两个板块，洒上约4g每盘干面包酵母。将这些板块进笼子人口在25℃培养箱中培养48小时催肥的苍蝇。
- 暖2苹果汁琼脂平板上25℃。撒上约1g每个干面包酵母板。将2板块在人口笼开始收集0-1小时大的胚胎。
- 取出板在1小时收集的末端。有2个新板更换是否需要新一轮的集合。
- 加入足够的水覆盖板和用细画笔轻轻悬浮胚胎。通过做出来的不锈钢丝网两层筛子倒入悬浮胚胎。
注：顶层是由中等孔径（850微米）目，同时通过让胚胎用于收集大飞零部件。底部层由细网孔（75微米），而通过酵母和水让其收集胚胎。 - 用优良的油漆刷将采集到的胚胎转移到一个50毫升管和细尼龙网制成的集合篮子。用清水冲洗短暂的胚胎，然后涂抹在纸巾网格晾干。
- 沉浸胚胎在50％漂白伴以轻轻旋转3分钟。彻底冲洗LY与水以除去任何残留的漂白剂。涂抹在纸巾网格晾干。
- 沉浸在异丙醇，轻轻摇动15秒或直到多胚团块破裂的dechorionated胚胎（这不应该超过30秒）。涂抹在纸巾网格彻底干燥。
- 而用吸管流庚烷在胚胎，让他们重悬沉浸在庚烷5分钟的胚胎。涂抹在纸巾网格晾干。
- 冲洗的胚用磷酸盐缓冲盐水，pH值7.4（PBS）中的含有0.1％Triton X-100的PBS（PBST）3分钟流。
- 拆卸的收集筐和沿着与网格转移胚胎到15毫升管含有10ml PBST。颠倒离心管轻轻洗胚脱网。
- 从管中取出的网格。把该管处于垂直位置，并让胚由重力下沉到试管底部。
注：约100 - 300微升胚胎预期用于从一个轿厢的1小时收集。 - 除去PBST，继续执行立即交联。
3， 在体内收集胚胎的交联
- 在使用前配制0.2％的甲醛在PBST。加10毫升甲醛固定液的胚胎孵育在25℃下用旋转振荡器上10分钟，温和搅拌。由一天结束时丢弃未使用的固定剂。
- 淬灭交联反应
- 在交联结束时，让胚胎沉到试管底部。
- 除去甲醛溶液。立即加入10毫升的0.25M甘氨酸在PBST中以淬灭交联反应。孵育在25℃下用旋转振荡器上5分钟，温和搅拌。
- 让胚胎沉到试管底部。取出淬火液。用10ml PBST中的3次洗涤胚胎。
- 彻底删除对P用移液管BST洗涤溶液。店铺胚胎在-80℃直至使用。
4，蛋白样品制备和免疫
- 在2毫升裂解缓冲液用Dounce匀浆器匀化500μl的交联的胚胎（0.5M尿素，0.01％SDS，2％的Triton X-100，2mM的苯甲基磺酰氟[PMSF]和蛋白酶抑制剂混合物的PBS中）。
注：除非另有规定执行这一点，下面的步骤在室温。 - 裂解物转移到1.5毫升离心管中，轻轻地摇动15分钟，在旋转平台上，以确保彻底溶解。离心溶胞产物以16,000×g离心5分钟以沉淀细胞碎片。除上清液在一个干净的15ml试管中。
- 加40微升抗-HA琼脂糖珠浆液上清液孵育2.5小时的旋转平台上。
- 通过离心沉淀珠粒在2500×g离心5分钟。取出上清液，但离开欧普罗ximately250μl的在管内。重悬珠在剩余的上清液并转移到1.5ml的离心柱用10微米孔径的过滤器。
- 离心旋转柱以12,000×g离心10秒，并通过丢弃的流动。
- 通过添加200μl的洗涤缓冲液（0.1M甘氨酸，1M氯化钠，1％IGEPAL CA-630，0.1％Tween-20中，在PBS中）洗涤珠。离心柱以12,000×g离心10秒，弃去洗涤。重复上述洗涤2次以上。
- 加40微升洗脱缓冲液（2毫克/毫升的HA-肽溶于PBS中）的小珠和在37℃下进行15分钟，温和搅拌每隔5分钟。离心柱在12000×g离心10秒，收集洗脱液。
- 用抗HA抗体13确认由Western印迹分析复杂的洗脱。
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Representative Results
7％凝胶步骤（ 图1中示出），然后通过蛋白质印迹（ 图2） -交联的效率和交联TUD蛋白复合物的成功的纯化的SDS-PAGE上的3％进行了分析。
使用3％的目的 - 7％步骤凝胶是基于交联TUD蛋白复合物从复合物中剩余的未交联的TUD蛋白和浓度的有效分离。根据上面提到的我们的体内交联条件，TUD蛋白的相当大的比例可能仍然未交联的。这个自由TUD蛋白将IP在与交联复合copurify直到通过SDS-PAGE分离。虽然规模大，未交联TUD蛋白（285 kDa的）横跨3％迁移 - 7％的边界没有明显的保留。而交联TUD蛋白复合物具有较大的分子量恐难跨越边境凝胶迁移，导致在日型复被“困”，并集中在边境附近的边境或“拖尾”，因此，从自由TUD蛋白质分离。
加进一个适当的控制是至关重要的，以验证该交联的协议的特异性。因此，我们使用的胚胎表达HA-标记的GFP蛋白14来监视，交联的程度。在胚胎表达HA-标记的GFP的结果（0.1％ - 0.5％）和部分- （2％0.1％），我们已进行不同甲醛浓度的试验的实验都在这里显示（ 图3）。很显然，GFP蛋白在经处理的胚胎（高达0.5％的甲醛）的绝对多数仍然未交联的，这验证了我们的交联的协议不交联靶蛋白以无规周围的分子。特别地，0.2％甲醛处理（ 图3，泳道5和6）相比，uncr没有表现出任何的交联产物osslinked控制（ 图3，泳道1和2），尽管这部电影，这进一步说明，我们的选择0.2％的甲醛在这个协议的延长曝光时间。 7％步骤凝胶连同TUD复杂样品下面的IP - 然而，在GFP对照胚胎应始终与在相同的条件和控制的GFP蛋白样品根据TUD复合交联剂交联的并行应在3％上运行。此外，这两种TUD复杂和相应的GFP对照的3％ - 7％的凝胶区应切出，并提交了质谱分析，以确定假阳性候选，将存在于两个TUD复合带和GFP控制。
在体内交联的有效性是由来自未交联的控制和分别交联的胚胎样（ 图2A）进行比较自由TUD蛋白和TUD复杂的确定。从交联控制胚胎几乎exclusivel免费TUD蛋白Ÿ迁移跨越3％ - 7％的边界与保留的边境地区（ 图2A，泳道1）附近少量。与此相反，该交联的胚胎显示出大分子量TUD交联复合物的存在下在3％ - 7％凝胶边界 （ 图2A，泳道2）。这清楚地表明，我们的交联过程已成功，其在体内的相互作用伙伴（比较图2A泳道1和2）交联的总TUD蛋白的约50％。
在竞争性洗脱用HA-肽证实了成功的纯化和加强纯化TUD蛋白复合物（ 图2B）的特异性。由HA-肽的洗脱级分包含在复杂的集中绕3％ - 7％的边界区域，同时释放TUD蛋白（ 图2B，泳道1）。以下SDS样品缓冲液洗脱大多是免费的TUD留在珠子和TUD复杂的少量（
，3％的图1图-用于SDS-PAGE 7％步骤凝胶的3％ - 7％步骤凝胶手动投以这样一种方式，它包括三个层。从顶部至底部，这些层是3％浓缩胶，3％分离胶和7％的分离胶。与在该原稿用的迷你PROTEAN系统（Bio-Rad公司）工作，3％分离胶的高度被控制在大约1cm作为图中所描绘。
注 ：3％浓缩胶和3％分离胶层是极其脆弱的所以格外小心处理凝胶时要防止这些层的失真。
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。图2交联的胚胎和控制胚胎裂解液和通过IP控制面板中，泳道1 铎蛋白复合物纯化Western blot检测结果 ，未交联的控制胚胎的粗蛋白裂解液;泳道2，甲醛交联的胚胎粗蛋白裂解液。 B板泳道1，洗脱通过IP从交联的胚胎裂解后的HA-肽;泳道2，洗脱用2×SDS样品缓冲液的初始HA-肽洗脱后。 SDS-PAGE电泳，在200 V为3.5小时运行。抗-HA抗体（1:1,000）用于蛋白印迹分析。
图3。交联的胚胎和控制胚胎表达HA标记的绿色荧光蛋白的Western blot结果。1巷，粗蛋白裂解液Øf未交联控制的胚胎;泳道2，同车道1，但量的两倍;泳道3，用0.1％甲醛交联的胚胎粗蛋白裂解液;泳道4，同泳道3，但量的两倍;泳道5，用0.2％甲醛交联的胚胎粗蛋白裂解液;第6道，同泳道5，但量的两倍;泳道7，用0.3％甲醛交联的胚胎粗蛋白裂解液; 8车道，同车道7，但两倍。巷9，用0.5％甲醛交联的胚胎原油裂解液。 15％的梯度凝胶 - SDS-PAGE上是在4％的运行在200伏45分钟。抗-HA抗体（1:1,000）用于蛋白印迹分析。
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Discussion
甲醛已被普遍用作交联试剂用于鉴定蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 核酸相互作用。良好的溶解性和细胞膜的通透性，与下游质谱程序的兼容性在一起，使甲醛的理想人选剂胞内交联应用3,15〜17。特别是，它被成功地用于鉴定与瓦萨，在果蝇 11的临界生殖细胞RNA解旋酶相关的mRNA。此外，甲醛具有最短间隔臂之一（2.3 - 2.7 a）在市售的交联剂，这意味着只存在于邻近的分子会在适当的条件下进行交联，增强的目标蛋白的相互作用伙伴的特异性。基于上述原因，甲醛被选为在我们的协议中的交联剂。然而，这不应该排除在Usefulness在体内应用对果蝇胚胎其它交联剂。然而，我们曾尝试使用二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯交联剂的家庭中经常使用甲醛组合ChIP实验17,18，以取代甲醛在我们的研究，但没有明显的TUD与此交联剂在另一方面获得复杂的DSP也许是有效的其他蛋白复合物，将需要在逐案基础上确定。除了体内交联的方法， 在体外交联剂从bismaleimidohexane（BMH）家族已被证明是有效的捕捉在果蝇胚胎14,19蛋白质-蛋白质相互作用，然而，在这些实验中发生交联后的胚胎提取物制成。
交联时间，温度和甲醛的浓度是三个主要因子器影响交联效率。我们的协议已经被使用的导频实验为每个单独的因素，因此，它已被优化TUD蛋白的交联和在果蝇胚胎在体内的相互作用伙伴，同时保持交联复合物的特异性和风险之间的平衡测试交联非特异性分子。非特异性交联导致的假阳性的复合物的存在，并且必须小心地控制以一个不相关的蛋白质控制的，例如绿色荧光蛋白，这是在我们的实验中使用。此外，最佳交联条件可以与不同的靶分子而不同。因此，在使用我们的协议为起点，最佳的交联时间，温度和甲醛的浓度就必须对于感兴趣的给定的蛋白质复合物来确定。
一旦最佳交联条件都成立，FO是至关重要将胚进行交联，以减少非特异性交联每次llow它们精确。附加的关键步骤是清洗珠IP后用高浓度的NaCl（1 M）和2洗涤剂（IGEPAL CA-630和吐温20），以减少不相关的蛋白质的非特异性结合从胚胎中提取到的珠子。
我们的协议依赖于目标蛋白和用于IP中拉下的蛋白质复合物的抗体之间的亲和性高。因此，在靶蛋白的抗体的抗原决定簇不应该通过交联被破坏，且必须为IP于抗体接近。此外，该抗体 - 靶蛋白相互作用应经受严格洗涤目的的非特异性背景蛋白的减少。这些要求对于成功的IP可能防止一个从采用特定抗体 - 抗原结合，然而，它应该有可能找到一个合适的抗体 - 表位对用于目的蛋白质。特别是，HA-附加表位和相应的抗体已被成功地用于在此协议。
所描述的协议可用于天然蛋白复合物在不同发育阶段的分离和在不同的组织。虽然我们展示了此方法对于果蝇中 ，我们的协议可以适于其他生物体。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢乔丹·戴维斯，岩岩林，埃里克·特德和Jimiao郑为他们的技术帮助，这项研究。这项工作是支持由美国国家科学基金会CAREER授予MCB-1054962，以ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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