Summary
Complexes de protéines multi-composants jouent un rôle crucial lors de la fonction cellulaire et le développement. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler des complexes de protéines natives à partir d'embryons de Drosophila après réticulation in vivo suivie d'une purification des complexes réticulés pour analyse subséquente structure-fonction.
Abstract
De nombreux processus cellulaires sont contrôlées par des complexes protéiques unités multiples. Souvent, ces complexes forment transitoire et nécessitent environnement natif à assembler. Par conséquent, afin d'identifier ces complexes de protéines fonctionnelles, il est important de les stabiliser in vivo avant la lyse des cellules et la purification ultérieure. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler de grands complexes de protéines de bonne foi à partir d'embryons de Drosophila. Cette méthode est basée sur l'embryon perméabilisation et la stabilisation des complexes à l'intérieur des embryons par reticulation in vivo en utilisant une faible concentration en formaldéhyde, qui peut facilement traverser la membrane cellulaire. Par la suite, le complexe de protéine d'intérêt est immunopurifié suivie d'une purification sur gel et analysés par spectrométrie de masse. Nous illustrons cette méthode en utilisant la purification d'un complexe protéique Tudor, qui est essentielle pour le développement de la lignée germinale. Tudor est une grosse protéine, qui contient plusieurs domaines Tudor - petitmodules qui interagissent avec arginines méthylées ou des lysines des protéines cibles. Cette méthode peut être adaptée pour l'isolement des complexes de protéines natives provenant d'organismes différents et des tissus.
Introduction
Isolement des assemblages de protéines unités multiples et complexes d'ADN-ou d'ARN-protéine est effectuée pour identifier des complexes de protéines, des loci génomiques reconnu par des protéines de régulation se liant à l'ADN ou des cibles d'ARN des protéines de liaison d'ARN. Différents procédés permettent l'identification de l'ensemble du génome d'ADN des sites reconnus par des facteurs de transcription ou des protéines de la chromatine (ChIP-seq) 1 et les cibles d'ARN associés à une protéine de liaison à l'ARN donné (CLIP-seq) 2. Les bibliothèques d'ADNc de l'ARN dérivé ou de cibles d'ADN sont ensuite profondément séquences. Ces procédés utilisent des produits chimiques ou de réticulation pour stabiliser les complexes suivie par une immunoprécipitation (IP) avec un anticorps dirigé contre un composant protéique du complexe étudié induite par les UV.
Au cours du développement d'un organisme, de nombreux complexes protéiques forment de manière transitoire. Par conséquent, il est essentiel d'analyser la composition et le fonctionnement de ces complexes in vivo pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent developpement. Une telle analyse in vivo serait supérieure à l'approche in vitro car il est pratiquement impossible de reproduire les concentrations indigènes des éléments en interaction et de l'environnement biochimique cellulaire in vitro. Ici, nous démontrons une approche in vivo que nous utilisons avec succès pour isoler grands complexes de protéines à partir d'embryons de drosophile. Dans ce procédé, les complexes de protéines dans les embryons vivants sont réticulés avec une faible concentration en formaldéhyde et ensuite complexes de protéines d'intérêt sont isolés par IP avec un anticorps dirigé contre un composant connu des complexes, suivie d'une purification sur gel des complexes et de l'analyse par spectrométrie de masse à identifier les composants complexes inconnus. Etant donné que le formaldéhyde est capable de traverser la membrane cellulaire et a une gamme de réticulation de 02.03 à 02.07 Å 3, des complexes de protéines peuvent être réticulés in vivo et les composants complexes sont susceptibles d'être proches les unes des autres. Dans cet article, nousdécrire ce procédé en utilisant l'isolement de Tudor (TUD) complexe de protéines, par exemple. Tud est une protéine de la lignée germinale qui est essentiel pour le développement de la lignée germinale 4-7. Cette protéine contient 11 domaines TUD connus pour interagir avec les arginines ou lysines méthylées d'autres polypeptides 8-10.
Auparavant, nous avons généré une ligne drosophile transgénique qui exprime HA-étiqueté Tud fonctionnelle 5 et donc, un anticorps spécifique anti-HA est utilisé pour tirer vers le bas complexe Tud après réticulation.
En plus des réticulations protéine-protéine, le formaldéhyde peut générer des réticulations d'acide nucléique-protéine et est utilisé dans des expériences de ChIP-seq. En outre, chez la drosophile, in vivo de réticulation avec le formaldéhyde a permis l'identification d'une cible d'ARN de l'ARN Vasa protéine hélicase 11.
Bien que dans cet article, nous décrivons un procédé pour la reticulation in vivo et purification des complexes de protéines à partir d'embryons de Drosophila, ce procédé peut être adapté à d'autres organismes et les tissus.
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Protocol
1. Préparation grandes jus de pomme-agar plaques
- Pour faire 4 assiettes, ajouter 375 ml H 2 O, 11,25 g d'agar mouche et une barre d'agitation dans un ballon de 1000 ml. C'est Mix A. autoclave Mix A avec le couvercle du ballon sans serrer plafonné sur un cycle de 30 min-stérilisation pour les produits liquides.
- Ajouter 125 ml de jus de pomme, 12,5 g de sucre de table et d'un barreau à un bécher de 500 ml. Ce mélange est B. chaleur Mix B sur une plate-forme chauffée sous agitation et maintenir la température à environ 70 ° C jusqu'à ce que le passage à l'autoclave de mélange A est terminée.
- À la fin de Mix Un autoclave, transférer Mix B à A. Mélanger Gardez en remuant doucement le mélange combiné et le laisser refroidir pendant 15 minutes. Évitez de trop le refroidissement et la solidification de la gélose entraîné avant l'ajout d'agents de conservation.
- Faire 10% (poids / volume) méthyle solution 4-hydroxybenzoate dans l'éthanol. Ceci agira comme un agent de conservation. Ajouter 3,75 ml de la solution dans le mélange jus-agar de pomme ci-dessus. Gardez en remuant pour another 5 min.
- Verser 125 mélange de jus de pomme-agar ml avec conservateur dans chaque 300 cm 2 en plastique ou une plaque de polystyrène. Laisser refroidir à température ambiante et se solidifier. Éviter la formation de bulles d'air tout en versant.
Remarque: Les plaques jus-agar pomme sont prêts à utiliser immédiatement. Couvrir les plaques inutilisées avec enveloppements claires et stocker à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
2. Drosophila collecte d'embryons et le traitement pré-réticulation
- Chargez une cage de population à environ 40.000 à 50.000 mouches partir desquels les embryons seront collectées.
- Faire deux plaques contenant chacune 125 ml de farine de maïs mélasse standard intermédiaire 12 et saupoudrer environ 4 g de levure de boulanger séchée sur chaque plaque. Placez ces plaques dans la cage de la population dans un incubateur à 25 ° pendant 48 heures pour engraisser les mouches.
- Chauffez 2 jus de pomme des plaques de gélose à 25 ° C. Saupoudrer environ 1 g de levure de boulanger séchée sur chaqueplaque. Placez les deux plaques dans la cage de la population de commencer à recueillir des embryons de 0-1 h âgé.
- Retirer les plaques à la fin de la collection de 1 hr. Remplacer avec 2 nouvelles plaques si un autre cycle de collecte est nécessaire.
- Ajouter suffisamment d'eau pour couvrir les plaques et remettre en suspension les embryons doucement avec un pinceau fin. Verser les embryons remises en suspension à travers un tamis à deux couches faites de treillis métallique inoxydable en acier.
Remarque: La couche supérieure est faite de la taille des pores moyens (850 pm) maillage qui recueille une grande partie de mouches tout en laissant passer les embryons. La couche inférieure est faite de mailles fines (75 um) qui collecte des embryons tout en laissant passer la levure et de l'eau. - Utilisez le pinceau fin pour transférer les embryons collectés dans un panier de collecte faite avec un tube de 50 ml et fine maille de nylon. Rincer les embryons brièvement à l'eau puis épongez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
- Plonger les embryons dans 50% de javel remuer doucement pendant 3 min. Rincer approfondiement avec de l'eau pour éliminer tout agent de blanchiment. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
- Plonger les embryons dechorionated dans de l'isopropanol sous agitation douce pendant 15 sec ou jusqu'à ce que la répartition des bouquets multi-embryon (cela ne devrait pas prendre plus de 30 secondes). Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
- Plonger les embryons dans l'heptane pendant 5 minutes tout en utilisant une pipette pour écouter heptane sur les embryons pour les garder remis en suspension. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher.
- Rincer les embryons avec des flux de saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS) contenant 0,1% de Triton X-100 (PBST) pendant 3 min.
- Démonter le panier de collecte et de transfert des embryons avec le maillage à un tube de 15 ml contenant 10 ml de PBST. Retourner doucement le tube pour laver les embryons de la maille.
- Retirez le filet du tube. Mettre le tube dans une position verticale et laisser les embryons se déposent au fond du tube par gravité.
Remarque: Environ 100-300ul d'embryons est prévu pour une collection de 1 heure d'une cage. - Retirez le PBST et continuer à effectuer la réticulation immédiatement.
3. In vivo réticulation des embryons collectés
- Préparer 0,2% de formaldehyde dans du PBST, immédiatement avant utilisation. Ajouter 10 ml de fixateur de formaldéhyde pour les embryons et incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 10 min. Jeter fixateur utilisé à la fin de la journée.
- Stopper la réaction de réticulation
- A la fin de la réticulation, que les embryons se déposent au fond du tube.
- Retirer la solution de formaldéhyde. Ajouter immédiatement 10 ml de 0,25 M de glycine dans du PBST pour arrêter la réaction de réticulation. Incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 5 min.
- Laissez les embryons se déposent au fond du tube. Retirer la solution de refroidissement. Laver les embryons avec 10 ml de PBST trois fois.
- Supprimer complètement le Psolution de lavage de BST à l'aide d'une pipette. embryons de conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
4. Protéine préparation de l'échantillon et immunoprécipitation
- Homogénéiser 500 pi embryons réticulés en utilisant un homogénéisateur Dounce dans 2 ml de tampon de lyse (0,5 M d'urée, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, phénylméthanesulfonyle fluorure 2 mM [PMSF] et inhibiteur de la protéase cocktail dans PBS).
Remarque: Effectuez cette et les étapes suivantes à la température ambiante, sauf indication contraire. - Transférer le lysat tubes de 1,5 ml à centrifuger et secouez-la délicatement sur une plate-forme tournante pendant 15 min à assurer une lyse approfondie. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 5 minutes pour sédimenter les débris cellulaires. Enregistrez le surnageant dans un tube de 15 ml propre.
- Ajouter 40 ul de billes d'agarose anti-HA suspension pour le surnageant et laisser incuber sur une plateforme rotative pendant 2,5 heures.
- Sédimenter les billes par centrifugation à 2500 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant mais laisser approximately 250 pi dans le tube. Remettre en suspension les perles dans le surnageant restant et le transférer à une colonne de centrifugation de 1,5 ml avec un filtre à pores de 10 um.
- Centrifuger la colonne de centrifugation à 12 000 g pendant 10 sec et jetez l'écoulement à travers.
- Laver les billes en ajoutant 200 ul de tampon de lavage (0,1 M de glycine, NaCl 1 M, 1% d'IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20 dans du PBS). Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et jeter le lavage. Répétez le lavage deux fois de plus.
- Ajouter 40 ul de tampon d'élution (2 mg / ml HA-peptide dans du PBS) pour les billes et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes avec agitation douce toutes les 5 min. Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et recueillir l'éluat.
- Confirmer l'élution du complexe par analyse Western-blot en utilisant l'anticorps anti-HA 13.
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Representative Results
L'efficacité de la réticulation et la purification réussie du complexe protéique réticulé TUD ont été analysés par SDS-PAGE sur un 3% - 7% de gel de l'étape (illustré sur la figure 1), suivie par transfert de Western (Figure 2).
Le but de l'utilisation de 3% - gel de l'étape 7% est basé sur la séparation effective du complexe protéique réticulé Tud de la protéine restante Tud non réticulé et la concentration du complexe. Sous nos vivo dans des conditions de réticulation mentionnés ci-dessus, une grande proportion de protéines Tud pourrait encore rester non réticulé. Cette protéine libre Tud serait copurify avec le complexe réticulé pendant IP jusqu'à ce que la séparation par SDS-PAGE. Bien que de grande taille, non réticulé protéine Tud (285 kDa) migre à travers le 3% - frontière de 7% sans rétention évident. Considérant que réticulé complexe protéique Tud ayant un poids moléculaire plus grand aurait de la difficulté de migrer à travers la frontière de gel, ce qui ee complexe étant "pris au piège" et concentrées à la frontière ou de "poursuite" près de la frontière et, par conséquent, la séparation de la protéine libre Tud.
L'inclusion d'un contrôle adéquat est essentiel pour valider la spécificité de ce protocole de réticulation. Par conséquent, nous avons utilisé des embryons exprimant HA-protéine GFP étiqueté 14 pour surveiller l'étendue de la réticulation. Nous avons effectué des expériences pilotes de différentes concentrations de formaldéhyde (0,1% - 2%) sur les embryons exprimant la GFP HA-marqués et une partie des résultats (0,1% - 0,5%) sont présentées ici (figure 3). Il est évident que la majorité absolue de la protéine GFP dans les embryons traités (jusqu'à 0,5% de formaldehyde) est resté non réticulé, qui a validé que notre protocole de réticulation n'est pas une protéine cible pour réticuler les molécules environnantes aléatoires. En particulier, le traitement au formaldehyde de 0,2% (figure 3, piste 5 et 6) n'a pas montré de produits réticulés par rapport à uncrcontrôle osslinked (figure 3, ligne 1 et 2), malgré le temps d'exposition prolongée du film, ce qui justifiait davantage notre choix de 0,2% de formaldéhyde dans ce protocole. Cependant, les embryons de contrôle de GFP doivent toujours être réticulés en parallèle avec la réticulation complexe Tud dans les mêmes conditions et les échantillons de protéine contrôle GFP doivent être exécutés sur la 3% - gel de l'étape 7% avec TUD échantillons complexes suivant IP. En outre, à la fois complexe Tud et le contrôle de la GFP correspondant à 3% - des zones de gel 7% doivent être excisés et soumis à une analyse par spectrométrie de masse pour déterminer les candidats de faux positifs qui seront présents à la fois dans Tud bande complexe et le contrôle de la GFP.
L'efficacité de la réticulation in vivo a été déterminée en comparant la protéine libre et TUD complexe Tud de contrôle non réticulé et des embryons des échantillons réticulés respectivement (Figure 2A). Protéine Tud gratuit à partir d'embryons de contrôle non réticulées presque exclusively ont migré à travers le 3% - frontière de 7% avec une quantité minimale conservé près de la zone frontalière (figure 2A, piste 1). Contrairement à cela, les embryons réticulés ont montré la présence d'un grand poids moléculaire complexe réticulé Tud à 3% - gel frontière de 7% (Figure 2A, piste 2). Ceci montre bien que notre procédure de réticulation réticulée avec succès environ 50% des protéines totales Tud avec ses partenaires qui interagissent in vivo (comparer la figure 2A piste 1 et 2).
L'élution compétitive avec HA-peptide a confirmé le succès de purification et de renforcer la spécificité de la protéine purifiée complexe TUD (figure 2B). La fraction d'élution par HA-peptide contenait le complexe concentré autour de 3% - la zone de frontière de 7% et également exempt de protéines TUD (figure 2B, ligne 1). Le tampon d'échantillon SDS suivante élue pour la plupart gratuites Tud restant sur les perles et le montant minimal de complexe Tud (
. Figure 1 Schéma de 3% -. Gel de l'étape 7% utilisée pour SDS-PAGE Les 3% - gel de l'étape 7% est coulée manuellement de manière à ce qu 'il contient trois couches. De haut en bas, ces couches sont le gel d'empilement à 3%, 3% de gel de séparation et de 7% de gel de séparation. Pour travailler avec le système Mini-PROTEAN (Bio-Rad) utilisé dans ce manuscrit, la hauteur du gel de séparation de 3% a été faite à environ 1 cm comme le montre le diagramme.
Remarque: Le gel d'empilement de 3% et les séparant des couches de gel de 3% sont extrêmement fragiles afin redoubler de prudence lors de la manipulation du gel pour éviter une distorsion de ces couches.
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. Figure 2 résultats de Western blot d'embryons réticulés et d'embryons de contrôle lysats et purification de Tudor complexe protéique par IP Groupe A, de la ligne 1, brut lysat de protéines d'embryons de contrôle non réticulées.; piste 2, brut lysat de protéines de formaldéhyde embryons réticulés. Groupe B, ligne 1, élution par HA-peptide après IP réticulé lysat d'embryons; piste 2, élution par 2 x tampon d'échantillon SDS après l'élution initiale HA-peptide. SDS-PAGE a été effectuée à 200 V pendant 3,5 heures. L'anticorps anti-HA (1:1000) a été utilisé en western blot.
Figure 3. Des résultats Western blot d'embryons réticulés et d'embryons de contrôle exprimant la GFP HA-étiqueté. Lane 1, protéine brute lysat of embryons témoins non réticulées; piste 2, même comme voie 1 mais deux fois le montant; piste 3, brut lysat de protéines d'embryons réticulés à l'aide de 0,1% de formaldéhyde; piste 4, même comme la voie 3, mais deux fois le montant; ligne 5, brut lysat de protéines d'embryons réticulés à l'aide de 0,2% de formaldéhyde; ligne 6, même que la piste 5, mais deux fois le montant; ligne 7, brut lysat de protéines d'embryons réticulés à l'aide de 0,3% de formaldéhyde; voie 8, le même que la piste 7, mais deux fois le montant. Lane 9, lysat brut d'embryons réticulés à l'aide de 0,5% de formaldéhyde. SDS-PAGE a été effectuée à 200 V pendant 45 min à 4% - gel à gradient de 15%. L'anticorps anti-HA (1:1000) a été utilisé en western blot.
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Discussion
Le formaldehyde a été couramment utilisé comme réactif de réticulation pour identifier la protéine-protéine et des interactions protéine-acide nucléique. Sa bonne solubilité et la perméabilité membranaire de la cellule, ainsi que la compatibilité avec les procédés de spectrométrie de masse en aval, de faire un formaldéhyde agent candidat idéal pour les applications de reticulation intracellulaires 3,15-17. En particulier, il a été utilisé avec succès pour identifier les ARNm associés à Vasa, un ARN hélicase des cellules germinales chez la drosophile critique 11. En outre, le formaldéhyde a l'une des plus courtes des bras espaceurs (2.3 à 2.7 Å) entre les agents de reticulation disponibles dans le commerce, ce qui implique que seules les molécules qui existent à proximité immédiate serait être réticulés dans des conditions adéquates, le renforcement de la spécificité des partenaires d'interaction de la protéine cible . Pour les raisons exposées ci-dessus, le formaldéhyde a été choisi comme agent de réticulation dans notre protocole. Toutefois, cela ne devrait pas exclure l'usefulness d'autres agents de réticulation en application in vivo pour les embryons de drosophile. Cependant, nous avons essayé d'utiliser dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), un N-hydroxysuccinimide (NHS) ester de réticulation de la famille souvent utilisé en combinaison avec du formaldéhyde dans des essais ChIP 17,18, pour remplacer le formaldéhyde dans notre étude, mais visiblement sans Tud complexe a été obtenu avec cette réticulation D'autre part, DSP pourrait être efficace pour d'autres complexes protéiques qui devront être déterminées sur la base de cas par cas. En plus de la méthode in vivo de réticulation, des agents de reticulation in vitro à partir de bismaléimidohexane (BMH) de la famille ont été montrés pour être efficace dans la capture d'interactions protéine-protéine dans des embryons de Drosophila 14,19, toutefois, dans ces expériences, la réticulation a eu lieu après des extraits d'embryons ont été faites.
Le temps de réticulation, la température et la concentration de formaldéhyde sont les trois facteurs majeursteurs qui influent sur l'efficacité de reticulation. Notre protocole a été testée en utilisant des expériences pilotes pour chaque facteur individuel, par conséquent, il a été optimisé pour la réticulation des protéines TUD et ses partenaires d'interaction dans des embryons de Drosophila in vivo, tout en maintenant l'équilibre entre la spécificité du complexe réticulé et le risque d' la réticulation des molécules non spécifiques. Réticulation non spécifique conduit à la présence de faux positifs dans le complexe et doit être soigneusement contrôlée par un contrôle de la protéine non liée, par exemple GFP, qui a été utilisé dans nos expériences. En outre, les conditions de réticulation optimaux peuvent varier avec différentes molécules cibles. Par conséquent, en utilisant notre protocole en tant que point de départ, le temps de réticulation optimale, la température et la concentration en formaldehyde devra être déterminée pour un complexe de protéine d'intérêt donnée.
Une fois que les conditions de réticulation optimaux sont établis, il est essentiel de foermettez leur précisément chaque fois que les embryons sont réticulés à minimiser réticulation non spécifique. Étape cruciale supplémentaires se lave les billes après IP avec une haute concentration de NaCl (1 M) et deux détergents (IGEPAL CA-630 et Tween-20) pour réduire la liaison non spécifique de protéines non apparentées à partir d'extraits embryonnaires aux billes.
Notre protocole dépend de la forte affinité entre la protéine cible et l'anticorps utilisé pour tirer vers le bas le complexe protéique pendant la présente période. Par conséquent, l'épitope de l'anticorps à la protéine cible ne doit pas être détruite par réticulation et doit être accessible à l'anticorps au cours de la propriété intellectuelle. En outre, l'interaction anticorps-protéine cible doit résister aux lavages strictes visant à la réduction des protéines de fond non spécifique. Ces exigences en matière de propriété intellectuelle peut empêcher avec succès une d'employer une combinaison anticorps-épitope particulier, cependant, il devrait être possible de trouver une paire anticorps-épitope approprié pour une protéine d'intérêt. En particulier, l'épitope HA-tag et l'anticorps correspondant ont été utilisés avec succès dans ce protocole.
Le protocole décrit peut être utilisé pour l'isolement des complexes de protéines natives lors de différents stades de développement et dans des tissus différents. Bien que nous démontrons ce procédé de Drosophila, notre protocole peut être adapté pour d'autres organismes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler et Jimiao Zheng pour leur aide technique à cette étude. Ce travail a été soutenu par la NSF Career Grant MCB-1054962 ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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