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Biology

एक में विवो Crosslinking दृष्टिकोण ड्रोसोफिला भ्रूण

Published: April 23, 2014 doi: 10.3791/51387
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Murray State University

Summary

बहु घटक प्रोटीन परिसरों सेलुलर समारोह और विकास के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ हम में विवो crosslinking बाद संरचना समारोह विश्लेषण के लिए Crosslinked परिसरों की शुद्धि के बाद के बाद भ्रूण ड्रोसोफिला से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की विधि का वर्णन है.

Abstract

कई सेलुलर प्रक्रियाओं multisubunit प्रोटीन परिसरों द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. अक्सर इन परिसरों क्षणिक फार्म और इकट्ठा करने के लिए देशी वातावरण की आवश्यकता होती है. इसलिए, इन कार्यात्मक प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए, यह सेल और बाद शुद्धि से पहले विवो में उन्हें स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम ड्रोसोफिला भ्रूण से बड़े सदाशयी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की विधि का वर्णन है. इस विधि आसानी से कोशिका झिल्ली को पार कर सकते हैं जो formaldehyde के एक कम एकाग्रता, का उपयोग करने में विवो crosslinking द्वारा भ्रूण के अंदर परिसरों की भ्रूण permeabilization और स्थिरीकरण पर आधारित है. बाद में, ब्याज की प्रोटीन जटिल जेल शुद्धि द्वारा पीछा किया और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण immunopurified है. हम germline विकास के लिए आवश्यक है, जो एक ट्यूडर प्रोटीन जटिल है, की शुद्धि का उपयोग इस विधि को वर्णन. छोटे - ट्यूडर कई ट्यूडर डोमेन शामिल हैं जो एक बड़े प्रोटीन, हैलक्ष्य प्रोटीन की methylated arginines या lysines के साथ बातचीत कि मॉड्यूल. इस विधि विभिन्न जीवों और ऊतकों से देशी प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

Introduction

Multisubunit प्रोटीन विधानसभाओं और डीएनए या आरएनए प्रोटीन परिसरों के अलगाव प्रोटीन परिसरों, डीएनए बाध्यकारी नियामक प्रोटीन या शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की शाही सेना लक्ष्य द्वारा मान्यता प्राप्त जीनोमिक loci की पहचान करने के लिए किया जाता है. विभिन्न तरीकों से किसी दिए गए शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (क्लिप seq) 2 के साथ जुड़े प्रतिलेखन कारक या chromatin प्रोटीन (चिप seq) 1 और आरएनए लक्ष्य द्वारा मान्यता प्राप्त डीएनए साइटों के जीनोम चौड़ा पहचान की अनुमति. शाही सेना व्युत्पन्न cDNAs या डीएनए लक्ष्य के पुस्तकालयों फिर गहरा अनुक्रम रहे हैं. इन विधियों रासायनिक या यूवी प्रेरित अध्ययन परिसर के एक प्रोटीन घटक के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation (आईपी) के बाद परिसरों को स्थिर करने के लिए पार से जोड़ने का उपयोग करें.

एक जीव के विकास के दौरान, कई प्रोटीन परिसरों क्षणिक रूप में. इसलिए, यह देव है कि नियंत्रण आणविक तंत्र को समझने के लिए vivo में इन परिसरों की संरचना और समारोह का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण हैelopment. यह बातचीत के घटकों और इन विट्रो में सेलुलर जैव रासायनिक पर्यावरण के देशी सांद्रता पुन: पेश करने के लिए लगभग असंभव है, क्योंकि इस तरह के एक Vivo विश्लेषण में इन विट्रो दृष्टिकोण से बेहतर होगा. यहाँ हम हम सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला भ्रूण से बड़े प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक Vivo दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. इस विधि में, रहने वाले भ्रूण में प्रोटीन परिसरों एक कम formaldehyde की एकाग्रता और बाद में ब्याज की प्रोटीन परिसरों परिसरों और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की जेल शुद्धि के बाद परिसरों की एक ज्ञात घटक के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ आईपी से अलग कर रहे हैं के साथ Crosslinked रहे हैं अज्ञात जटिल घटकों की पहचान. Formaldehyde कोशिका झिल्ली तर करने में सक्षम है और 2.3-2.7 3 के एक crosslinking रेंज है के बाद से, प्रोटीन परिसरों विवो में Crosslinked किया जा सकता है और जटिल घटकों एक दूसरे के करीब होने की संभावना है. इस लेख में हम मेंएक उदाहरण के रूप में ट्यूडर (TUD) प्रोटीन परिसर के अलगाव का उपयोग इस विधि का वर्णन. TUD germline विकास 4-7 के लिए आवश्यक है, जो एक germline प्रोटीन होता है. इस प्रोटीन अन्य polypeptides 8-10 की methylated arginines या lysines के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है 11 TUD डोमेन शामिल हैं.

इससे पहले, हम कार्यात्मक TUD 5 हेक्टेयर टैग व्यक्त करता है और इसलिए, विशिष्ट विरोधी हा एंटीबॉडी crosslinking के बाद TUD जटिल नीचे खींचने के लिए प्रयोग किया जाता है जो एक ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइन उत्पन्न किया है.

प्रोटीन, प्रोटीन crosslinks के अलावा, formaldehyde न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन crosslinks उत्पन्न कर सकते हैं और चिप seq प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा, ड्रोसोफिला में, formaldehyde के साथ crosslinking विवो में वासा शाही सेना helicase प्रोटीन 11 के एक शाही सेना लक्ष्य की पहचान की अनुमति दी है.

इस लेख में हम में विवो crosslinking और पुर के लिए एक विधि का वर्णन करते समयड्रोसोफिला भ्रूण से प्रोटीन परिसरों की ification, इस विधि अन्य जीवों और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

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Protocol

1. बड़े सेब का रस, अगर प्लेटों की तैयारी

  1. 4 प्लेटें बनाने के लिए, एक 1000 मिलीलीटर कुप्पी को 375 मिलीलीटर एच 2 हे, 11.25 छ मक्खी अगर और एक हलचल बार जोड़ें. इस शिथिल तरल माल के लिए एक 30 मिनट नसबंदी चक्र पर छाया हुआ कुप्पी ढक्कन के साथ मिक्स ए आटोक्लेव मिश्रण है.
  2. एक 500 मिलीलीटर बीकर को 125 मिलीलीटर सेब का रस, 12.5 ग्राम टेबल चीनी और एक हलचल बार जोड़ें. मिश्रण के वाष्पदावी समाप्त हो गया है जब तक लगभग 70 डिग्री सेल्सियस सरगर्मी और तापमान को बनाए रखने, जबकि यह एक गर्म मंच पर मिक्स बी हीट मिक्स बी है.
  3. मिक्स के समापन के एक वाष्पदावी पर, ए धीरे संयुक्त मिश्रण सरगर्मी रखें मिश्रण करने के लिए मिक्स बी हस्तांतरण और इसे 15 मिनट के लिए शांत करते हैं. अधिक ठंडा और परिरक्षक के अलावा पहले हुई अगर solidification बचें.
  4. इथेनॉल में 10% (वजन / मात्रा) मिथाइल 4-hydroxybenzoate समाधान करें. यह एक संरक्षक के रूप में कार्य करेगा. ऊपर सेब का रस, अगर मिश्रण करने के लिए समाधान के 3.75 मिलीलीटर जोड़ें. Anothe के लिए सरगर्मी रखें5 मिनट आर.
  5. प्रत्येक 300 सेमी 2 प्लास्टिक या स्टायरोफोम थाली में परिरक्षक के साथ 125 मिलीलीटर सेब का रस, अगर मिश्रण डालो. यह आरटी शांत और जमना. घनघोर जबकि हवा के बुलबुले के गठन से बचें.
    नोट: सेब का रस अगर प्लेट तुरंत उपयोग करने के लिए तैयार हैं. स्पष्ट wraps के साथ अप्रयुक्त प्लेटें कवर और एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

2. ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह और पूर्व crosslinking उपचार

  1. भ्रूण एकत्र किया जाएगा, जिसमें से लगभग 40,000 से 50,000 मक्खियों के साथ एक जनसंख्या पिंजरे लोड करें.
  2. दो प्लेटों के प्रत्येक मध्यम 12 मानक cornmeal-गुड़ की 125 मिलीग्राम से युक्त बनाने के लिए और एक थाली पर सूखे बेकर की खमीर की लगभग 4 जी छिड़के. मक्खियों मोटा 48 घंटे के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जनसंख्या पिंजरे में इन प्लेटों रखें.
  3. 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 2 सेब का रस अगर प्लेट प्रत्येक पर सूखे बेकर की खमीर से लगभग 1 ग्राम छिड़कथाली. 0-1 घंटे पुराने भ्रूण का संग्रह शुरू करने के लिए जनसंख्या पिंजरे में 2 प्लेटें प्लेस.
  4. 1 घंटा संग्रह के अंत में प्लेटें बाहर ले जाओ. संग्रह का एक और दौर की जरूरत है अगर 2 नए प्लेटों के साथ बदलें.
  5. प्लेटों को कवर किया और एक ठीक पेंट ब्रश के साथ धीरे भ्रूण resuspend करने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें. स्टेनलेस स्टील के तार जाल से बाहर कर दिया एक दो परत चलनी के माध्यम से resuspended भ्रूण डालो.
    नोट: ऊपर परत भ्रूण के माध्यम से दे, जबकि बड़ी मक्खी भागों एकत्र करता है जो मध्यम आकार ताकना (850 माइक्रोन) जाल से बना है. नीचे की परत खमीर और पानी के माध्यम से दे, जबकि भ्रूण एकत्र करता है जो ठीक मेष (75 माइक्रोन) से बना है.
  6. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और ठीक नायलॉन जाल के साथ किए गए एक संग्रह टोकरी में एकत्र भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए ठीक पेंट ब्रश का प्रयोग करें. पानी के साथ संक्षिप्त भ्रूण कुल्ला तो सूखे के लिए कागजी तौलिए पर जाल दाग.
  7. 3 मिनट के लिए कोमल घूमता के साथ 50% ब्लीच में भ्रूण को विसर्जित कर दिया. पूरी तरह से कुल्लाly पानी के साथ किसी भी शेष ब्लीच दूर करने के लिए. सूखे के लिए कागजी तौलिए पर जाल दाग.
  8. (यह अब से 30 सेकंड से नहीं लेना चाहिए) 15 सेकंड के लिए कोमल आंदोलन के साथ isopropanol में या बहु - भ्रूण झुरमुटों के टूटने तक dechorionated भ्रूण विसर्जित कर दिया. अच्छी तरह से सूखे के लिए कागजी तौलिए पर जाल दाग.
  9. Resuspended रखने के लिए उन्हें भ्रूण से अधिक हेपटैन स्ट्रीम करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करते हुए 5 मिनट के लिए हेपटैन में भ्रूण को विसर्जित कर दिया. सूखे के लिए कागजी तौलिए पर जाल दाग.
  10. 3 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन X-100 (PBST) युक्त बफर फॉस्फेट खारा, 7.4 पीएच (पीबीएस) की धाराओं के साथ भ्रूण कुल्ला.
  11. संग्रह टोकरी जुदा और 10 मिलीलीटर PBST युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए जाल के साथ भ्रूण हस्तांतरण. मेष बंद भ्रूण धोने के लिए धीरे ट्यूब पलटना.
  12. ट्यूब से जाल निकालें. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में ट्यूब डाल दिया और भ्रूण गंभीरता से ट्यूब के नीचे डूब जाने.
    नोट: लगभग 100-300भ्रूण के μl एक पिंजरे से एक 1 घंटा संग्रह के लिए उम्मीद है.
  13. PBST निकालें और तुरंत crosslinking प्रदर्शन जारी है.

एकत्र भ्रूण की 3. में vivo Crosslinking

  1. तुरंत उपयोग करने से पहले PBST में 0.2% formaldehyde तैयार करें. भ्रूण को formaldehyde लगानेवाला की 10 मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर कोमल आंदोलन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. दिन के अंत तक अप्रयुक्त लगानेवाला त्यागें.
  2. Crosslinking प्रतिक्रिया बुझाना
    1. Crosslinking के अंत में, भ्रूण ट्यूब के नीचे डूब जाने.
    2. Formaldehyde समाधान निकालें. तुरंत crosslinking प्रतिक्रिया बुझाने के लिए PBST में 0.25 एम ग्लाइसिन के 10 एमएल जोड़ें. 5 मिनट के लिए एक रोटरी प्रकार के बरतन पर कोमल आंदोलन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. भ्रूण ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक. बुझाना समाधान निकालें. PBST के 10 एमएल तीन बार के साथ भ्रूण धो लें.
    4. पूरी तरह से पी हटानेएक पिपेट का उपयोग BST धोने समाधान. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर भ्रूण.

4. प्रोटीन नमूना तैयार करना और Immunoprecipitation

  1. 2 मिलीलीटर lysis बफर में एक Dounce homogenizer का उपयोग कर 500 μl Crosslinked भ्रूण homogenize (0.5 एम यूरिया, 0.01% एसडीएस, 2% Triton एक्स 100, पीबीएस में 2 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड [PMSF] और protease अवरोध कॉकटेल).
    नोट: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट आरटी पर यह और निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन.
  2. 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों को lysate स्थानांतरण और धीरे पूरी तरह से सेल सुनिश्चित करने के लिए 15 मिनट के लिए घूर्णन एक मंच पर रॉक. सेलुलर मलबे गोली 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र. एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला सहेजें.
  3. विरोधी हा agarose मोती सतह पर तैरनेवाला को घोल में 40 μl जोड़ें और 2.5 घंटे के लिए घूर्णन एक मंच पर सेते हैं.
  4. 5 मिनट के लिए 2500 XG पर centrifugation द्वारा मोती गोली. सतह पर तैरनेवाला निकालें लेकिन appro छोड़ट्यूब में ximately 250 μl. शेष सतह पर तैरनेवाला में मोती Resuspend और 10 माइक्रोन ताकना फिल्टर के साथ एक 1.5 मिलीलीटर स्पिन स्तंभ के लिए स्थानांतरण.
  5. 10 सेकंड के लिए 12,000 XG पर स्पिन स्तंभ अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  6. 200 μl धो बफर (0.1 एम ग्लाइसिन, 1 एम NaCl, 1% IGEPAL सीए -630, 0.1% बीच 20, पीबीएस में) जोड़कर मोती धो लें. 10 सेकंड के लिए 12,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र और धोने त्यागें. धोने दो बार दोहराएँ.
  7. मोतियों के लिए 40 μl क्षालन बफर (2 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस में हा पेप्टाइड) जोड़ें और कोमल आंदोलन के हर 5 मिनट के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 10 सेकंड के लिए 12,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र और eluate इकट्ठा.
  8. विरोधी हा एंटीबॉडी 13 का उपयोग करते हुए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा परिसर के क्षालन की पुष्टि करें.

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Representative Results

पश्चिमी धब्बा द्वारा पीछा (चित्रा 1 में सचित्र) 7% कदम जेल (चित्रा 2) - crosslinking की प्रभावशीलता और Crosslinked TUD प्रोटीन परिसर के सफल शुद्धि एक 3% पर एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया.

3% का उपयोग करने का उद्देश्य - 7% कदम जेल परिसर के शेष uncrosslinked TUD प्रोटीन और एकाग्रता से Crosslinked TUD प्रोटीन जटिल की प्रभावी जुदाई पर आधारित है. हमारे उपरोक्त में विवो crosslinking शर्तों के तहत, TUD प्रोटीन का एक बड़ा हिस्सा अभी भी uncrosslinked रह सकता है. यह मुफ्त TUD प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से जुदाई तक आईपी दौरान Crosslinked जटिल साथ copurify होगा. स्पष्ट अवधारण के बिना 7% सीमा - आकार में बड़े, TUD प्रोटीन uncrosslinked हालांकि (285 केडीए) 3% के पार प्रवास करती है. बड़ा आणविक वजन के साथ Crosslinked TUD प्रोटीन जटिल कठिनाई वें, जिसके परिणामस्वरूप जेल सीमा पार पलायन होगा जबकिई जटिल मुफ्त TUD प्रोटीन से अलग, इसलिए "फंस" और सीमा के पास सीमा या "पीछा" पर ध्यान केंद्रित किया जा रहा है और.

एक उचित नियंत्रण का समावेश इस crosslinking प्रोटोकॉल की विशिष्टता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, हम crosslinking की हद तक नजर रखने के लिए हा टैग GFP प्रोटीन 14 व्यक्त भ्रूण का इस्तेमाल किया. परिणाम (0.1% - 0.5%) की हा टैग GFP और भाग व्यक्त भ्रूण पर - (2% 0.1%) हम अलग formaldehyde सांद्रता के पायलट प्रयोगों का प्रदर्शन किया है (चित्रा 3) के यहां दिखाया गया है. यह हमारे crosslinking प्रोटोकॉल यादृच्छिक आसपास के अणुओं को Crosslink लक्ष्य प्रोटीन नहीं करता कि मान्य है, जो इलाज भ्रूण में GFP प्रोटीन (अप करने के लिए 0.5% formaldehyde) की पूर्ण बहुमत uncrosslinked बनी कि स्पष्ट है. Uncr की तुलना में जब विशेष रूप से, 0.2% formaldehyde उपचार (चित्रा 3, लेन 5 और 6) किसी भी Crosslinked उत्पादों नहीं दिखा थाआगे इस प्रोटोकॉल में 0.2% formaldehyde की हमारी पसंद जायज फिल्म है, जो की विस्तारित समय जोखिम के बावजूद osslinked नियंत्रण (चित्रा 3, लेन 1 और 2). एक साथ TUD जटिल नमूने आईपी निम्नलिखित के साथ 7% कदम जेल - हालांकि, GFP नियंत्रण भ्रूण हमेशा एक ही स्थिति और नियंत्रण GFP प्रोटीन के नमूने के तहत TUD जटिल crosslinking के साथ समानांतर में Crosslinked किया जाना चाहिए 3% पर चलाया जाना चाहिए. इसके अलावा, TUD जटिल और इसी GFP नियंत्रण 3% दोनों - 7% जेल क्षेत्रों excised किया जाना चाहिए और TUD जटिल बैंड और GFP नियंत्रण दोनों में उपस्थित रहेंगे कि झूठी सकारात्मक उम्मीदवारों को निर्धारित करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रस्तुत की.

vivo में crosslinking की प्रभावशीलता uncrosslinked नियंत्रण और क्रमशः Crosslinked भ्रूण नमूने (2A चित्रा) से मुक्त TUD प्रोटीन और TUD जटिल की तुलना द्वारा निर्धारित किया गया था. लगभग exclusivel uncrosslinked नियंत्रण भ्रूण से मुक्त TUD प्रोटीनसीमा क्षेत्र (2A चित्रा, लेन 1) के पास बरकरार रखा न्यूनतम राशि के साथ 7% सीमा - Y 3% के पार चले गए. 7% जेल बॉर्डर (चित्रा 2A, 2 लेन) - उस के विपरीत, Crosslinked भ्रूण 3% पर बड़ी आणविक भार TUD Crosslinked जटिल की उपस्थिति देखी गई. यह स्पष्ट रूप से हमारे crosslinking प्रक्रिया सफलतापूर्वक अपने vivo में बातचीत भागीदारों (2A चित्रा लेन 1 तुलना और 2) के साथ कुल TUD प्रोटीन का लगभग 50% Crosslinked दिखाया.

हा पेप्टाइड के साथ प्रतिस्पर्धी क्षालन सफल शुद्धि की पुष्टि की और शुद्ध TUD प्रोटीन जटिल (चित्रा 2 बी) की विशिष्टता को मजबूत बनाया. 7% सीमा क्षेत्र और भी मुक्त TUD प्रोटीन (चित्रा 2B, लेन 1) - हा पेप्टाइड द्वारा क्षालन अंश 3% के आसपास केंद्रित जटिल होता है. निम्नलिखित एसडीएस नमूना बफर eluted TUD (मोती और TUD परिसर की न्यूनतम राशि पर शेष ज्यादातर मुक्त टुनिशिया> चित्रा 2 बी, 2 लेन).

चित्रा 1
. 3% का आंकड़ा 1 चित्र -. एसडीएस पृष्ठ के लिए इस्तेमाल किया 7% कदम जेल 3% - 7% कदम जेल मैन्युअल रूप से यह तीन परतों में शामिल है कि इस तरह से डाली है. ऊपर से नीचे तक, उन परतों 3% स्टैकिंग जेल, 3% को अलग जेल और 7% को अलग जेल में हैं. इस पांडुलिपि में इस्तेमाल मिनी बहुरूपिया प्रणाली (जैव रेड) के साथ काम करने के लिए, 3% को अलग जेल की ऊंचाई चित्र में दर्शाया के रूप में लगभग 1 सेमी होना करने के लिए बनाया गया था.
नोट: 3% स्टैकिंग जेल और 3% को अलग जेल परतों जेल से निपटने इसलिए जब इन परतों के विरूपण को रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानी का उपयोग बेहद नाजुक हैं.

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.. चित्रा 2 Crosslinked भ्रूण और नियंत्रण भ्रूण lysates और आईपी पैनल, लेन 1 से ट्यूडर प्रोटीन जटिल की शुद्धि के पश्चिमी धब्बा परिणाम, uncrosslinked नियंत्रण भ्रूण की क्रूड प्रोटीन lysate; 2 लेन, formaldehyde Crosslinked भ्रूण से क्रूड प्रोटीन lysate. पैनल बी, लेन 1, Crosslinked भ्रूण lysate से आईपी के बाद हा पेप्टाइड द्वारा क्षालन; 2 लेन, प्रारंभिक हा पेप्टाइड क्षालन के बाद 2 एक्स एसडीएस नमूना बफर द्वारा क्षालन. एसडीएस पृष्ठ 3.5 घंटे के लिए 200 वी पर चलाया गया था. विरोधी हा एंटीबॉडी (1:1,000) पश्चिमी धब्बा में इस्तेमाल किया गया था.

चित्रा 3
चित्रा 3. हा टैग GFP व्यक्त Crosslinked भ्रूण और नियंत्रण भ्रूण के पश्चिमी धब्बा परिणाम है. लेन 1, क्रूड प्रोटीन lysate ओच uncrosslinked नियंत्रण भ्रूण; लेन 1 लेकिन दो बार राशि के रूप में एक ही लेन 2,; 3 लेन, 0.1% formaldehyde का उपयोग Crosslinked भ्रूण की क्रूड प्रोटीन lysate; 3 लेन, लेकिन दो बार राशि के रूप में ही 4 लेन,; लेन 5, 0.2% formaldehyde का उपयोग Crosslinked भ्रूण की क्रूड प्रोटीन lysate; 5 लेन लेकिन दो बार राशि के रूप में एक ही 6 लेन,; लेन 7, 0.3% formaldehyde का उपयोग Crosslinked भ्रूण की क्रूड प्रोटीन lysate; लेन 7, लेकिन दो बार राशि के रूप में एक ही 8 लेन,. लेन 9, 0.5% formaldehyde का उपयोग Crosslinked भ्रूण के कच्चे lysate. 15% ढाल जेल - एसडीएस पृष्ठ 4% में 45 मिनट के लिए 200 वी पर चलाया गया था. विरोधी हा एंटीबॉडी (1:1,000) पश्चिमी धब्बा में इस्तेमाल किया गया था.

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Discussion

Formaldehyde सामान्यतः प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत की पहचान करने के लिए एक crosslinking अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया है. एक साथ नीचे की ओर मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रक्रियाओं के साथ संगतता के साथ अपने अच्छे घुलनशीलता और कोशिका झिल्ली पारगम्यता, intracellular crosslinking अनुप्रयोगों 3,15-17 के लिए formaldehyde एक आदर्श उम्मीदवार एजेंट बनाते हैं. विशेष रूप से, यह सफलतापूर्वक वासा, ड्रोसोफिला 11 में एक महत्वपूर्ण रोगाणु सेल शाही सेना helicase के साथ जुड़े mRNAs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पास में मौजूद है कि केवल अणुओं लक्ष्य प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों की विशिष्टता को मजबूत बनाने, उचित परिस्थितियों में Crosslinked की जाएगी जो अर्थ है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध crosslinkers बीच - (2.7 एक 2.3), इसके अलावा, formaldehyde कम से कम स्पेसर हथियारों में से एक है . ऊपर कहा गया है कारणों के लिए, formaldehyde हमारे प्रोटोकॉल में crosslinking एजेंट के रूप में चुना गया था. हालांकि, इस यू बाहर नहीं करना चाहिएड्रोसोफिला भ्रूण के लिए vivo में आवेदन में अन्य crosslinking एजेंट की sefulness. हालांकि, हम कोई स्पष्ट TUD dithiobis (succinimidyl propionate) (डीएसपी), अक्सर हमारे अध्ययन में formaldehyde बदलने के लिए, चिप assays 17,18 में formaldehyde के साथ संयोजन में उपयोग एक एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) एस्टर परिवार crosslinker का उपयोग करने की कोशिश की, लेकिन है जटिल दूसरी ओर इस crosslinker साथ प्राप्त हुई थी, डीएसपी मामले दर मामले के आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता होगी, जो अन्य प्रोटीन परिसरों के लिए प्रभावी हो सकता है. भ्रूण निष्कर्षों किए गए थे बाद में विवो crosslinking दृष्टिकोण के अलावा, bismaleimidohexane (BMH) परिवार से इन विट्रो crosslinkers ड्रोसोफिला भ्रूण 14,19 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर कब्जा करने में प्रभावी होना दिखाया गया है, हालांकि, इन प्रयोगों में crosslinking हुई.

crosslinking समय, तापमान और formaldehyde एकाग्रता तीन प्रमुख कारकों हैंcrosslinking दक्षता को प्रभावित करने वाले ऑपरेटरों. हमारे प्रोटोकॉल प्रत्येक व्यक्ति के कारक के लिए पायलट प्रयोगों, Crosslinked परिसर की विशिष्टता और के जोखिम के बीच संतुलन बनाए रखते हुए इसलिए, यह TUD प्रोटीन की crosslinking और इन विवो में ड्रोसोफिला भ्रूण में अपनी बातचीत के भागीदारों के लिए अनुकूलित किया गया है का उपयोग कर परीक्षण किया गया है अविशिष्ट अणुओं crosslinking. अविशिष्ट crosslinking परिसर में झूठी सकारात्मक की उपस्थिति की ओर जाता है और ध्यान से हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था जो उदाहरण GFP, के लिए, एक असंबंधित प्रोटीन नियंत्रण के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, इष्टतम crosslinking स्थितियां अलग लक्ष्य अणुओं के साथ भिन्न हो सकते हैं. इसलिए, एक प्रारंभिक बिंदु, इष्टतम crosslinking समय, तापमान और formaldehyde एकाग्रता के रूप में हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग ब्याज की दी प्रोटीन परिसर के लिए निर्धारित करना होगा.

इष्टतम crosslinking की स्थिति स्थापित हो जाने के बाद इसके लिए के लिए महत्वपूर्ण हैठीक भ्रूण अविशिष्ट crosslinking कम करने के लिए Crosslinked रहे हैं हर बार उन्हें llow. अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम भ्रूण अर्क से मोती के लिए असंबंधित प्रोटीन की अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए उच्च NaCl की एकाग्रता (1 मीटर) और दो डिटर्जेंट (IGEPAL CA-630 और बीच 20) के साथ आईपी बाद मोती धोने है.

हमारे प्रोटोकॉल लक्ष्य प्रोटीन और आईपी के दौरान प्रोटीन जटिल नीचे खींचने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के बीच उच्च संबंध पर निर्भर करता है. इसलिए, लक्ष्य प्रोटीन में एंटीबॉडी का मिलान crosslinking से नष्ट नहीं किया जाना चाहिए और आईपी के दौरान एंटीबॉडी के लिए सुलभ होना चाहिए. इसके अलावा, एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन बातचीत अविशिष्ट पृष्ठभूमि प्रोटीन की कमी के उद्देश्य से कड़े washes सामना करना चाहिए. सफल आईपी के लिए इन जरूरतों को एक विशेष एंटीबॉडी का मिलान संयोजन को रोजगार से एक को रोकने सकता है, हालांकि, यह ब्याज की एक प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त एंटीबॉडी का मिलान जोड़ी खोजने के लिए संभव हो जाना चाहिए. विशेष रूप से, हा टैग मिलान और इसी एंटीबॉडी सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है.

वर्णित प्रोटोकॉल विभिन्न विकास के चरणों के दौरान देशी प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए और विभिन्न ऊतकों में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम ड्रोसोफिला के लिए इस विधि का प्रदर्शन हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल अन्य जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के साथ उनके तकनीकी सहायता के लिए जॉर्डन डेविस, Yanyan लिन, एरिक Schadler और Jimiao झेंग धन्यवाद. इस काम ALA MCB-1054962 अनुदान NSF कैरियर द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila agar Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) FLY-8020-1 Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile
Methyl 4-hydroxybenzoate Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) H5501 Other name: TEGOSEPT
Population cage Flystuff (http://www.flystuff.com/) 59-104
Fine nylon mesh Flystuff (http://www.flystuff.com/) 57-102 When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal
Dounce homogenizer Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) D8938-1SET Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation
Protease inhibitor cocktail  Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) 4693132001 PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution
Anti-HA agarose beads MBL international (http://www.mblintl.com/) 561-8 The kit also includes HA-peptide and spin columns
HA-peptide MBL international (http://www.mblintl.com/) 561-8 Prepare to 2 mg/ml with PBS 
Spin Column MBL international (http://www.mblintl.com/) 561-8 Spin columns are included as part of the kit
Isopropanol Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) BP26324
Triton X-100 Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) BP151-500
Heptane Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) H350-4
PBS Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) AM9625 Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use
Formaldehyde Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) BP531-500
Glycine BioRad (www.bio-rad.com/‎) 161-0724
SDS BioRad (www.bio-rad.com/‎) 161-0301
Urea BioRad (www.bio-rad.com/‎) 161-0730
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) P7626-1G Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer
IGEPAL CA-630 Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) I8896-50ML
Tween 20 Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) BP337-100
15-ml tubes USA Scientific (http://www.usascientific.com/) 1475-0511
Bleach Clorox brand Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach
50-ml tubes BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) 352098
Top layer sieve Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) 04-884-1AK
Bottom layer sieve Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎) 04-884-1BA

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References

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Gao, M., McCluskey, P., Loganathan, S. N., Arkov, A. L. An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (86), e51387, doi:10.3791/51387 (2014).

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