Summary
Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.
Abstract
Pek çok hücresel süreçleri multisubunit protein kompleksleri tarafından kontrol edilir. Sıkça bu kompleksler geçici oluşturmak ve birleştirmek için doğal bir ortam gerektirir. Bu nedenle, bu işlevsel protein kompleksleri tespit etmek için, hücre lizizi ve daha sonra saflaştırma daha önce in vivo olarak bunları stabilize etmek için önemlidir. Burada Drosophila embriyolardan büyük niyetli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, hücre zarını kolayca geçebilir formaldehit düşük bir konsantrasyonu kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile embriyoların içine komplekslerin embriyo nüfuziyet ve stabilizasyon dayanmaktadır. Daha sonra, ilgilenilen protein kompleksi jel geçirilmiş, ardından arıtma ve kütle spektrometresi ile analiz edilir İmmüno. Bu tohum çizgisi gelişimi için gerekli olan bir Tudor protein kompleksi, saflaştırılmasını kullanarak bu yöntemi örneklemektedir. - Küçük Tudor birden Tudor etki alanı içeren büyük bir proteindirHedef proteinlerin metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim modülleri. Bu yöntem, farklı organizmalardan ve dokulardan yerli protein komplekslerinin izolasyonu için uyarlanabilir.
Introduction
Multisubunit protein montajlar ve DNA-ya da RNA-protein komplekslerinin izolasyonu protein kompleksleri, DNA-bağlanma düzenleyici proteinler veya RNA bağlama proteinlerinin RNA hedefleri tarafından kabul genomik lokusları tespit için gerçekleştirilir. Farklı yöntemler, belirli bir RNA-bağlama proteini (CLIP-seq) 2 ile ilişkili transkripsiyon faktörleri veya kromatin proteinleri (ChIP-seq) 1 ve RNA hedefleri tarafından tanınan DNA siteleri genom tanımlanmasını sağlar. RNA türetilmiş cDNA ya da DNA hedeflerinin diziler daha sonra derin dizilir. Bu yöntemler, kimyasal veya UV kaynaklı çalışılan kompleksinin bir protein bileşenine karşı bir antikor ile immüno-çökeltme (IP) takip kompleksleri stabilize etmek için çapraz bağlama kullanın.
Bir organizmanın gelişimi sırasında, çok sayıda geçici protein kompleksleri oluşturur. Bu nedenle, kontrol dev moleküler mekanizmaların anlaşılması, in vivo olarak, bu komplekslerin bileşimi ve işlevini analiz için çok önemlidirelopment. Bu etkileşim bileşenleri ve in vitro olarak hücre biyokimyasal ortamı yerel konsantrasyonları üretmek için neredeyse imkansız olduğu için bu tür bir in vivo analiz in vitro yaklaşımına göre daha üstün olacaktır. Burada biz başarılı Drosophila embriyolar büyük protein kompleksleri izole etmek için kullanabileceğiniz bir in vivo yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemde, canlı embriyolar protein kompleksleri düşük formaldehit konsantrasyonu ve daha sonra ilgi protein kompleksleri için kompleksleri ve kütle spektrometre analizi jel geçirilmiş, ardından arıtma komplekslerinin bilinen bir bileşenine karşı bir antikor ile IP ile izole edilir ile çapraz bağlanmış olan bilinmeyen karmaşık bileşenleri tanımlar. Formaldehit hücre zarı nüfuz edebilir ve 2.3-2.7 Â 3 bir dizi çapraz bağlama sahip olduğu için, protein kompleksleri, in vivo olarak çapraz bağlanabilir ve karmaşık parçaları birbirine yakın olması muhtemeldir. Bu makalede bizBir örnek olarak Tudor (Tud) protein kompleksinin izole edilmesini kullanarak bu yöntem açıklanmaktadır. Tud tohum çizgisi 4-7 gelişimi için gerekli olan bir tohum çizgisi proteindir. Bu protein için diğer polipeptidlerin 8-10 metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim için bilinen 11 Tud alanları içerir.
Daha önce, fonksiyonel Tud 5 HA-etiketli ifade eder ve bu nedenle, spesifik bir anti-HA antikoru çapraz bağlamadan sonra Tud kompleksi aşağı çekmek için kullanılan bir transgenik Drosophila satır elde ettik.
Protein-protein çapraz bağlar ek olarak, nükleik asit, formaldehit-protein çapraz bağlar oluşturabilir ve yonga-seq deneylerde kullanılır. Ayrıca, Drosophila, formaldehid ile çapraz bağlama, in vivo Vasa RNA helikaz protein 11 bir RNA hedefinin belirlenmesini sağladı.
Bu yazıda in vivo çapraz bağlama ve pur için bir yöntem tarif ederkenDrosophila embriyolardan protein kompleksleri ification, bu yöntem diğer organizmalar ve dokular için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Büyük Elma Suyu-agar Plakaları hazırlanması
- 4 plakaları yapmak için, 1000 ml'lik bir şişeye 375 ml 2 H, O, 11.25 g uçucu agar ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Bu gevşek sıvı mallar için tek bir 30 dakika sterilizasyon döngüsünde şapkalı şişe kapağı Mix A. otoklav Mix A.
- 500 ml'lik bir behere 125 ml elma suyu, 12.5 g sofra şekeri ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Karışım A ve otoklavlama işlemi bitene kadar yaklaşık 70 ° C'de karıştırıldıktan ve sıcaklığı muhafaza ederken bu ısıtılmış bir platformda Mix B. ısı Mix B.
- Mix tamamlanmasından sonra bir otoklav, A. yavaşça kombine karışımı karıştırma devam Mix Mix B transferi ve bunun 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Aşırı soğutma ve bir koruyucu eklenmeden önce neden agar katılaşma kaçının.
- , Etanol içinde% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat, bir çözüm olun. Bu, koruyucu olarak hareket edecektir. Yukarıda elma suyu-agar karışımına solüsyonun 3.75 ml ilave edilir. Anothe karıştırıldıktan Ol5 dakika r.
- Her 300 cm 2 plastik veya köpük tabak içine koruyucu ile 125 ml elma suyu agar karışımı dökün. Bu sırada oda sıcaklığma soğumaya ve katılaşmaya olsun. Dökme sırasında, hava kabarcıkları oluşturan kaçının.
Not: elma suyu agar plakaları hemen kullanıma hazırdır. Net sarar ile kullanılmayan tabak örtün ve bir hafta kadar 4 ° C'de saklayın.
2.. Drosophila Embriyo Toplama ve Ön çapraz bağlama tedavisi
- Embriyolar elde edilecek olan yaklaşık 40.000 ila 50.000 sinekler ile nüfus kafes yerleştirin.
- Her iki levha 12 orta standart mısır unu-melas 125 ml içeren yapın ve her plaka üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 4 gr serpin. Sinekleri şişmanlatıyor 48 saat boyunca 25 ° C inkübatör nüfus kafesin içine bu tabak yerleştirin.
- 25 ° C sıcaklığa kadar ıstınız 2 elma suyu-agar plakaları Her biri üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 1 gr serpinplakası. 0-1 hr-eski embriyoların toplamaya başlamak için nüfus kafes içinde 2 tabak yerleştirin.
- 1 saat koleksiyonu sonunda plakalarını çıkartın. Koleksiyonun bir tur gerekirse 2 yeni plakalar ile değiştirin.
- Plakaları kapak ve ince bir fırça ile hafifçe embriyolar tekrar süspansiyon yeterince su ekleyin. Paslanmaz çelik tel örgü yapılmış iki tabakalı bir elekten tekrar süspansiyon haline embriyolar dökün.
Not: Üst tabaka embriyo ile icar ederken büyük bir böcek parçalarını toplayan orta gözenek boyutu (850 mikron) örgü yapılır. Alt tabaka maya ve su geçişine için verirken, embriyolar toplar ince örgü (75 mikron) yapılmıştır. - 50 ml'lik bir tüp ve ince naylon örgü ile yapılan bir toplama sepeti içine toplanan embriyolar transfer ince boya fırça kullanın. Su ile kısaca embriyoların durulayın sonra kuruması için kağıt havlu üzerine örgü kurulayın.
- 3 dakika boyunca hafif bir döndürme ile% 50 çamaşır suyu embriyolar bırakın. Tam durulayınly su ile kalan çamaşır suyu çıkarmak için. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
- (Bu, daha uzun bir süre 30 saniye sürmemelidir) 15 saniye boyunca hafifçe çalkalanarak izopropanol veya çok embriyo kümeleri arıza kadar dechorionated embriyolar bırakın. Iyice kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
- Yeniden asılmış onları tutmak için embriyolar üzerinde heptan akışı için bir pipet kullanırken 5 dakika boyunca heptanda embriyolar daldırın. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın.
- 3 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (PBST) içeren fosfat tamponlu salin, pH 7.4 (PBS) akışı ile embriyolar durulayın.
- Toplama sepeti sökün ve 10 ml PBST ihtiva eden bir 15 ml tüp örgü ile birlikte embriyolar aktarılır. Örgü kapalı embriyoların yıkamak için tüp hafifçe çevirin.
- Tüpten kafes çıkarın. Dikey konumda tüp koyun ve embriyolar yerçekimiyle tüpün dibine çöker sağlar.
Not: Yaklaşık 100-300embriyoların ul bir kafesten bir 1 saat toplama beklenmektedir. - PBST çıkarın ve hemen çapraz bağlama gerçekleştirmeye devam.
Toplanan Embriyolar 3.. In vivo Çapraz
- Kullanımdan hemen önce, PBST içinde% 0.2 'lik formaldehit hazırlayın. Embriyoların için formaldehit sabitleyici 10 ml eklenir ve 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C'de inkübe edin. Günün sonunda kullanılmayan fiksatif atın.
- Çapraz bağlama reaksiyonu söndürün
- Çapraz bağlama sonunda, embriyolar tüpün dibine çöker sağlar.
- Formaldehit çözeltisi çıkarın. Hemen çapraz bağlama, reaksiyonun sönmesi için PBST içinde 0.25 M glisin 10 ml ekleyin. 5 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C'de inkübe edin.
- Embriyoların tüpün dibine çöker olsun. Söndürme çözeltisi çıkarın. PBST'de 10 ml üç kez ile embriyolar yıkayın.
- Tamamen P çıkarınBir pipet kullanarak TSİ yıkama solüsyonu. -80 ° C'de kullanıma kadar saklayın embriyolar.
4.. Protein Numune Hazırlama ve immüno-çökeltme
- 2 ml lisiz tampon maddesi içinde bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 500 ul çapraz bağlanmış homojen embriyolar (0.5 M üre,% 0.01 SDS,% 2 Triton X-100, PBS içinde 2 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF] ve proteaz inhibitörü kokteyli).
Not: Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında bu ve aşağıdaki adımları uygulayın. - 1.5 ml santrifüj tüplerine lizat aktarın ve yavaşça ayrıntılı lizizi sağlamak için 15 dakika için bir döner platform üzerinde sallayın. Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 16,000 x g'de lizat santrifüj. Temiz bir 15 ml tüp içinde süpernatant kaydedin.
- Anti-HA agaroz boncuklar süpernatana çamur 40 ul ilave edin ve 2.5 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde inkübe edilir.
- 5 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı ama beğenme bırakıntüp içinde ximately 250 ul. Geri kalan süpernatan içinde yeniden süspanse edin ve boncuklar 10 mikron gözenek filtresi ile bir 1.5 ml döndürme kolonuna transfer.
- 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj spin kolon ve akış atmak.
- 200 ul yıkama tamponu (0.1 M glisin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630,% 0.1 Tween-20, PBS) eklenerek ve boncukları yıkayın. 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj ve sütun yıkama atın. Yıkandıkları iki kez daha tekrarlayın.
- Boncuklara 40 ul yıkama tamponu (2 mg / ml PBS içinde HA-peptid) eklenir ve yavaşça çalkalanarak her 5 dakika ile 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 10 saniye boyunca 12,000 x g'de santrifüj ve sütun elüat toplamak.
- Anti-HA antikoru kullanılarak western 13-blot analizi ile kompleks bir elüsyon kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Western blot ve ardından (Şekil 1 'de gösterilen)% 7 aşama jel (Şekil 2) -, çapraz bağlanma etkinliği ve çapraz bağlanmış Tud protein kompleksinin başarılı bir saflaştırma% 3 üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi.
% 3 kullanmanın amacı, -% 7 adım jel kompleksinin geri kalan çapraz bağlanmamış Tud protein ve konsantrasyondan Tud çapraz bağlanmış protein kompleksinin etkili ayrılmasına dayanmaktadır. Yukarıda sözü edilen in vivo eden çapraz bağlama koşulları altında, Tud proteinin büyük bir kısmı hala çapraz bağlanmamış kalır olabilir. Bu serbest Tud protein SDS-PAGE ile ayırma kadar IP sırasında çapraz bağlanmış kompleksi ile copurify olacaktır. Açık tutma olmadan% 7 sınırına - boyutu büyük, Tud protein çapraz bağlanmamış olsa (285 kDa) 3% karşısında geçirir. Daha büyük bir moleküler ağırlığa sahip çapraz bağlanmış Tud protein kompleksi zorluk th sonuçlanan jel sınırdan geçiş gerekir isee kompleksi serbest Tud proteinden ayrılması, bu nedenle "tuzak" ve sınırına yakın sınır veya "atık" konsantre ve ediliyor.
Uygun bir kontrol dahil, bu çapraz bağlama protokolü özgünlüğünü doğrulamak için çok önemlidir. Bu nedenle, çapraz bağlanma derecesini izlemek için HA-etiketli GFP proteini sentezleyen 14 embriyoları kullanılır. Sonuç (% 0.1 -% 0.5) ve HA-GFP etiketli ve kısmını ifade embriyo - (% 2% 0,1) Farklı formaldehit konsantrasyonları pilot deneyleri gerçekleştirdik (Şekil 3) burada gösterilmektedir. Bizim çapraz bağlama protokolü rasgele çevreleyen molekülüne çapraz bağlanma hedef proteini etmediğini doğrulanmış olan, muameleye tabi tutulan embriyolarda GFP protein (en fazla% 0.5 formaldehit) salt çoğunluğu çapraz bağlanmamış kaldığı açıktır. Uncr ile karşılaştırıldığında, özellikle% 0.2 'lik formaldehit muamele (Şekil 3, satır 5 ve 6) bir çapraz bağlanmış ürün göstermemiştirbundan başka, bu protokolde% 0.2 formaldehit bizim seçim haklı film, uzatılmış maruz kalma süresi rağmen osslinked kontrol (Şekil 3, hat 1 ve 2). Birlikte Tud kompleks numuneler IP aşağıdaki ile% 7 adım jel - Ancak, GFP kontrol embriyolar hep aynı koşullar ve kontrol GFP protein örneklerinin altında Tud karmaşık çapraz bağlama ile paralel olarak çapraz bağlanmış olmalıdır% 3 çalıştırılması gerekir. Buna ek olarak, karmaşık Tud ve karşılık gelen GFP kontrol her ikisi de% 3 -% 7 jel alanları eksize edilir ve Tud karmaşık bandı ve GFP kontrol hem de mevcut olacaktır yanlış pozitif adaylar belirlenmesi için kütle spektrometresi analizi için gönderilmiştir.
In vivo çapraz bağlanma etkinliği, çapraz bağlanmamış ve kontrol sırasıyla çapraz bağlanmış embriyolar örnekleri (Şekil 2A) için serbest Tud protein ve Tud kompleksi karşılaştırılarak belirlendi. Neredeyse exclusivel çapraz bağlanmamış kontrol embriyoların ücretsiz Tud proteinSınır bölgesinde (Şekil 2A, şerit 1) yakın tutulan az miktarda% 7 sınırına - y% 3 arasında göç. % 7 jel sınır (Şekil 2A, kuşak 2) -, bu aksine, çapraz bağlanmış embriyolar% 3 en büyük moleküler ağırlıklı çapraz bağlı Tud kompleksinin varlığını göstermiştir. Bu açıkça bir çapraz bağlama işlemi başarılı bir şekilde in vivo etkileşim ortakları (Şekil 2A şerit karşılaştırma 1 ve 2) ile total Tud proteininin yaklaşık olarak% 50 çapraz bağlı olduğunu göstermiştir.
HA-peptid ile rekabet elüsyon saflandırılmasında doğruladı ve saflaştırılmış Tud protein kompleksinin (Şekil 2B) özgünlüğünü güçlendirdi. % 7 sınır alanı ve aynı zamanda serbest Tud protein (Şekil 2B, şerit 1) - HA-peptid ile elüsyon fraksiyonu yaklaşık% 3 konsantre edildi kompleksi içeriyordu. Aşağıdakiler SDS örnek tamponu elüt Tud (boncuk ve Tud kompleksin az miktarda kalan çok serbest
.% 3, Şekil 1 Şema -. SDS-PAGE için kullanılan% 7 adım jel% 3 -% 7 basamaklı bir jel el ile üç katman içeren bir şekilde dökülmektedir. Alt tepesinden, bu tabakalar% 3 istifleme jeli,% 3 ayırma jel ve% 7 ayırma jeli bulunmaktadır. Bu yazıda kullanılan Mini-PROTEAN sistemi (Bio-Rad) ile çalışmak için,% 3 ayıran jel yüksekliği şemada gösterildiği gibi, yaklaşık 1 cm olarak yapılmıştır.
Not: 3% istifleme jeli ve% 3 ayıran jel katmanlar jeli tutarken yüzden bu tabakaların bozulmasını önlemek için ekstra dikkatli kullanmak son derece kırılgandır.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
.. Şekil 2, çapraz bağlanmış embriyolar ve embriyo kontrol lizatları ve IP Panel A, şerit 1 ile Tudor protein kompleksinin saflaştırılması Western blot sonuçları, çapraz bağlanmamış kontrol embriyolarının ham protein lisatı; şerit 2, formaldehit çapraz bağlanmış embriyolardan ham protein lizat. Panel B, şerit 1, çapraz bağlanmış embriyo lizatından IP sonra HA-peptid ile elüsyon; şerit 2, ilk HA peptit elüsyondan sonra 2 x SDS numune tamponu ile elüsyon. SDS-PAGE 3.5 saat boyunca 200 V'ta çalıştırılmıştır. Anti-HA antikoru (1:1000), Western lekeleme kullanılmıştır.
Şekil 3,. HA-etiketli GFP ifade eden çapraz bağlanmış kontrol embriyoları ve embriyo Western blot sonuçları. Şerit 1, ham protein lizat of çapraz bağlanmamış kontrol embriyolar; şerit 1, ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 2; şerit 3,% 0.1 'lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; şerit 3, ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 4,; şerit 5,% 0.2 'lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; yol 5, ancak iki katı ile aynı şerit 6; şerit 7,% 0.3 formaldehid ile çapraz bağlanmış embriyo ham protein lisatı; şerit 7 ancak iki katı miktarı olarak aynı şerit 8,. Şerit 9,% 0.5 'lik formaldehit ile çapraz bağlanmış embriyoların ham lizat. % 15 gradient jel - SDS-PAGE içinde% 4, 45 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırılmıştır. Anti-HA antikoru (1:1000), Western lekeleme kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formaldehit genellikle protein-protein, protein-nükleik asit etkileşimleri belirlemek için bir çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Birlikte aşağı kütle spektrometresi prosedürleri ile uyumluluğu ile iyi çözünürlük ve hücre zarı geçirgenliği, hücre içi çapraz uygulamalar 3,15-17 için formaldehit ideal bir aday ajan olun. Özel olarak, başarılı bir şekilde Vasa, Drosophila 11 önemli bir germ hücre RNA helikaz ile ilişkili mRNA tespit etmek için kullanıldı. Yakın varlarsa molekülleri hedef proteinin etkileşim ortaklarının özgünlüğünü güçlendirilmesi, uygun şartlar altında çapraz bağlı olacağını ima ticari olarak temin edilebilen çapraz bağlayıcı arasında - (2,7, 2,3), ek olarak, formaldehit kısa aralayıcı kollar birine sahiptir . Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, formaldehit protokolde çapraz bağlama maddesi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, bu u dahil edilmemelidirDrosophila embriyolar için in vivo uygulama için diğer çapraz bağlama maddelerinin sefulness. Ancak, belirgin bir Tud ditiyobis (süksinimidil propionat) (DSP), sık sık çalışmamızda formaldehit yerine yongalı deneylerde 17,18 formaldehid ile kombinasyon halinde kullanılan bir N-hidroksisüksinimid (NHS) ester etti çapraz bağlayıcı kullanmak çalıştı, fakat var Karmaşık Diğer yandan, bu çapraz bağlayıcı ile elde edilmiştir, DSP harf ile ayrı ayrı tespit edilmesi gereken diğer protein kompleksleri için etkili olabilir. Embriyo ekstreler yapıldıktan sonra in vivo çapraz bağlama yaklaşımının yanısıra, bismaleimidoheksan (BMH) ailesinin ikinci çapraz bağlayıcı Drosophila in vitro embriyo 14,19 protein-protein etkileşimleri yakalama etkili olduğu gösterilmiştir, ancak, bu deneylerde çapraz bağlama meydana geldi.
Çapraz bağlama zaman, sıcaklık ve formaldehit konsantrasyon üç büyük li olançapraz bağlama verimliliğini etkileyen ları. Bizim protokol her bir faktör pilot deneyleri, çapraz bağlanmış kompleksinin özgüllük ve riski arasında dengesini korurken, bu nedenle, bu Tud protein çapraz bağlanma ve in vivo Drosophila embriyolar kendi etkileşim ortakları için optimize edilmiştir kullanılarak test edilmiştir spesifik olmayan çapraz bağlama molekülleri. Spesifik olmayan bağlanma, çapraz bağlama komplekse yanlış pozitif varlığına yol açar ve dikkatli bir şekilde deneylerinde kullanılmıştır, örneğin GFP için, ilgisiz bir protein kumanda ile kontrol edilmelidir. Buna ek olarak, uygun çapraz bağlama koşullarının farklı hedef molekülleri ile değişebilir. Bu nedenle, bir başlangıç noktası, uygun çapraz bağlama süresi, sıcaklık ve formaldehit konsantrasyonu olarak protokol kullanılarak ilgi konusu bir protein kompleksi için tespit edilmesi gerekecektir.
Uygun çapraz bağlama koşulları altında gerçekleştirilmektedir kez fo için kritiktam embriyolar spesifik olmayan çapraz bağlanmayı en aza indirmek için çapraz bağlanmış her bir zaman onları llow. Diğer önemli bir adım, embriyonik ekstrelerinden boncuklara olmayan proteinlerin spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için yüksek bir NaCl konsantrasyonu (1 M) ve iki deterjanlar (IGEPAL CA-630 ve Tween-20) ile IP sonra boncuklarını edilir.
Bizim protokol hedef proteinin ve IP sırasında protein kompleksi aşağı çekmek için kullanılan antikor arasında yüksek bir afinite bağlıdır. Bu nedenle, hedef proteinde antikorun epitop çapraz bağlama ile imha edilmesi gerekir ve IP sırasında antikor için erişilebilir olmalıdır. Buna ek olarak, antikor, hedef protein etkileşimi Spesifik olmayan alt yapı proteinlerinin azaltılmasına yönelik sıkı yıkama dayanıklı olmalıdır. Başarılı bir IP Bu şartlar belirli bir antikor-epitop kombinasyon halinde kullanan bir tane engelleyebilecek, ancak ilgi konusu bir proteini, uygun bir antikor-epitop çift bulmak mümkün olmalıdır. Özellikle, HA-epitop etiket ve karşılık gelen antikor başarıyla bu protokol kullanılmıştır.
Açıklanan protokol, farklı gelişim safhalarında yerli protein komplekslerinin izolasyonu için ve farklı doku kullanılabilir. Drosophila için bu yöntemi gösteren, ancak, protokol diğer canlılar için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu çalışma ile teknik yardım için Ürdün Davis, Yanyan Lin, Eric SCHADLER ve Jimiao Zheng teşekkür ederim. Bu çalışma ALA MCB-1054962 hibe NSF KARİYER tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
