Den extracellulära matrisen undergår väsentlig ombyggnad under sårläkning, inflammation och tumörgenes. Vi presenterar en ny intravital immunofluorescensmikroskopi metod för att visualisera dynamiken i fibrillar samt maskliknande matriskomponenter med hög rumslig och tidsmässig upplösning med hjälp epifluorescence eller två foton mikroskopi.
Förutom att vara en fysisk byggnadsställning för att hålla vävnader morfologi, är den extracellulära matrix (ECM) aktivt involverade i regleringen av cell-och vävnadsfunktion under utveckling och organ homeostas. Det gör man genom att agera via biokemiska, biomekaniska och biofysikaliska signalvägar, exempelvis genom frisättning av bioaktiva ECM proteinfragment, som reglerar vävnad spänning, och ger vägar för cellmigration. Den extracellulära matrisen hos tumormicroenvironmenten undergår väsentlig ombyggnad, som kännetecknas av nedbrytning, avsättning och organisationen av fibrillära och icke-fibrillära matrisproteiner. Stromal förstyvning av tumormicroenvironmenten kan främja tumörtillväxt och invasion, och orsaka ombyggnad av blod-och lymfkärl. Live avbildning av matrixproteiner, är emellertid att denna punkt begränsas till fibrillära kollagener som kan upptäckas av andra harmoniska generationen med hjälp av multi-foton mikroskopi, vilket majoriteten av matriskomponenter largely osynlig. Här beskriver vi rutiner för tumörympning i tunna rygg örat hud, immunmärkning av extracellulära matrixproteiner och intravital avbildning av den exponerade vävnaden i levande möss med hjälp epifluorescence och två foton mikroskopi. Vår intravital avbildningsmetod möjliggör direkt detektion av både fibrillär och icke-fibrillära matrixproteiner inom ramen för en växande dermal tumör. Vi visar exempel på fartygets ombyggnad orsakade av lokal matris kontraktion. Vi fann också att fibrillär matris av tumören upptäcks med den andra harmoniska generationen är rumsligt skild från nyligen deponerade matriskomponenter såsom tenascin C. Vi visade även på lång sikt (12 timmar) avbildning av interaktion T-celler med tumörceller och tumörceller migration längs kollagen IV i basalmembran. Sammantaget visar denna metod medger unikt för samtidig detektion av tumörceller, deras fysiska mikromiljön och den endogena vävnaden immunsvar över tid, vilket kan PROVide viktiga insikter i de mekanismer som ligger bakom tumörprogression och slutliga framgång eller resistens mot behandlingen.
Intravital avbildning av inflammatoriska, metastaserande och matris remodeling processer har varit ett viktigt område för forskning och har motiverat att skapa ett stort antal transgena musmodeller reporter som uttrycker fluorescerande proteiner 1,2. På grund av out-of-fokus fluorescerande signaler, vilket minskar bildkvaliteten och begränsar ljuspenetrering genom vävnaden, är det möjligt att avbilda tjock vävnad endast med konfokala eller flera foton scanning mikroskopi 3. Använda snabbare, är möjlig mindre dyr och komplex epifluorescensmikroskopi endast med nästan två-dimensionella vävnader såsom kyckling chorio-allantois membran 4 eller mus öronhuden 5. De flesta bildsystem utnyttjar transgena möss som uttrycker olika fluorescerande proteiner i en celltyp-specifikt sätt. Även om dessa proteiner har svaga fototoxicitet, de inducera immunsvar 6. Dessutom är det svårt att växla mellan specifika cell subtyper eller markerair basala eller aktiverade stater som sådan förändring kräver utarbetandet av en ny genetisk modell. Dessutom, som fluorescerande protein uttryck är i allmänhet begränsad till intracellulärt, är det oftast inte möjligt att bildcellulära strukturer som basalmembranproteiner eller vävnad kemokina insättningar 7. Istället indirekt märkning med antikroppar mot extracellulära antigener erbjuder flexibilitet för praktiskt taget alla celltyp eller matris specifik komponent 8,9. Emellertid är den största nackdelen med denna märkning tillvägagångssätt associeras med immuntoxicitet medierad av antigen-antikroppsimmunkomplex som kan utlösa komplementsystemet beroende celltoxicitet och fagocytos av celler och extracellulära strukturer 10.
Den extracellulära matrix av tumören mikromiljö, men även av normal vävnad vid inflammation eller sårläkning, genomgår omfattande ombyggnad. Stromal förstyvning av tumormicroenvironmenten kan promote tumörtillväxt och invasion på grund av stress-inducerad signaleringsmekanismer och orsaka ombyggnad av blod-och lymfkärl 11. Dock är levande avbildning av matrixproteiner begränsat till fibrillära kollagener som kan upptäckas av andra harmoniska generationen med hjälp av multi-foton mikroskopi. Nyligen har vi publicerat en roman intravital avbildningsmetod som minimerar risken för foto-och immun-toxisk skada på avbildade celler och vävnadsstrukturer 5. I jämförelse med etablerade avbildningstekniker där den enda omgången av kontinuerliga intravital visualisering är i ett intervall av 30 minuter till 2 timmar 12 till 17, vår intravital immunofluorescens (IF)-teknik tillåts 12 timmar (långtids 8) avbildning. Det är viktigt att notera att avbildningstiden är begränsad till 12 timmar på grund av begränsningarna i vår djur-protokollet men det finns inga tekniska kontraindikationer att den inte kan förlängas om kritiska hälsoparametrar hos djur, som blodtryck och hjärtahastigheten styrs 8. Dessutom, genom att använda en automatiserad fluorescens stereomikroskop kunde vi samla in bilder från flera fält under ett enda experiment och observerade sällsynta immunologiska och ombyggnad processer som inträffade i fysiologiska sammanhang i huden som stöds av funktionell blod-och lymfkärl. Eftersom stereomicroscopic lins har en relativt stor, 2 cm, arbetsavstånd och i motsats till två-foton-mikroskopiska optik kräver inte förånga vattennedsänkning var långsiktig avbildning utförs endast under fluorescensstereomikroskop. Intravital IF tillät immun märkning och upptäckt av extracellulärmatrix komponent i normal hud. Utformningen av denna teknik är baserad på innovativa koncept för att använda immunfärgning för levande celler och vävnader matriselementen på kirurgiskt exponerade mus dermis utan att orsaka skadliga immuntoxiska effekter 5. Det kirurgiska ingreppet i sig är säkert att dermiskärlsystemet eftersom det bygger bara på separation av två hudlagren i örat som oberoende är innerveras, autonomt matas av blod och dräneras av separata lymfatiska upplagor. Vår experimentuppställning möjliggör avbildning av en rad viktiga patofysiologiska händelser under minst 12 timmar, inklusive leukocyt handel mellan blod-och lymfkärl och sårläkningsprocesser. I den ursprungliga publiceringen, vi jämfört vår teknik för att state-of-the-art standarder inom olika områden av intravital avbildning. Följaktligen konstaterade vi blodkärl extravasering och lymfatiska intravasation händelser genom olika typer av leukocyter, inklusive den unika visualisering av immunceller som leds in i stället för förväntade initiala lymfkärl 15. Dessutom kompletterar de iakttagelser som gjorts av andra grupper 9,18, fann vi att in vivo CCL21 kan bilda starka, diskontinuerliga avlagringar på att samla in, men bara sällan på initiala lymfkärlen.
<p class = "jove_content"> Här beskriver vi en modifierad intravital IF teknik som kan kombineras med två-foton-mikroskopi för att detektera nätverk av fibrillära kollagener med användning av andra harmoniska generationen (SHG). Vi visar att metoden också kan användas för avbildning cancercellinvasion i samband med den dynamiska tumormicroenvironmenten, vilket inkluderar matrismolekyler såsom tenascin C, som till stor del outforskad av nuvarande avbildningstekniker 19. Vi fann att det fibrillära matrisen av tumören, detekteras med den andra harmoniska generationen, intar olika platser i tumörens mikromiljö än den nyligen deponerade matris bestående av tenascin C. Dessutom beskriver vi exempel på fartygets ombyggnad orsakade av lokal matris kontraktion, lång- sikt (12 timmar) avbildning av T-cellsinteraktioner med tumörceller och tumörcellmigration längs kollagen IV i basalmembranet. Sådana händelser kan avbildas samtidigt som du spelar in lokala fysiologiska parametrar som blodkärls permeability och lymfdränage.Signifikans
Här presenterar vi en ny intravital mikroskopi strategi som möjliggör hög upplösning och dynamisk visualisering av olika vävnadsmikrokomponenter, inklusive fibrillär samt maskliknande matrixproteiner. Denna metod har flera fördelar jämfört med nuvarande intravital avbildningstekniker: (i) Intravital fluorescens avbildning har använts i mikrocirkulation studier, t.ex. för att spåra solute läckage från blod eller in i lymfkärlen, men har inte kombinerats med immunfärgning. (Ii) användning av genetiskt modifierade reporter möss tillåter specifika celltyper som ska avbildas, men kräver tillgången (eller en väsentlig insats för att skapa nya) och begränsar antalet samverkande celltyper som kan studeras. (Iii) Extracellulär matris kan avbildas in vivo med användning av andra harmoniska generationen, men denna teknik kan bara detektera fibrösa kollagener och lämnar ett stort antal viktiga extracellulära komponentersåsom basalmembran, fibronektiner, tenascins, tillväxtfaktorer, kemokiner och vävnads glykosaminoglykaner utom räckhåll för aktuell forskning. Vår metod övervinner dessa begränsningar och tillåter standardavbildningstekniker som skall införlivas och dessutom kombineras med immunostainings för andra celltyper, vävnadsstrukturer, fyndigheter av heparinsulfat bindande tillväxtfaktorer (t.ex. VEGF 26) och kemokiner (CCL21 5,18 och figur. 2D ), eller extracellulära matrixproteiner och samtidigt spåra blod och / eller lymfatiska flöden.
Begränsningar
Den epifluorescens avbildning av intravital IF är begränsad till de tunna huden klaffar, berövade tjocka huden (fettvävnad). Samtidigt som vi fann att de dorsala öron dermis är optimal för relativt ofarliga kirurgiska utläggning av örat huden, epifluorescens med intravital IF tekniken inte är begränsad till öron dermis och skulle kunna tillämpas på t.ex.den exponerade huden på tår eller baksidan huden hos nyfödd mus. Snabb färgning antikropp (15 minuter) i immunofluorescens IF är inte beroende av passiv diffusion men kräver funktionellt lymfdränage och interstitiell fluidflöde, därav kan observeras ingen färgning om lymfkärl är ockluderad 27. I linje med detta, lymfkärl fläckar starkare sedan läckande blodkärlen (skadade fartyg, arterioler) 5. Separationen av den dorsala och ventrala örat hud klaffar är en mild kirurgiskt ingrepp, men det orsakar skada på vissa kapillärer och celldöd i olika vävnadsceller. Detta kan vara ett problem när en behöver utreda helt intakt vävnad, till exempel tittar på den milda effekten av läkemedel på cellöverlevnad. Även tillämpningen av antioxidant som tjänar till att skydda huden mot fototoxicitet och fotoblekning utesluter användning av intravital immunofluorescens teknik för att studera t.ex. vävnads oxidativ stress eller kväveoxid biology.
Slutligen kan blinding av vävnad residenta makrofager med immunkomplex aktiverar dessa celler och inflytande t.ex. studier av vävnad immunsvar och dendritisk cell-aktivering.
Ändringar och felsökning
För att studera vävnads oxidativ stress eller kväveoxid biologi, måste ersättas med andra vävnads kompatibla media som inte stör den experimentella utgång askorbat. På samma sätt bör blockera Fc-receptorer på dermala immunceller undvikas om målet med studien är att funktion och aktivering av vävnaden immunförsvaret och dendritiska cellaktivering och migration. Detta kan göras med användning av den sekundära antikroppen med Fc-fragmentet klyvs (F (ab) 2-antikroppsfragment) eller användning av biotinylerad antikropp och fluorescerande streptavidin som detektionsreagens.
Framtida applikationer
Vi presenterar en ny och unik inomavgörande om teknik för bild icke-fibrillar komponenter i extracellulär matrix i transplanterbara hudtumörer i kombination med SHG-detekterade fibrillär och mognat gener med hjälp av två-photon mikroskopi. En av fördelarna med att använda multifoton (eller konfokal) mikroskopi över epifluorescens avbildning är z-stapling möjlighet och följaktligen rumslig co-lokalisering av händelser som inträffar i extracellulära matrix, t.ex. tumör intravasation i lymfatiska eller blodkärlet, som i fallet med standard epifluorescensmikroskopi kan endast härledas från morfologiska förändringar av de invaderande cellen. Denna teknik har mycket bredare potential. Till exempel har vi använt intravital IF att undersöka mekanismen för lymfatiska ocklusion av lymfatiska specifika fotodynamisk terapi 27. Andra potentiella tillämpningar av denna metod innefattar, men är inte begränsade till undersökning av hud immunitet under inflammation, mekanism av transplantatavstötning eller metoder för blod och lymfa ATIC kärltillväxt under tumörbildning.
Kritiska steg i proceduren
Det viktigaste steget som har kritiska implikationer för att upprätthålla en fysiologisk vävnadsmiljö är en kirurgisk separation av den ventrala hud och brosk från rygg dermis. Kapning eller ockludera den stora artären eller venen kommer att leda till kraftig blödning och lokal vävnadshypoxi, vilket kommer att påverka cellulär respons till behandlingar och cellrörelse 8. Immobilisera örat med kirurgiskt lim bör ske med försiktighet eftersom många texter limmet på utsätta vävnaden kommer att orsaka permanent skada på vävnaden genom ocklusion av blodkärl. Temperaturen hos mus måste kontrolleras och hålls vid 37 ° C. Dessutom behöver fuktad syre som skall användas för den isoflurananestesi, så att ögon och lungor stanna ordentligt fuktas under experimentet. Dessutom måste natriumaskorbat beredas och dess pH kontrolleras före användning.
ntent "> Sammanfattningsvis överbryggar detta intravital immunofluorescens realtid, lokala mätningar av fysiologiska funktioner med molekylär avbildning av komplexa cellulära händelser i musen huden. Dessutom har denna metod en stor potential eftersom det lätt kan appliceras på t.ex. studiepostutvecklings mekanismer för blod och lymfa-angiogenes eller för att visualisera de tidiga faserna av hudinfektion av olika patogena agens. Med sin flexibilitet och hög genomströmning potential, kan detta intravital teknik avsevärt bidra till flera inom biologi.The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för Jeremy CM Teo och S. Ryan Oliver för deras bidrag och Jolanta Kilarska för hjälp med bildbehandling. Vi tackar BlOP kärnanläggningen vid EPFL för stödet med två-photon mikroskopi
Detta arbete stöddes delvis av anslag från Europeiska forskningsrådet kommissionen (DC-lymfa, från 206.653 till 2), det europeiska ramverket Project 7 (AngioScaff), Swiss National Science Foundation (31-135.756), och National Institutes of Health (NIH) / NIH Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). Dessutom medel från Robert Wenner Award (Swiss Cancer League) tillät köpet Leica stereomikroskop som används i denna studie. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |