תגובות שתן בשלפוחית ​​השתן ההתנפחות העוררת Visceromotor כמודל לשלפוחית ​​שתן כאב בעכברים

Summary

כ 3-8,000,000 אנשים בארצות הברית סובלים מתסמונת כאב ביניים דלקת שלפוחית ​​השתן / שלפוחית ​​השתן (IC / BPS), מצב של חולשה מתאפיינת בחלקו על ידי כאבים באגן. על מנת ללמוד תרומות מערכת עצבים למצב, מודל פיסיולוגי של כאב שלפוחית ​​שתן נמצא בשימוש בעכברים וחולדות.

Abstract

כ 3-8,000,000 אנשים בארצות הברית סובלים מתסמונת דלקת שלפוחית ​​השתן / כאבים בשלפוחית ​​השתן interstitial (IC / BPS), מצב של חולשה מתאפיינת בדחיפות מוגברת ותדירות מתן שתן, כמו גם נוקטוריה וכאבי אגן בכלל, ובפרט על מילוי או בשלפוחית ​​השתן הרקה. למרות שנים של מחקר, את סיבת IC / BPS נותרת חמקמקה ואסטרטגיות טיפול אינן מסוגלות לספק הקלה מוחלטת לחולים. על מנת ללמוד תרומות מערכת עצבים למצב, מודלים של בעלי חיים רבים פותחו על מנת לחקות את הכאב וסימפטומים הקשורים IC / BPS. מודל עכברי אחד כזה הוא התנפחות שלפוחית ​​שתן (UBD). במודל זה, אוויר דחוס בלחץ מסוים מועבר לשלפוחית ​​השתן של חיה מורדמת בקלילות על פני תקופת זמן מוגדרת. לאורך כל ההליך, חוטים בשרירי הבטן אלכסוניים מעולים להקליט פעילות חשמלית של השריר. פעילות זו מכונית תגובת visceromotor (VMR) ואניsa מדד אמין לשחזור של nociception. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים כדי לבצע את הטכניקה הזו בעכברים כוללים מניפולציות כירורגית, הקלטה פיזיולוגית, וניתוח נתונים. עם השימוש במודל זה, ניתן נפרם התיאום בין הנוירונים העיקריים חושיים, afferents המשנית בעמוד השדרה, ובאזורים במערכת העצבים המרכזיות גבוהים יותר כרוכים בכאב בשלפוחית ​​השתן. ידע מדעי בסיסי אז זה יכול להיות מתורגם קליני לטיפול בחולים הסובלים מIC / BPS.

Introduction

כאב כרוני מוגדר באופן רשמי ככאב שנמשך כשלושה חודשים, או למשך זמן ארוך יותר מאשר זמן ריפוי רקמה הנורמלי ^1. סוג זה של כאב הוא אחת הסיבות העיקריות שאנשים מונעים על לפנות לטיפול רפואי ² ויכול לעלות עד $ 635,000,000,000 דולרים בשנה ^3. אסטרטגיות כאב כרוני התמודדות נוכחית נחשבות ארכאיות; לאחר עשרות שנים של התקדמות רפואית, NSAIDs (תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות) ואופיואידים עדיין הטיפולים הראשוניים נקבעו על ידי רופאים. עם זאת טיפולים אלה למקד את כל הסוגים השונים של כאב באותו אופן, ומספקים השפעות משכך כאבים בכל הגוף, בניגוד למתמקד במיוחד על סיבת שאירוע כאב מדויק. על מנת לסייע טוב יותר לאלה הסובלים מכאב כרוני, תשומת לב מחקר צריכה להיות מוזז כלפי אטיולוגיה וטיפולי כאב ספציפי אפשריים הקשורים גורמים השכיחים ביותר לכאב כרוני. המטרה של manuscri זהpt הוא לתאר מודל המשמש כדי להבין מצב המכונה דלקת שלפוחית ​​השתן ביניים / כואב שלפוחית ​​השתן תסמונת (IC / BPS) טוב יותר.

IC / BPS הוא מצב מתישה המשפיע על מיליוני אנשים, בעיקר נשים מעל גיל 40 ^4. הסיבות של IC / BPS המדויקות אינן ידועות, אולם השכיחות נקשרה לגנטיקה ^5, דיאטות מסוימות, ורמות לחץ גבוה ⁶ . תסמינים של IC / BPS כוללים אך לא מוגבלים ל: דחיפות מוגברת במתן שתן, בתדירות מוגברת של הטלת שתן, כואבת, נוקב, או צריבת כאב במהלך מילוי שלפוחית ​​ורקה, ונוקטוריה ^7. יש חולים חווים תנאים אלה רמות לחץ גבוהות יותר, והם חרדים יותר ^8. זה הגביר תוצאות מתח בכאב מוגבר, אשר מרחיב את רמות הלחץ המקוריות. מחקרים הראו כי רמות דיכאון והחרדה להקטין טיפולים הבאים שלהקל על כאב במתן שתן, ובכך למעשה לשבור את מעגל משוב החיובי הזה

על מנת ללמוד תרומות מערכת עצבים למצב, מודלים של בעלי חיים רבים פותחו על מנת לחקות את הכאב וסימפטומים הקשורים IC / BPS. באופן מסורתי, דלקת שלפוחית ​​השתן שוחזר בבעלי חיים עם ההקדמה של כימיקלים שונים, כגון שמן חרדל, אצטון, lipopolysaccharide, חומצת מלח, וציקלופוספמיד לתוך שלפוחית ​​השתן. עם זאת לא סוכנים זרים נמצאים בשתן סטרילי של חולי IC / BPS, ובכך לערער על תקפותם של מודלים אלה. עוד מודל עכברי של כאב אורולוגית הוא נפיחות בשתן בשלפוחית ​​השתן (UBD) ^10. במודל זה, אוויר דחוס בלחץ מסוים מועבר לשלפוחית ​​השתן של בעל חיים ער או בהרדמה קלה על פני תקופת זמן מוגדרת. לאורך כל ההליך, חוטים בActiv מעולה שרירי בטן האלכסוני השיא החשמליity מהשריר (עם electromyogram (EMG)). פעילות זו מכונית תגובת visceromotor (VMR), והוא מדד אמין, לשחזור של nociception ^10. התנפחות דומה חלולה איבר (למשל שלפוחית ​​השתן, פי הטבעת) במתנדבים אנושיים בריאים מייצרת תחושות של אי נוחות ועליות משמעותיות בכאב דיווח ^11,12, תכונות המשמשות לעתים קרובות כדי לאבחן IC / BPS. וכך, בשילוב עם שיטות חשמליות, תרופתיים, וoptogenetic של גירוי או עיכוב, UBD הוא מודל שימושי ותקף להבנת שני מרכיבי מערכת עצבים ההיקפיים ומרכזיים של nociception שלפוחית ​​השתן וכאב.

כאן, אנו מתארים את ההליך לUBD כמשמש כיום במעבדה שלנו בחברים נשיים של זן העכבר הנפוץ, C57BL/6J. בשל קשיים בתהליך הצנתור של זכרים, הליך זה מבוצע בעיקר בעכברים ממין נקבה. פרוטוקול זה הותאם שמפותח על ידי נס <em> et al. ¹⁰ ושפורסם בעבר מהמעבדה שלנו ^13. הפרוטוקול הבא מתאר ארבעה מרכיבים עיקריים של מודל זה בחיות הרדים: (1) קטטר בשלפוחית ​​השתן וניתוח האלקטרודה הקלטה (2) אינדוקציה הרדמה חלקית (3) התנפחות שלפוחית ​​השתן והקלטת VMR, ו (4) ניתוח נתונים של עקבות VMR / EMG גלם . הבדלים דקים בהליך UBD-VMR בשל בחירה של האורגניזם, עומק הרדמה ואינדוקציה, וטמפרטורת גוף הם דנו בהמשך.

Protocol

הפרוטוקול הבא כבר אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת Duquesne ועולה בקנה אחד עם הנחיות מהמכון הלאומי לבריאות.

1. השתלה כירורגית של חוט אלקטרודות ושתן בשלפוחית ​​השתן צנתר באמצעות טכניקות ועיקור (זמן כולל דקות 5-10)

1. צריכים להיות מוכנים הפריטים הבאים לפני הניתוח מתחיל:
   1. פעיל לנטר ולהתאים את טמפרטורת גוף ל37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת ניטור טמפרטורה עם כרית חימום הפועל על סוללות ובדיקת טמפרטורת גוף של בעלי חיים (חומרי רשימה) חבר מערכת אוטומטית למנורת חום בהספק נמוך לבקרה נוספת של טמפרטורת גוף.
   2. הציוד הדרוש להרדמת isoflurane כולל אוויר דחוס מערכת פליטה (100% O לדוגמא _2), מאדה isoflurane, isoflurane, חדר האינדוקציה isoflurane (למציאה ראשונית), חרטום, ו.
   3. להרכיב הדואר מכשירים ראויים כירורגית, קטטר IV, ואלקטרודות (חומרי רשימה)
2. לגרום למדינת הרדמה בחדר אינדוקציה בisoflurane 2-3%. הסר את העכבר מחדר כאשר רפלקס ליישר הולך לאיבוד (0-1 דק ').
3. מקם את עכבר בחרטום עם isoflurane 2-2.5%. קמצוץ הבוהן כדי לבדוק עבור הרדמה מלאה. לא צריך להיות שום תגובה מבעלי החיים. התחל טיימר.
4. הנח 1 טיפה של משחת עיניים בכל עין של עכבר.
5. הפעל עכבר מעל כל כך בצד הגבי פונה כלפי מטה.
6. הכנס קטטר דרך שופכה ולתוך שלפוחית ​​השתן.
7. טובלים קטטר בסיכה כירורגית כדי לשמן קטטר.
   1. צמד בעדינות את פתח שופכה עם מלקחיים מחודדים בניצב לגופו של בעל החיים. מחזיק קטטר עם סט 2 ^nd של מלקחיים, בעדינות להכניס סוף קטטר לתוך שופכה בזווית המאונכת לגופו של בעל החיים.
   2. כאשר צנתר הושקע שופכה ~ 1-2 מ"מ, בעדינות להתאים קטטר כך שהוא עכשיו במקביל לגוףמכוון לכיוון הראש. תנועה זו היא הכרחית כדי למנוע את עצם הערווה.
   3. דחף בעדינות קטטר לכיוון גופו של העכבר. קטטר צריך להחליק אל תוך חלל הגוף בצורה חלקה וללא התנגדות. אל תכריח את הקטטר. אם הצנתר לא נכנס בצורה חלקה, לחזור למצב קטטר בניצב ולהתחיל שוב.
   4. עם קטטר מוכנס באופן מלא בשלפוחית ​​השתן, בעדינות לדחוף למטה על הבטן של העכבר כדי לגרש את תכולת שלפוחית ​​השתן. הסר את כל השתן מצנתר על ידי דחיפת חתיכה קטנה של נייר מגבת לפתיחת קטטר. כאשר מגבת נייר ספוגה בשתן, להחליף. הסר את השתן ברציפות לאורך הפרוטוקול שנותר ביניהם במהלך ניסויי התנפחות שלפוחית ​​השתן (ראה פרוטוקול 3 להלן).
8. הכנס את שני חוטי כסף לשרירי בטן על ימין ועל חוט כסף אחד לחזה (כקרקע.)
   1. ישתמש באלכוהול או יוד לחיטוי לרוחב שטח מהימין לקטטר (בצד השמאל של החיה של גוף.)
   2. לחשוף את השרירים בטן שמאלי.
      1. החזק את העור ליד שרירים בטן נשארים עם מלקחיים. לעשות חתך 1-2 סנטימטר קטן עם מספריים כירורגיות בינוניים.
      2. הכנס קצה של מספריים לתוך חתך וחתך בעדינות להרחיב עד 2 סנטימטר.
      3. שימוש במלקחיים להעביר fascia שמעליה לחשוף את השרירים בטן אלכסוניים מעולים. היזהר שלא לחתוך / לקרוע כל של כלי דם הגדולים הנמצאים באזור זה.
   3. כופפו את שלושה חוטי כסף במחצית. השתמש במחט 21 G חד לקחת ביס קטן של השריר. ואז, לדחוף את המחט דרך שריר. בעת הכנסה בשריר להיזהר לא לנקב כל איברים פנימיים או לגרום נזק מיותר לשריר.
   4. היצמד קצה חופשי של חוט כסף אחד לפתיחת 21 מחט G. משוך בעדינות מחט בחזרה דרך השריר לצייר חוט הכסף באמצעות עקיצת השריר. כאשר המחט היא ללא שרירים, משוך בעדינות חוט כסף דרך שרירים עד ללולאה בחוט היא מיושר עםביס שריר.
   5. חזור על שלבים 1.7.3-1.7.4 לחוט שריר שני. חוט זה צריך להיות ממוקם ~ 0.5 סנטימטר מחוט השריר הראשון. חשוב ששני חוטים לא לגעת לאחר כניסה.
   6. הכנס את החוט השלישי הכסף (קרקע) בחזהו הנחותה ללב.
      1. השתמש במחט 21 G חד לקחת ביס קטן של עור (אין צורך לעשות חתך או לגלח את העור) ולדחוף את המחט דרך העור.
      2. הכנס חוט כסף כפי שתואר לעיל ולמשוך דרך עור.
9. מניחים כמות קטנה של שמן מינרלי 37.5 סטרילי ° C מעל השרירים החשופים כדי לשמור עליהם לחים ולמשוך את העור מעל שרירים כנחשפו עד כמה שניתן.
10. הזרק 0.5 מיליליטר תמיסת מלח תת עורי כדי לעזור לשמור על רמות נוזלים במהלך השלבים הבאים.
11. בעדינות מגלגל את בעלי חיים על צד כך שאפשר לקיים בקלות בטמפרטורת גוף.

2. נוהל שלב למטה הרדמה החלקית (טוטהזמן l ~ 75 דקות)

פרוטוקול ההרדמה הבאה כבר אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת Duquesne ועולה בקנה אחד עם הנחיות מהמכון הלאומי לבריאות.

1. מייד לאחר החלק הראשון (למעלה) הוא מוחלט, isoflurane הנמוך ל1.5%. החזק ברמה זו במשך 15 דקות.
2. isoflurane נמוך יותר כך שבעלי החיים הוא מורדמים באופן חלקי.
   1. isoflurane נמוך יותר על ידי 0.125% כל 15 דקות עד תערוכות בעלי חיים תגובת כיפוף לקמצוץ הבוהן אבל לא להשמיע או אחר לזוז.
   2. בדרך כלל, ברמה של isoflurane .8-1.0% היא אופטימלית, עם זאת רמות יכולות להשתנות בשל הבדלים בהגדרות הרדמה. ניקוד ו / או ניידות הם אירועים נדירים ביותר, כאשר הרדמה היא ברמה הנאותה.

. 3 electromyogram הקלטה (EMG) בשלפוחית ​​שתן נפוח עם לחצים מדורגים (15-75 מ"מ כספית) (זמן כולל - משתנים בהתאם לניסוי)

הגדרת הפריטים הבאים עבור הקלטת EMG והתנפחות שלפוחית ​​השתן:

1. התקנת מגבר, digitizer, ותוכנת צריבה. בהגדרה זו, יש digitizer קלט אחד למגבר ושתי כניסות לוסת לחץ (בלחץ ותשומות סמן גירוי, ראה להלן סעיף 3.1.2). התקנת חומרה ותוכנה מדויקת להתאמה אישית (ראה חומרי רשימה להוראות ספציפיות).
2. התקנת מערכת כדי לספק פרצים מסוימים של לחץ אוויר לבעלי חיים. מערכת זו מכונות "וסת לחץ מתוזמן" בפרוטוקול הבא. היא מאפשרת משלוח לחץ אוטומטי כוללים דיגיטציה של לחץ אוויר, שליטה על אורך משפט, אוטומציה מרווח בין משפט, שליטה של מספר משפט, וגירוי אותות דיגיטליים תחילת (ראה Anderson et al. ¹⁴ לסכמטי של וסת לחץ מתוזמן).

לחבר את כל החוטים להוביל מעכבר (2 חוטי בטן + חוט קרקע 1) למגבר וdigitizer ולהתחיל אות EMG הקלטה בתוכנת digitizer. שים לב באיזו שעה "כתיבה" נבחר בתוכנת digitizer.

הסר את מגבת נייר מצנתר בשלפוחית ​​השתן. חבר קטטר לצינור אוויר (מוסת לחץ מתוזמן.)

לספק משפט 20 שניות בודדות בלחץ התנפחות mmHg 60.

1. הגדר את זרימת הרגולטור 60 מ"מ כספית (בדיקת לחץ באמצעות מד לחץ דם אנלוגי.)
2. הגדר את וסת לחץ מתוזמן כדי לספק מרווח prepressure 20 שניות (זה יהיה אות גירוי 2V נרשמה בתוכנת digitizer) ואחריו דופק התנפחות לחץ 20 שניות.
3. להתחיל את הניסוי (מרווח prepressure + משפט התנפחות לחץ). כאשר ניסוי הלחץ הממשי מתחיל, בדוק את הלחץ באמצעות 3 sphygmomanometers מחובר למערכת.
4. במהלך משפט התנפחות לחץ, איתות חזקה EMG (> 0.5 V) יש לשים לב במהלך ואולי אחרי התנפחות שניות 20. בעלי החיים עשויים להפגין abdomiתנועת nal אבל החיה לא צריכה להשמיע או אחרת לזוז. אמנם נדיר, אם תנועות או קולות חריגים הם נצפו, להעלות את רמת isoflurane.

אם התנפחות mmHg 1 ^st 60 מייצרת אות מתאימה EMG, חזור על שלב 3.4 עוד פעמיים עם מרווח של 1-2 intertrial דקות.

עם קבלת אותות חזקים משלושת 60 mmHg הניסויים, לבצע distentions הניסיוני.

1. מחקרים רבים משתמשים התמתחויות מדורגות מתחילים בלחץ נמוך (10-15 מ"מ כספית) ועובדים עד לחצים רעילים (75-80 מ"מ כספית) במרווחים של 10-15 מ"מ כספית. ראה תוצאות נציג מתחת לעקבות דוגמא בלחצים שונים.
2. ניסויים אופייניים כוללים מרווח 20 prepressure שניות, משפט התנפחות לחץ 20 שניות, ומרווח intertrial 1-2 דקות.
3. בצע שלוש distentions בכל לחץ ולאחר מכן בממוצע על פני שלושה הניסויים (להשיג תגובת visceromotor בודדת עבור כל לחץ). בשיטה חלופית, עמ 'erform חמש התמתחויות בכל לחץ, לבטל את הניסויים גבוהים ונמוכים, ולאחר מכן בממוצע שלוש התגובות שנותרו.

התמתחויות ברגע שניסוי הושלמו, לעצור את ההקלטה, שמור את קובץ הניסוי, ולהקריב בעלי חיים תוך שימוש בשיטות שאושרו.

4. ניתוח של עקבות הגלם EMG

1. ניתוח של תגובות visceromotor (כלומר הקלטות EMG) בקלות לעשות זאת באמצעות תוכנת digitizer ב-Board או באמצעות תכנית של צד שלישי (חומרי רשימה) ההוראות הבאות הן הוראות כלליות שיכול לשמש לניתוח נתונים זה באמצעות מספר רב של תוכניות או באמצעות ניתוח ידני .
2. כדי לייצא EMG, לחץ, ונתונים אות גירוי מתוכנה digitizer בצעו את הפעולות הבאות:
   1. פתח את קובץ ניסיוני.
   2. לחץ על "קובץ", "יצוא כ".
   3. לשנות את סוג הקובץ ל" טקסט גיליון אלקטרוני (. Txt), "שם הקובץ ולחץ על" שמור ".
   4. בפוחלון p-up, לשנות את קצב דגימת פלט "1000," לשנות את שעת ההתחלה לאיסוף נתונים הרגע החל ולשנות את שעת הסיום ל" MaxTime (). "בחר בתיבת סימון" פלט שינוי בזמן כל כך השורה הראשונה היא 0.0 שניות ", ולחץ על" אישור ".
   5. נתוני החברה לייצא כקובץ טקסט שניתן לפתוח במגוון רחב של תוכניות. הקובץ צריך להכיל ארבעה עמודים (טיימר, VMR (EMG), לחץ, Stimulus).
3. לכל חיה ניסיונית נבדקה, לבצע הפעולות מתמטיות הבאות.
   1. לתקן אות EMG לנתונים כל שנקבעו על ידי חישוב הערך המוחלט של כל נקודת זמן.
   2. לקבוע את תגובת EMG הממוצעת בסעיף הרקע של הניסוי.
   3. לחסר תגובה זו ממוצעת רקע EMG מכל נקודת נתונים לתקן בניסוי כדי להשיג את סט הנתונים המתוקן רקע.
   4. קבע את השטח מתחת לעקומה (AUC) עבור כל מראש 20 שניותמרווח לחץ בערכת נתונים המתוקן הרקע.
   5. לקבוע את AUC עבור כל ניסוי התנפחות לחץ 20 שניות בערכת נתונים מתוקנות הרקע.
   6. מחלקים כל AUC נפיחות בלחץ המשפט (שהושג בשלב 4.3.5) על ידי מרווח prepressure הנמוך ביותר AUC מהניסוי כולו (שהושג בשלב 4.3.4.). זהו AUC תיקן המנורמל ורקע לכל ניסוי התנפחות לחץ מלא.
4. לכל חיה ניסיונית, ניסויים מנורמלים מספר ממוצע מלחץ יחיד להשיג VMR המנורמל בוולט * שניות (Vsec).
5. בצע את הסטטיסטיקה המתאימה על הנתונים בהתאם לעיצוב ניסיוני.

Representative Results

איור של התקנת UBD-VMR הכולל שניתן לראות באיור 1 א. צעדי לחץ גובר לגרום לעלייה בVMR הגלם (כלומר EMG) (איור 1). VMR הגלם, לחץ, ואות סמן גירוי שיש לשים לב במהלך ההקלטה באמצעות תוכנת digitizer ניתן לראות באיור 2. הערוץ העליון ראה ב איור 2 הוא עקבות EMG (בV). אות הרקע של עקבות EMG צריכה להיות יציבה ומשרעת נמוכים (<0.2 V). אם הרקע הוא גבוה או מכיל קוצים גדולים ספורדי (> 0.5 V) החוטים והגדרות מגבר אולי צריכים להיות מותאמים. בנסיבות מסוימות עטיפת חוטים (מעכבר למגבר ו / או מגבר לdigitizer) בנייר כסף יכול להפחית קצת רעש. הערוץ האמצעי באיור 2 מראה את האות ללחץ כלכמת ידי וסת לחץ מתוזמן במ"מ כספי. שים לב שתחילת האות היא עקומה. זו מתרחשת משום התנפחות מלאהשלפוחית ​​השתן הוא לא מיידית. ברגע שאותות הלחץ מגיעים לערך המרבי עבור משפט ש( למשל 75 מ"מ כספית באיור 2), הלחץ צריך להישאר באותו ערך מקסימאלי. בהזדמנות, אוויר יכול לדלוף החוצה של השופכה סביב הקטטר. זה קורה בתדירות הגבוהה ביותר בלחצים גבוהים (למשל.> 60 מ"מ כספית), ניתן להבחין בשינוי במשרעת של אותות לחץ, ויכול להיות מופחת על ידי הוספת כמות קטנה של חומר סיכה כירורגית סביב הפתח השופכה. הערוץ הסופי (החלק התחתון של איור 2) מראה את ערוץ סמן הגירוי. ערוץ סמן הגירוי מראה שני אותות נפרדים. בתחילת מרווח prepressure יש סמן אות 2 V רגעי. אות זה יכול לשמש כדי להפוך את תהליך ניתוח הנתונים עבור ניסוי נתון. באופן ספציפי, ניתן לתכנת את מערכת לניתוח נתונים כדי לסרוק באמצעות קובץ נתונים מחפש סמני גירוי המתנשאים מעל 1.5 V. זה מאפשר למערכת לניתוח נתונים לquickly למצוא אחד את המשפט שלם. המרכיב השני של ערוץ הגירוי הוא אות V 1 המתרחשת במהלך משפט התנפחות לחץ כולו. שוב, את נוכחותו של אות שנייה זה יכול לשמש לניתוח נתונים קל.

נציגי נתונים מבעלי חיים ניסיוניים אחת שניתן לראות באיור 3 ולוח 1 החיה הייתה שלוש פעמים נפוחות בכל אחד מהלחץ הבא:. (. איור 3A; טבלת 1) 15, 30, 45, 60, ו75 mmHg שלוש distentions הם ממוצעים ומיוצגים כנקודת נתונים יחידה בגרף. שים לב כי עליות אות מנורמלות בהדרגה עם עלייה בלחצי התנפחות שלפוחית ​​השתן. בעקבות סט נפיחות ראשוני זה, החיה הזו קיבלה שתי קבוצות נוספות של התנפחות שלפוחית ​​מדורגת. כפי שניתן לראות באיור 3 ב, הסטים השניה והשלישי של distentions מיוצרים VMRs הדומה (בכל לחץ.) שלושת סטים אלה של distentions התרחשו מעל 2.5 פרי hrOD מפגין יציבות של הגדרת ההקלטה והשחזור של הגירוי ותגובת UBD VMR בחיה אחת. חשוב לציין, היציבות לטווח הארוך של הכנה זו מתרחשת רק כאשר ההרדמה isoflurane היא צעד למטה במשך שעה 1 בהדרגה. הליך הרדמה קצר יותר יכול להוביל לאובדן הדרגתי באות UBD VMR עם כל קבוצה של distentions (תצפיות לא פורסמו, סאדלר וקולבר.) גורם קריטי נוסף ביציבותה של מערכת UBD VMR הוא התחזוקה של טמפרטורת גוף יציבה. כפי שניתן לראות בתרשים 4, UBD VMR (בתגובה ל60 התנפחות מ"מ כספית) נמוך באופן משמעותי ב33.5 טמפרטורת גוף ° C בהשוואה ל37.5 ° C.

איור 1. תגובות Visceromotor (VMR) מUBD. () Schematiג של התקנת UBD. אוויר דחוס מועבר לשלפוחית ​​שתן באמצעות קטטר בשופכה. במהלך התמתחויות, אלקטרודות ברשומת שרירי בטן EMG. לאורך ההליך כולו, טמפרטורה נשמרת באמצעות כרית חימום הפועל על סוללות ומנורת תקרה. (ב) דוגמא EMG עקבות במהלך UBD. עם עלייה בלחץ, פלט חשמלי משרירי בטן מגביר congruently.

איור 2. מסך ירה מראה נתונים במהלך משפט UBD. שלושה ערוצים מוצגים. הערוץ העליון מראה את עקבות EMG גלם (בV.) הערוץ האמצעי מראה את הלחץ (במ"מ הכספי) שהוא מועבר לשלפוחית ​​השתן. העקבות התחתונה מראה את ערוץ סמן גירוי המציין את תחילתו של מרווח prepressure ומשפט התנפחות לחץ כולו. תמונה היא למשפט שלם 40 שניות (2 מרווח prepressure 0 שניות בתוספת 20 משפט התנפחות לחץ שניות.)

איור 3. נתונים נציג מראים VMR מדורג. () עליות VMR מנורמלות בהדרגה עם לחץ הולך וגובר (15-75 מ"מ כספית) מועברות לשלפוחית ​​השתן של העכבר. (ב) קבוצות עוקבות של distentions שלפוחית ​​השתן (15-75 מ"מ כספית = סט 1) מראות VMRs הדומה בהשוואה לסט הראשון של distentions.

. איור 4 טמפרטורת גוף יורדת UBD VMR ירידה בטמפרטורת גוף מ37.5 ° C ל33.5 מעלות צלזיוס גורמת לירידה משמעותית בVMR UBD. (N = 6;. לזווג מבחן t * P <0.05)

s = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד">
טבלת 1. נציגי נתונים עבור סט מלא של distentions. טבלה מציגה נתונים כולל AUC התנפחות לחץ, prepressure AUC מרווח, AUC התנפחות לחץ תיקן רקע, וAUC התנפחות לחץ המנורמל. לכל לחץ, החיה קיבלה שלושה ניסויים התנפחות. ממוצע AUC התנפחות לחץ המנורמל בכל לחץ הוא להתוות איור 3 א.

Discussion

בבני אדם, תסמונת כאב דלקת שלפוחית ​​השתן / שלפוחית ​​השתן interstitial (IC / BPS) מהווה בעיה קלינית משמעותית, כי חולי כאב מתישים כי היא לעתים קרובות אינו מגיב לטיפול בכאב רגיל ^15. אחד האתגרים המרכזיים בהבנה ובסופו של דבר טיפול בכאב כרוני בשלפוחית ​​השתן הוא להבין את התהליכים עצביים הרגילים שמעורבים בתגובה להתנפחות שלפוחית ​​השתן רעיל. על מנת להתגבר על האתגר הזה, מודל חיה של כאבים בשלפוחית ​​השתן הוא הכרחי. מודל זה צריך להיות לשחזור, יציב, בקלות ובנמדד. למרבה המזל, נס ועמיתים ¹⁰ פיתחו מערכת שיכול לשמש כדי לחקור את התגובות הפיזיולוגיות להתנפחות שלפוחית ​​השתן רעיל.

הגדרת מערכת היא פשוטה וניתן לעשות זאת באמצעות בעיקר חומרה ותוכנה ה-off-המדף. החתיכה המותאמת אישית הגדולה של הציוד המעורב במערכת UBD VMR היא וסת לחץ מתוזמן. מכונה זו מספקת אנלוגיתלדיגיטלית המרה של לחץ אוויר ושולח סמני הופעת גירוי לחומרת digitizer. השימוש בוסת לחץ בעיתוי מאוד מפשטת ניתוח נתונים באופן אוטומטי על ידי סינכרון גירוי לחץ עם EMG שנרשם (כלומר. VMR) זה חשוב כי VMR לא בהכרח להתחיל דווקא כאשר שלפוחית ​​השתן הוא ראשון נפוחה וVMR לעתים קרובות נשמר במשך תקופה קצרה (<5 שניות) לאחר סיום ההתנפחות. עם זאת, עם סנכרון זהיר, אפשר בקלות לבצע את הליך UBD VMR עם רגולטור / כיבוי כדי לשלוט התנפחות / כיבוי וטיימר שהוא מסונכרן עם אות EMG שנרשמה.

יתרון עיקרי של מערכת UBD VMR לחקירה את תפקיד מערכת העצבים בכאב בשלפוחית ​​השתן הוא שתגובות ללחצי התנפחות שלפוחית ​​מדורגות נופלות לאורך עקומה סטנדרטית עם לחצים גובר וישכנע VMRs גדול יותר. זה מאפשר לחוקר לקבוע בקלות אם אדם ניסיוניipulation גורם לעלייה או ירידה בVMR בלחצים התנפחות שלפוחית ​​השתן שני תמימים ורעילים. בנוסף, האות מחיה אחת היא יציבה מאוד לאורך זמן, כך שניתן לעשות סיבובים רבים של התנפחות מדורגת (איור 3 ב). זה מאפשר לחוקרים לקבל בסיס UBD VMR ולאחר מכן לתפעל את בעלי החיים (למשל לספק סמים) עבור בתוך-הנושא ¹³ התואמים. החוקרים השתמשו במערכת UBD-VMR (בעכברים וחולדות) להקליט או לתפעל הנוירונים השדרה קרן הגבית כבל ¹⁶ ונוירונים אחרים במערכת העצבים המרכזית (לדוגמא מקורי הגחון לשד ¹⁷ או האמיגדלה ^13,16.) מחקרים אלה ואחרים ימשיכו להוסיף לשל התפקיד של מרכיבים שונים של מערכת העצבים בעיבוד של קלט חושי ושלפוחית ​​שתן ההבנה המדעית הבסיסית שלנו בסופו של הכאב הסובייקטיבית הרגיש מקלט nociceptive זה. בעוד מערכת UBD VMR כוללת יתרונות רבים ניסיונייםמחדש כמה מגבלות למודל. ראשית, בזמן התנפחות שלפוחית ​​קרביים מעוררת תחושות הסובייקטיבית של "כאב" בבני אדם אי אפשר לדעת אם הקלטות EMG בטן בעכברים הם באמת נציג של כאב. עם זאת, תגובות UBD VMR מעוכבות על ידי משככי כאבים נפוצים המצביעים על כך VMR הוא תגובה כמו כאב. שנית, במערכת UBD-VMR הנוכחית, החיות מורדמים במהלך הקלטה. למרות שהשוואה של חיה לעומת הרדים UBD VMR יש תוקף את השימוש בהרדמת ^10, יש השפעות לא ידועות אפשריות של isoflurane על תגובות כמו כאב. שלישית, הפרוטוקול המתואר הוא לא ניתוח הישרדות כך מספר קלטות של עכברים בודדים לאורך הזמן אינן אפשריות. יחד עם זאת, שימוש במודל UBD-VMR, כמו גם מערכות כאב קרביים אחרות יאפשר להבנה של כאב בטן מלאה יותר ויוביל לאפיקים טיפוליים חדשים עבור חולים הסובלים מIC / BPS ותנאי כאב קרביים אחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared heating blanket and monitoring system	Kent Scientific	Right-Temp System	This system is set up to monitor two separate temperatures.  This should include the animal and the heating blanket.  In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp.  However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off.  Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment.
Isoflurane vaporizer	Draeger	Vapor 19.1	Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane.
Isoflurane	multiple sources	n/a
100% Oxygen air tank	multiple sources	n/a	For ventilation of animal
Air breathing grade	multiple sources	n/a	For bladder distention
24 G 0.56 in IV catheter	BD Biosciences	381411	For bladder catheterization
Surgilube (sterile)	Savage Laboratories	0281-0205-02	Any surgical grade lubricate would work fine.
Mineral oil (sterile)	multiple sources	n/a
Saline (sterile)	multiple sources	n/a
AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation	Warner Instruments	W4 64-1318	Any silver wire with these specifications will work.  Wire does not need to be "chlorinated."
Ophthalmic ointment	multiple sources	n/a
Small surgical scissors	multiple sources	n/a
Sharp forceps	multiple sources	n/a
21 G Needle	multiple sources	n/a
Grass amplifier P511 with 3-lead input cable	Grass Instruments	P511 (F-P5IC3/REV1)	This is the "amplifier" used in the protocol.  Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in.
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent)	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	This is the "digitizer" used in the protocol.  Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal.
CED Spike2 software	Cambridge Electronic Design	Spike 2	This is the the "digitizer software" used in the protocol.  Should be from same manufacturer as digitizer.  Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range.
Flow chart from air tank to bladder catheter	n/a	n/a	Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder:  Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector.  Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer.  Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing  to a 3rd y connector.  Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter.
Gilmont Flowmeter	Gilmont	GF8321-1401	Multiple brands of flowmeters will work.  For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter).  For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min).
4-way Gang valve	Elite		This is a specific piece of equipment.  The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures.  In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes.  Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg.
1/4 in Tubing	multiple sources	n/a
3/32 inch Tubing	multiple sources	n/a
"Y" connectors (1/4 and 3/32 in)	multiple sources	n/a
Sphygmomanometer	CVS		Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application.
Timed Pressure Regulator	custom		This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal.  However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch.   Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4).  In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis.
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments.