Summary
Ca. 3 til 8.000.000 mennesker i USA lider af interstitiel cystitis / blære smertesyndrom (IC / BPS), en invaliderende tilstand karakteriseret dels ved bækkensmerter. For at undersøge nervesystemet bidrag til den tilstand, er en fysiologisk model af urinblæren smerte anvendes i mus og rotter.
Abstract
Ca. 3 til 8.000.000 mennesker i USA lider af interstitiel cystitis / blære smertesyndrom (IC / BPS), en invaliderende tilstand karakteriseret ved øget presserende og hyppig vandladning, samt nykturi og generel bækkensmerter, navnlig ved blærefyldning eller tømme. Trods mange års forskning, årsagen til IC / BPS fortsat undvigende og behandling strategier ikke er i stand til at levere komplette nødhjælp til patienterne. For at undersøge nervesystemet bidrag til den tilstand, har mange dyremodeller er blevet udviklet til at efterligne den smerte og symptomer forbundet med IC / BPS. En sådan musemodel er urinblæren udspilet (UBD). I denne model, er komprimeret luft, et specifikt tryk leveres til blæren af en let bedøvet dyr over et bestemt tidsrum. Under hele proceduren ledninger i de overlegne skrå mavemuskler optage elektriske aktivitet fra musklen. Denne aktivitet er kendt som visceromotor respons (VMR) og isa pålidelig og reproducerbar måling af nociception. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at udføre denne teknik i mus, herunder kirurgiske manipulationer, fysiologiske optagelse og dataanalyse. Med brugen af denne model, kan koordineringen mellem primære sensoriske neuroner, rygmarv sekundære afferente og højere centralnervesystemet områder involveret i blæresmerter blive bragt i orden. Denne grundlæggende videnskab viden kan derefter klinisk oversættes til at behandle patienter, der lider af IC / BPS.
Introduction
Kroniske smerter er officielt defineret som smerte, der varer i cirka tre måneder eller længere end den normale væv helbredende tid 1. Denne type smerter er en af de vigtigste årsager til, at folk er tvunget til at søge lægehjælp 2 og kan koste op til 635 milliarder dollar dollars årligt 3. Aktuel kroniske smerter mestringsstrategier anses arkaisk; efter årtier med medicinske fremskridt, NSAID (non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler) og opioider er stadig de primære behandlinger ordineret af læger. Men disse behandlinger rettet mod alle de forskellige former for smerter på samme måde, som giver smertestillende effekter over hele kroppen i modsætning til specifikt at fokusere på årsagen til, at nøjagtig smerte hændelse. For bedre at kunne hjælpe dem, der lider af kroniske smerter, bør forskningen lægges forskudt mod ætiologi og eventuelle smerter-specifikke behandlinger er forbundet med de mest almindelige årsager til kroniske smerter. Målet med denne manuscript er at beskrive en model, der anvendes til bedre at forstå en tilstand kendt som Interstitiel blærebetændelse / Smertefuld Blære syndrom (IC / BPS).
IC / BPS er en invaliderende sygdom, der rammer millioner af mennesker, primært kvinder over en alder af 40 4. De nøjagtige årsager til IC / BPS er ikke kendt, men udbredelsen har været knyttet til genetik 5, specifikke kostvaner, og højt stressniveau 6 . Symptomer på IC / BPS omfatter, men er ikke begrænset til: Øget haster med at urinere, hyppig vandladning, smertende, piercing, eller brændende smerter under blære fyldning og tømning, og nykturi 7. Patienter, der oplever disse betingelser har højere stressniveau og er mere bekymrede 8. Denne øgede stress resulterer i øget smerte, hvilket øger de oprindelige stressniveau. Undersøgelser har vist, at depression og angst niveauet falder følgende behandlinger, der afhjælper urin smerte, således effektivt bryde denne positive-feedback-cyklus For at undersøge nervesystemet bidrag til den tilstand, har mange dyremodeller er blevet udviklet til at efterligne den smerte og symptomer forbundet med IC / BPS. Traditionelt har blærebetændelse blevet genskabt i dyr med indførelsen af forskellige kemikalier såsom sennep olie, acetone, lipopolysaccharid, saltsyre, og cyclophosphamid i blæren. Men ingen udenlandske agenter er til stede i den sterile urin af IC / BPS patienter, og dermed spørgsmålstegn ved gyldigheden af disse modeller. En anden murin model for urologisk smerte er urinblæren udspilet (UBD) 10. I denne model, er komprimeret luft, et specifikt tryk leveret til blære vågen eller let bedøvet dyr over en given tidsperiode. Under hele proceduren ledninger i den overlegne skrå mavemuskler rekord elektrisk aktivitettet fra musklen (med en electromyogram (EMG)). Denne aktivitet er kendt som visceromotor respons (VMR), og er pålidelig, reproducerbar måling af nociception 10. Lignende hule organ udspilning (fx blære, endetarm) hos raske forsøgspersoner producerer følelser af ubehag og betydelige stigninger i rapporteret smerte 11,12, karaktertræk, der ofte anvendes til at diagnosticere IC / BPS. Således i forbindelse med den elektriske, farmakologiske og optogenetic fremgangsmåder til stimulering eller inhibering UBD er en nyttig og gyldig model for forståelse af både de perifere og centrale nervesystem komponenter i blæren nociception og smerte. Her beskriver vi proceduren for UBD som i øjeblikket bruges i vores laboratorium indenfor kvindelige medlemmer af den fælles musestamme, C57BL/6J. Grundet vanskeligheder i kateterisation proces hanner er denne procedure udføres primært i hunmus. Denne protokol er blevet tilpasset fra, der er udviklet af Ness <em> m.fl. 10. og tidligere offentliggjorte fra vores laboratorium 13. Følgende protokol beskriver fire primære komponenter i denne model i bedøvede dyr: (1) blære kateter og optagelse elektrode kirurgi (2) delvis anæstesi induktion (3) blære udspilning og VMR optagelse, og (4) dataanalyse af rå VMR / EMG spor . Subtile forskelle i UBD-VMR procedure på grund af valget af organisme anæstesidybde og induktion, og legemstemperatur er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Duquesne University og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health.
1.. Kirurgisk implantation af Wire elektroder og Urinblæren Kateter med sterile teknikker (total tid 5-10 min)
- Følgende punkter bør være forberedt før start kirurgi:
- Aktivt overvåge og justere kroppens temperatur til 37,5 ± 0,5 ° C ved hjælp af overvågningssystem temperatur med en batteri-drevet varmepude og dyrs kropstemperatur sonde (Materialer List) Tilslut automatisk system til en lav-watt-varmelampe til ekstra kontrol af kropstemperaturen.
- Nødvendigt udstyr for isofluran anæstesi omfatter trykluft (fx 100% O 2), isofluran fordamper, isofluran, isofluran induktion kammer (for første knockdown), næse kegle og udstødningssystem.
- Saml the ordentlig kirurgiske instrumenter, IV kateter og elektroder (Materials List)
- Fremkald bedøvelsesmiddel stat i induktion kammer ved 2-3% isofluran. Fjern musen fra kammer, når stabilitetsrefleks er tabt (0-1 min.)
- Placer musen i næse kegle med 2-2,5% isofluran. Klem tå for at tjekke for fuld bedøvelse. Der bør ikke være nogen reaktion fra dyret. Start timer.
- Anbring 1 dråbe af oftalmologiske salve på hvert øje af mus.
- Vend musen over så dorsalsiden vender nedad.
- Sæt kateteret gennem urethra og ind i blæren.
- Dyp kateter kirurgisk lube at smøre kateter.
- Hold forsigtigt urinrørets åbning med spidse pincet vinkelret på dyrets krop. Holding kateter med den 2. sæt pincet, indsæt forsigtigt kateter ende i urinrøret i en vinkel vinkelret på dyrets krop.
- Når kateteret er gået ind i urinrøret ~ 1-2 mm, juster forsigtigt kateter, så det nu er parallel til kroppensigter mod hovedet. Denne bevægelse er nødvendig for at undgå skambenet.
- Skub forsigtigt kateter mod musens krop. Kateteret skal glide ind i kroppen hulrum glat og uden modstand. Tving ikke kateter. Hvis kateteret ikke kommer uden problemer, vende tilbage til kateteret vinkelret position og start igen.
- Med kateter helt indsat i blæren, skub forsigtigt ned på musens mave at udvise blære indhold. Fjern alle urin fra kateteret ved at skubbe et lille stykke køkkenrulle i kateter åbning. Når papir håndklæde vædet med urin, udskift. Fjern urin kontinuerligt gennem hele den resterende protokol herunder under blære udspilning eksperimenter (se protokol 3 nedenfor).
- Sæt to sølvtråde i venstre mavemuskler og en sølvtråd i brystet (som en grund.)
- Alkohol eller iod til at desinficere område sideværts til højre for kateter (dyrets venstre side af kroppen.)
- Expose venstre mavemuskel.
- Hold huden nær venstre mavemuskel med pincet. Lav en lille 1-2 cm incision med medium kirurgisk saks.
- Sæt spidsen af en saks i snit og forsigtigt udvide snit til 2 cm.
- Pincet til at flytte overliggende fascia at eksponere overlegne skrå abdominale muskler. Vær forsigtig med ikke at skære / rive nogen af de store blodkar, der er placeret i denne region.
- Bøje tre sølvtråde i halve. Brug skarpe 21 G kanyle at tage en lille bid af musklen. Derefter skubbe nålen igennem muskel. Når du indsætter i muskler være forsigtig med ikke at punktere enhver indre organer eller fremkalde unødig skade på musklen.
- Stick en fri ende af en sølvtråd i åbningen 21 G kanyle. Træk forsigtigt nålen tilbage gennem musklen til at trække sølvtråd gennem musklen bid. Når nålen er fri fra muskler, forsigtigt trække sølvtråd gennem musklen indtil løkken i ledningen flugter medmuskel bid.
- Gentag trin 1.7.3-1.7.4 for anden muskel wire. Denne ledning skal placeres ~ 0,5 cm fra den første muskel ledning. Det er vigtigt, at de to ledninger ikke rører efter indsættelse.
- Sæt den tredje sølvtråd (jord) i brystet ringere til hjertet.
- Brug skarp 21 G kanyle til at tage en lille bid af huden (det er ikke nødvendigt at gøre et snit eller barbere huden) og skub nålen gennem huden.
- Indsæt sølvtråd, som beskrevet ovenfor, og træk gennem huden.
- Placer en lille mængde af 37,5 ° C steril mineralsk olie over de eksponerede muskler til at holde dem fugtige og trække huden over så meget udsat muskel som muligt.
- Injicer 0,5 ml saltvand subkutant til hjælpe med at opretholde væskestande under efterfølgende trin.
- Rul forsigtigt dyr på side, så kropstemperaturen let kan opretholdes.
2.. Delvis Anæstesi Step-down Procedure (total tid ~ 75 min)
Følgende anæstesi protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Duquesne University og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health.
- Umiddelbart efter afsnit I (ovenfor) er færdig, lavere isofluran til 1,5%. Hold på dette niveau i 15 min.
- Lavere isofluran, således at dyret er delvist bedøvet.
- Lavere isofluran med 0,125% hver 15 min indtil dyre udstillinger en bøjning respons til tå pinch, men ikke vocalize eller på anden måde bevæge sig.
- Typisk et niveau på 0,8-1,0% isofluran er optimal, men niveauer kan variere på grund af forskelle i anæstesi opsætninger. Vokalisering og / eller ambulation er ekstremt sjældne begivenheder, når anæstesien er på det rette niveau.
. 3. Electromyogram (EMG) optagelse under Blære Udspiling med Graded tryk (15-75 mmHg) (total tid - variabel afhængig eksperiment)
- Opsætning en forstærker, en digitizer, og optagelse software. I denne opsætning digitizer har én indgang til forstærkeren og to indgange til trykregulatoren (tryk og stimulus markør indgange, se nedenfor afsnit 3.1.2). Præcis hardware og software setup kan tilpasses (se Materialer List for specifikke anvisninger).
- Opsætning af et system til at levere specifikke byger af lufttryk til dyr. Dette system er benævnt "timed trykregulator" i den følgende protokol. Det giver mulighed for automatiseret pres levering, herunder digitalisering af lufttryk, kontrol af retssagen længde, inter-retssagen interval automatisering, styring af forsøg nummer, og stimulus debut digitalt signal (se Anderson et al. 14 for skematisk af en tidsindstillet trykregulator).
- Indstil flowregulator til 60 mmHg (Check tryk ved hjælp af en analog blodtryksmåler.)
- Indstil tidsstyret trykregulator til at levere en 20 sek fortryk interval (dette vil være 2V stimulus signalet registreres i digitizer software) efterfulgt af en 20 sek tryk udspilning puls.
- Start forsøget (fortryk interval + tryk udspilning retssag). Når den aktuelle pres retssagen begynder, dobbelttjekke tryk ved hjælp af de 3 blodtryksmålere er tilsluttet systemet.
- Under pres udspilning retssagen, bør observeres et stærkt EMG-signal (> 0,5 V) under og eventuelt efter 20 sek udspilning. Dyret kan udvise abdominal bevægelse, men bør dyret ikke vocalize eller på anden måde bevæge sig. Selvom det er sjældent, hvis unormale bevægelser eller lyde bliver overholdt, øges isofluran-niveau.
- Mange undersøgelser bruger sorterede distensions starter ved lavt tryk (10-15 mm Hg) og arbejder op til skadelige tryk (75-80 mmHg) i intervaller 10-15 mmHg. Se repræsentative resultater under for eksempel spor ved forskellige tryk.
- Typiske undersøgelser inkluderer en 20 sek fortryk interval, en 20 sek pres udspilning retssag, og en 1-2 min intertrial interval.
- Udfør tre distentions ved hvert tryk og derefter gennemsnit på tværs af de tre forsøg (for at opnå en enkelt visceromotor respons for hver tryk). I en alternativ fremgangsmåde, s.Foretag en fem distensions ved hvert tryk, kasseres den høje og lave forsøg, og derefter gennemsnit de resterende tre svar.
4.. Analyse af Raw EMG Traces
- Analyse af visceromotor reaktioner (dvs. EMG optagelser) er nemt gøres ved hjælp om bord digitizer software eller via en tredjeparts-program (Materialer List) Følgende er generelle oplysninger, der kunne bruges til at analysere disse data ved hjælp af flere programmer eller ved hjælp af manuel analyse .
- For at eksportere EMG, tryk og stimulus signal data fra digitizer software du gøre følgende:
- Åbn eksperimentelle fil.
- Klik på "File" "Eksporter som."
- Ændre filtypen til "regneark tekst (. Txt)," navngive filen og klik på "Gem".
- I pop-up vindue, ændre output sample rate til "1000," ændre starttidspunktet til det øjeblik begyndte dataindsamlingen og ændre sluttidspunktet til "Maxtid ()." Vælg feltet mærkning "tidsforskydning output så første linje er en 0,0 sek ", og klik" OK ".
- Dataene vil nu blive eksporteret som en tekstfil, der kan åbnes i en bred vifte af programmer. Filen skal indeholde fire kolonner (Timer, VMR (EMG), tryk, stimulus).
- For hver undersøgt forsøgsdyr, udføre følgende matematiske operationer.
- Afhjælp EMG signal for hele datasættet ved at beregne den absolutte værdi af hvert tidspunkt.
- Bestem den gennemsnitlige EMG-respons i baggrundsafsnittet af eksperimentet.
- Fratræk dette gennemsnit baggrund EMG-respons fra alle udbedret datapunkt i eksperimentet for at få korrigeret for baggrund datasæt.
- Bestem arealet under kurven (AUC) for hver 20 sek pretrykintervallet i baggrunden korrigerede datasæt.
- Bestem AUC for hver 20 sek pres udspiling retssag i baggrunden korrigerede datasæt.
- Opdele hvert tryk udspiling forsøg AUC (opnået i trin 4.3.5) ved den laveste fortryk interval AUC fra hele eksperimentet (opnået i trin 4.3.4.). Dette er det normaliserede og baggrund korrigeret AUC for hver fuldstændig pres udspilning retssag.
- For hvert forsøgsdyr, at den gennemsnitlige multiple normaliserede forsøg fra en enkelt tryk få normaliseret VMR i volt * sekunder (udgangsspænding).
- Udfør de relevante statistikker om de data, afhængigt af det eksperimentelle design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustration af den samlede UBD-VMR opsætning kan ses i figur 1A. Stigende tryk trin inducere en stigning i den rå VMR (dvs. EMG) (figur 1B). Den rå VMR, tryk og stimulus markør signaler, der skal observeres under optagelsen ved hjælp af digitizer software kan ses i figur 2. Den øverste kanal set i Figur 2 er EMG trace (i V). Baggrunden signal EMG spor skal være stabil og lav amplitude (<0,2 V). Hvis baggrunden er høj eller indeholder sporadiske store pigge (> 0,5 V) kan være nødvendigt at justere ledninger og forstærker indstillinger. I nogle tilfælde indpakning ledninger (fra mus til forstærker og / eller forstærker til digitizer) i folie kan reducere nogle støj. Den midterste kanal i Figur 2 viser tryksignalet som kvantificeres ved tidsstyret trykregulator mmHg. Bemærk, at signalet debut er en kurve. Det sker, fordi fuld udspilning afblæren ikke er øjeblikkelig. Når trykket signalet når den maksimale værdi for denne retssag (fx 75 mmHg i figur 2) skal trykket forblive på den maksimale værdi. Til tider kan luft sive ud af urinrøret omkring kateteret. Dette sker oftest ved høje tryk (f.eks.> 60 mmHg), kan iagttages ved en ændring i amplituden af tryksignalet, og kan reduceres ved tilsætning af en lille mængde af kirurgisk smøremiddel omkring urinrørets åbning. Den endelige kanal (nederst i figur 2) viser stimulus markør kanal. Stimulus markør kanal viser to separate signaler. Ved starten af fortryk interval er en momentan 2 V signal markør. Dette signal kan anvendes til at automatisere dataanalyse processen for et givet forsøg. Konkret kan man programmere en dataanalyse system til at scanne gennem en datafil på udkig efter stimulus markører, der rejser sig over 1,5 V. Dette tillader dataanalyse system quickly finde hver komplet forsøg. Den anden komponent af stimulus-kanalen er en 1 V signal, der opstår i løbet af hele pres udspilning retssag. Igen kan tilstedeværelsen af dette andet signal anvendes til nem analyse af data.
Repræsentative data fra en enkelt forsøgsdyret kan ses i figur 3 og tabel 1 dyret var udspilet tre gange ved hver af følgende tryk:. (. Figur 3A Tabel 1) 15, 30, 45, 60 og 75 mmHg Den tre distentions gennemsnitsberegnes repræsenteret et enkelt datapunkt i grafen. Bemærk, at de normaliserede signal øges gradvist med stigende blære udspilning pres. Efter denne indledende udspiling sæt, dette dyr fik to ekstra sæt gradueret blære udspilning. Som det ses i figur 3B, andet og tredje sæt af distentions gav lignende VMRs (ved hvert tryk.) Disse tre sæt distentions foregået over en 2,5 timers period viser stabilitet setup optagelse og reproducerbarheden af UBD stimulus og VMR reaktion i et enkelt dyr. Vigtigere er det, at stabiliteten af denne prep langsigtede forekommer kun, når isofluran anæstesi gradvist trådte ned i løbet af 1 time. En kortere anæstesi procedure kan føre til en gradvis tab i UBD VMR signal med hvert sæt af distentions (upublicerede observationer, Sadler og Kolber.) En anden afgørende faktor for stabiliteten i det UBD VMR-systemet er opretholdelsen af en stabil kropstemperatur. Som det ses i figur 4 UBD VMR (i respons på 60 mmHg udspilning) er betydeligt lavere på 33,5 ° C kropstemperatur i forhold til 37,5 ° C.
Figur 1.. Visceromotor responser (VMR) fra UBD. (A) Schematic af UBD setup. Trykluft er leveret i blæren via urethral kateter. Under distensions, elektroder i mavemuskel rekord EMG. Gennem hele proceduren, er temperatur opretholdes ved hjælp af et batteri-drevet varmepude og overhead-lampe. (B) Eksempel EMG spor under UBD. Når trykket stiger, elektriske output fra mavemuskler stiger coach.
Figur 2.. Skærmbillede viser data under UBD retssag. Tre kanaler vises. Den øverste kanal viser den rå EMG spor (i V.) Den midterste kanal viser trykket (i mmHg), som bliver leveret til blæren. Den nederste spor viser stimulus markør kanal, der angiver starten af fortryk interval og hele trykket udspilning forsøg. Billedet er en 40 sek komplet forsøg (20 sek fortryk interval plus 20 sek pres udspilning retssag.)
Figur 3.. Repræsentative data, der viser sorterede VMR. (A) De normaliserede VMR øges gradvist med stigende tryk (15-75 mm Hg) leveret til blæren på musen. (B) Efterfølgende sæt blære distentions (15-75 mmHg = 1 sæt) viser lignende VMRs forhold til første sæt distentions.
. Figur 4 Kropstemperaturen falder UBD VMR En reduktion i legemstemperatur fra 37,5 ° C til 33,5 ° C, medfører en betydelig nedgang i UBD VMR. (N = 6. Parret t-test * P <0,05)
Tabel 1.. Repræsentative data for et komplet sæt af distentions. Tabel viser data, herunder pres udspilning AUC, fortryk interval AUC, baggrund korrigeret pres udspilning AUC, og normaliseret pres udspilning AUC. For hvert tryk, dyr modtog tre udspilning forsøg. Gennemsnittet af den normaliserede tryk udspilning AUC ved hvert tryk er afbildet i figur 3A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos mennesker, interstitiel cystitis / blære smertesyndrom (IC / BPS) udgør et væsentligt klinisk problem, fordi patienter har invaliderende smerter, der ofte reagerer på regelmæssig smertebehandling 15. En af de store udfordringer i forståelse og i sidste ende behandling af kronisk blære smerter er at forstå den normale neurale processer, der er involveret i respons på skadelige blære udspilning. For at overvinde denne udfordring er det nødvendigt en dyremodel af blæresmerter. Denne model skal være reproducerbar, stabil og let måles. Heldigvis Ness og kolleger 10 udviklet et system, der kan anvendes til at undersøge de fysiologiske reaktioner på skadelige blære udspilning.
Systemopsætning er ligetil og kan gøres ved hjælp primært off-the-shelf hardware og software. Den største brugerdefinerede stykke udstyr er involveret i UBD VMR-systemet er den tidsindstillede trykregulator. Denne maskine giver et analogt-Til-digital konvertering af lufttryk og sender stimulus onset markører til digitizer hardware. Anvendelsen af den tidsstyrede trykregulator forenkler dataanalyse ved automatisk synkroniserer trykket stimulus med den indspillede EMG (dvs.. VMR) Dette er vigtigt, fordi VMR ikke nødvendigvis starter, netop når blæren er første udspilet og VMR ofte opretholdes en kort periode (<5 sek) efter afslutningen af udspilning. Ikke desto mindre, med omhyggelig synkronisering, kunne man nemt udføre UBD VMR procedure med en on / off regulator til at styre udspilning on / off og en timer, der er i sync med den optagede EMG-signalet.
En stor fordel ved UBD VMR system til afhører nervesystemet rolle i blæresmerter er, at reaktioner på graduerede blære udspilning pres falder langs en standardkurve med stigende pres inducerer større VMRs. Dette gør det muligt for forskeren at nemt at afgøre, om en eksperimentel mandipulation forårsager en stigning eller et fald i VMR både uskadelige og skadelige blære udspilning pres. Desuden signalet fra et enkelt dyr er meget stabil over tid, således at flere runder af gradueret udspilning kan gøres (figur 3B). Dette tillader forskerne at opnå en baseline UBD VMR og derefter manipulere dyret (f.eks levere et lægemiddel) til inden-emne matchende 13. Forskere har brugt UBD-VMR-systemet (mus og rotter) for at optage eller manipulere rygmarven baghornsneuroner neuroner 16 og andre neuroner i centralnervesystemet (f.eks rostral ventrale medulla 17 eller amygdala 13,16.) Disse undersøgelser og andre fortsætter at tilføje til vores grundlæggende videnskabelige forståelse af den rolle, de forskellige dele af nervesystemet i behandlingen af blæren sanseindtryk og i sidste ende subjektiv smerte mærkes fra denne nociceptive input. Mens UBD VMR system indeholder mange eksperimentelle fordele,re er nogle begrænsninger for modellen. Først, mens visceral blære udspilning fremkalder subjektive følelser af "smerte" i mennesker er det umuligt at vide, om abdominal EMG optagelser i mus der virkelig er repræsentative for smerte. Ikke desto mindre er UBD VMR reaktioner hæmmes af almindelige smertestillende tyder på, at VMR er en smerte-lignende reaktion. For det andet, i den nuværende UBD-VMR-systemet, bliver dyrene bedøvet under optagelsen. Selv om en sammenligning af levende versus bedøvede UBD VMR har valideret brugen af anæstesi 10, der er mulige ukendte virkninger af isofluran på smerte-lignende reaktioner. For det tredje, den beskrevne protokol er ikke en overlevelse kirurgi så flere optagelser af individuel mus over tid er ikke mulige. Ikke desto mindre vil brugen af UBD-VMR model samt andre viscerale smerte-systemer giver mulighed for en mere fuldstændig forståelse af visceral smerte og vil føre til nye terapeutiske muligheder for patienter, der lider af IC / BPS og andre viscerale smertetilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Drs. Robert Gereau, Henry Lai, og Lara Crock for deres nyttige assistance i oprettelsen af dette system. Vi vil også gerne anerkende finansieringskilder til dette arbejde (BJK - International Association for Study of Pain Early Career Research Grant af Scan | Design Foundation af Inger & JENS BRUUN og Duquesne University Hunkele frygtede sygdom Fund).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
