Urinblåsa Dilatation Evoked Visceromotor svar som en modell för smärtor i urinblåsan hos möss

Summary

Cirka 3 till 8.000.000 människor i USA lider av interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS), en försvagande tillstånd som kännetecknas delvis av bäckensmärta. För att studera nervsystemet bidrag till tillstånd är en fysiologisk modell av urinblåssmärta används i möss och råttor.

Abstract

Cirka 3 till 8.000.000 människor i USA lider av interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS), ett försvagande tillstånd som kännetecknas av en ökad brådska och miktionsfrekvens, samt nokturi och allmän smärta i bäckenet, särskilt vid blåsfyllning eller tömning. Trots år av forskning, orsaken till IC / BPS fortfarande instabil och behandlingsstrategier inte kan ge fullständig lindring till patienter. För att studera nervsystemet bidrag till tillståndet, har många djurmodeller har utvecklats för att efterlikna den smärta och symptom i samband med IC / BPS. En sådan musmodell är urinblåsan buk (UBD). I denna modell är tryckluft ett specifikt tryck som levereras till urinblåsan av en lätt sövda djur under en viss tidsperiod. Under hela förfarandet, trådar i den överlägsna sneda magmusklerna registrerar elektriska aktiviteten från muskeln. Denna aktivitet kallas visceromotor svar (VMR) och jagsa tillförlitliga och reproducerbara mått på nociception. Här beskriver vi de åtgärder som krävs för att utföra denna teknik i möss, inklusive kirurgiska manipulationer, fysiologisk inspelning och dataanalys. Med hjälp av denna modell, kan samordningen mellan primära sensoriska neuroner, ryggmärg sekundära afferenter och högre centrala nervsystemet områden som ingår i blåssmärta bli avslöjad. Denna grundläggande vetenskap kunskap kan sedan kliniskt översättas för att behandla patienter som lider av IC / BPS.

Introduction

Kronisk smärta är officiellt definieras som smärta som kvarstår i cirka tre månader, eller längre än den normala vävnaden läkningstiden ^1. Denna typ av smärta är en av de viktigaste anledningarna till att människor drivs att söka läkare ² och kan kosta upp till $ 635.000.000.000 dollar varje år ^3. Aktuell kronisk smärta copingstrategier anses ålderdomliga, efter årtionden av medicinska framsteg, NSAID (icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel) och opioider är fortfarande den primära behandling som ordinerats av läkare. Men dessa behandlingar är inriktade på alla olika typer av smärta på samma sätt, som ger smärtstillande effekter över hela kroppen i stället för att specifikt fokusera på orsaken till att exakt smärt incident. För att bättre kunna hjälpa dem som lider av kronisk smärta, bör forskningen uppmärksamhet förskjutas mot etiologi och eventuella smärtspecifika behandlingar i samband med de vanligaste orsakerna till kronisk smärta. Målet med denna manuscript är att beskriva en modell för att bättre förstå ett tillstånd som kallas Interstitiell cystit / Smärtsam blåsa (IC / BPS).

IC / BPS är ett försvagande tillstånd som drabbar miljontals människor, främst kvinnor över 40 års ålder ^4. De exakta orsakerna till IC / BPS är inte kända, men prevalensen har kopplats till genetik ^5, särskilda dieter, och höga stressnivåer ⁶ . Symtom på IC / BPS innefattar men är inte begränsade till: Ökad brådska att urinera, ökad miktionsfrekvens, värkande, stickande eller brännande smärta vid blås påfyllning och tömning, och nokturi ^7. Patienter som upplever dessa förhållanden har högre stressnivåer och är mer angelägna ^8. Detta ökad stress leder till ökad smärta, vilket förstärker den ursprungliga stressnivåer. Studier har visat att depression och ångest nivåer minskar efter behandlingar som lindrar urin smärta, vilket effektivt bryta denna positiva feedback-cykel

För att studera nervsystemet bidrag till tillståndet, har många djurmodeller har utvecklats för att efterlikna den smärta och symptom i samband med IC / BPS. Traditionellt har blåskatarr återskapats i djur med införandet av olika kemikalier såsom senapsolja, aceton, lipopolysackarid, saltsyra, och cyklofosfamid i urinblåsan. Men inga utländska agenter finns i den sterila urinen av IC / BPS patienter, alltså ifrågasätta giltigheten av dessa modeller. En annan musmodell av urologiska smärta är urinblåsan buk (UBD) ^10. I denna modell är tryckluft ett specifikt tryck som levereras till urinblåsan av en vaken eller lätt sövda djur under en viss tidsperiod. Under hela förfarandet, kablar i den överlägsna sneda magmusklerna rekord elektriska verkhet från muskeln (med en elektromyogram (EMG)). Denna aktivitet kallas visceromotor svar (VMR) och är pålitlig, reproducerbar mått på nociception ^10. Liknande ihålig orgel disten (t.ex. urinblåsa, ändtarm) hos friska frivilliga försökspersoner ger känslor av obehag och betydande ökningar av rapporterade smärta ^11,12, egenskaper som ofta används för att diagnostisera IC / BPS. Således, i samband med el, farmakologiska och optogenetic metoder för stimulering eller hämning, är UBD en användbar och giltig modell för att förstå både det perifera och centrala nervsystemet komponenter i urinblåsan nociception och smärta.

Här beskriver vi proceduren för UBD som för närvarande används i vårt laboratorium inom kvinnliga medlemmar av den gemensamma musstam, C57BL/6J. På grund av svårigheter i kateterisering processen av män, är detta förfarande utförs i honmöss. Detta protokoll har anpassats från den som utvecklats av Ness <em> et al. ¹⁰ och tidigare publicerade från vårt labb ^13. Följande protokoll beskriver fyra primära komponenterna i denna modell på sövda djur: (1) blåskateter och inspelningen elektroden kirurgi (2) partiell anestesi induktion (3) blåsdisten och VMR inspelning, och (4) dataanalys av råa VMR / EMG spår . Subtila skillnader i UBD-VMR förfarande på grund av valet av organism, anestesidjup och induktion, och kroppstemperatur diskuteras nedan.

Protocol

Följande protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Duquesne University och är i linje med riktlinjerna från National Institutes of Health.

1. Kirurgisk implantation av trådelektroder och urinblåsekateter Använda sterila tekniker (total tid 5-10 min)

1. Följande punkter bör vara beredd före start kirurgi:
   1. Aktivt övervaka och justera kroppstemperaturen till 37,5 ± 0,5 ° C med användning av övervakningssystemet temperatur med en batteridriven värmedyna och djurs kroppstemperatur sond (Materials List) Anslut automatiskt system till en låg wattal värmelampa för ytterligare kontroll av kroppstemperatur.
   2. Utrustning som behövs för isoflurananestesi innehåller tryckluft (t.ex. 100% O _2), isofluran Vaporizer, isofluran, isofluran induktionskammare (för initial knockdown), noskon och avgassystem.
   3. Montera the ordentliga kirurgiska instrument, IV kateter, och elektroder (Materials List)
2. Framkalla narkostillstånd i induktionskammare med 2-3% isofluran. Ta bort musen från kammaren när upprätningsreflex är förlorat (0-1 min).
3. Placera musen i noskon med 2-2,5% isofluran. Nyp tå till kontrollen för fullständig anestesi. Det bör inte finnas något svar från djuret. Starta timer.
4. Placera 1 droppe oftalmologiska salva på varje öga för mus.
5. Vänd musen över så ryggsidan är vänd nedåt.
6. För in katetern genom urinröret och in i urinblåsan.
7. Doppa kateter i kirurgiska glidmedel att smörja kateter.
   1. Försiktigt hålla urinrörets mynning med spetsiga pincett vinkelrätt mot djurets kropp. Innehav kateter med ^{2: a} uppsättningen av pincett, försiktigt in katetern ände i urinröret i en vinkel vinkelrätt mot djurets kropp.
   2. När katetern har gått in i urinröret ~ 1-2 mm, justera försiktigt katetern så att den nu parallellt med kroppensiktar mot huvudet. Denna rörelse är nödvändig för att undvika blygdbenet.
   3. Tryck försiktigt katetern mot musens kropp. Katetern bör glida in i kroppshåligheten smidigt och utan motstånd. Tvinga inte kateter. Om katetern inte kommer in smidigt, återgå till den vinkelräta kateterläge och börja om igen.
   4. Med katetern helt införd i urinblåsan, tryck försiktigt ner på musens mage att utvisa blåsan innehållet. Ta bort all urin från kateter genom att trycka på en liten bit hushållspapper i kateteröppningen. När pappershandduk är indränkt med urin, byt ut. Ta bort urin kontinuerligt under den återstående protokollet även under blåsdistenexperiment (se protokoll 3 nedan.)
8. Sätt i två silvertrådar i vänstra magmusklerna och en silvertråd i bröstet (som grund.)
   1. Använd alkohol eller jod för att desinficera området sidled till höger om kateter (djurets vänstra sidan av kroppen.)
   2. Exponera vänstra magmuskel.
      1. Håll huden nära vänstra magmuskel med pincett. Gör ett litet 1-2 cm snitt med medel kirurgisk sax.
      2. För in spetsen på saxen i snitt och försiktigt expandera snitt till 2 cm.
      3. Använd pincett för att flytta överliggande fascia att exponera överlägsna sneda magmuskel. Var noga med att inte klippa / rippa någon av de stora blodkärlen som finns i denna region.
   3. Böj tre silvertrådar i hälften. Använd vass 21 G nål för att ta en liten bit av muskeln. Därefter, tryck nålen genom muskeln. När du sätter i muskeln vara noga med att inte punktera några inre organ eller framkalla onödig skada på muskeln.
   4. Stick en fri ände av en silvertråd i öppningen av den 21 G nål. Dra försiktigt nålen tillbaka genom muskeln att dra silvertråd genom muskeln bettet. När nålen är fri från muskel, försiktigt dra silvertråd genom muskeln tills öglan i tråden är i jämnhöjd medmuskel bett.
   5. Upprepa steg 1.7.3-1.7.4 för andra muskeltråd. Denna tråd bör placeras ~ 0,5 cm från den första muskeltråden. Det är viktigt att de två ledningarna inte vidrör efter införing.
   6. Sätt in den tredje silvertråd (jord) i bröstet underlägsen till hjärtat.
      1. Använd vass 21 G nål för att ta en liten bit av huden (det är inte nödvändigt att göra ett snitt eller raka huden) och tryck nålen genom huden.
      2. Sätt i silvertråd enligt ovan och dra igenom huden.
9. Placera en liten mängd av 37,5 ° C steril mineralolja över de exponerade muskler för att hålla dem fuktiga och dra hud över så mycket utsatt muskel som möjligt.
10. Injicera 0,5 ml koksaltlösning subkutant för att bidra till att upprätthålla vätskenivåer under efterföljande steg.
11. Rulla försiktigt djur på sidan, så att kroppstemperaturen kan lätt underhållas.

2. Partiell Anestesi Step-down Procedure (total tid ~ 75 min)

Följande anestesi-protokollet har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Duquesne University och är i linje med riktlinjerna från National Institutes of Health.

1. Omedelbart efter avsnitt I (ovan) är klar, lägre isofluran till 1,5%. Håll på denna nivå i 15 min.
2. Lägre isofluran så att djuret är delvis sövd.
   1. Lägre isofluran med 0,125% var 15 min tills djur utställningar en böjning svar på tå nypa men inte artikulera eller på annat sätt röra sig.
   2. Normalt är en nivå på 0,8-1,0% isofluran optimal, men nivåerna kan variera beroende på skillnader i anestesi inställningar. Läte och / eller förflyttningar är extremt ovanliga händelser när bedövningen är på rätt nivå.

. 3 Elektromyogram (EMG) Inspelning Under Bladder buk med Graded påfrestningar (15-75 mmHg) (total tid - varierar beroende på experiment)

Setup följande för EMG inspelning och blåsdisten:

1. Setup en förstärkare, en digitaliserare, och inspelningsprogram. Med den här inställningen har digitaliserare en ingång till förstärkaren och två ingångar för tryckregulator (tryck och stimulans markör ingångar, se nedan avsnitt 3.1.2). Exakt inställning hårdvara och mjukvara är anpassningsbar (se Material lista för specifika instruktioner).
2. Setup ett system för att leverera specifika utbrott av lufttrycket till djur. Detta system kallas för "tidsinställd tryckregulator" i följande protokoll. Det möjliggör automatiserat tryckleverans inklusive digitalisering av lufttryck, kontroll av provlängd, inter-försöksintervallet automatisering, kontroll av provnummer och stimulans debut digital signal (se Anderson et al. ¹⁴ för schema över en tidsstyrd tryckregulator).

Anslut alla anslutningskablar från mus (2 buken trådar + 1 jordledning) till förstärkaren ochdigitizer och börja spela EMG-signalen i digitizer programvara. Notera vilken tid "Write" är valt i digitizer programvara.

Ta bort pappershandduk från blåskateter. Anslut katetern till luftslangen (från tidsinställd tryckregulator.)

Leverera en enda 20 sek rättegång vid 60 mmHg distentryck.

1. Ställ flödesregulator till 60 mmHg (check tryck med användning av en analog sphygmomanometer.)
2. Ställ in tidsinställda tryckregulator för att leverera en 20 sek förtryck intervall (detta kommer att vara 2V stimulanssignalen registreras i digitizer programvara) följt av en 20 sek tryckdistenpuls.
3. Starta rättegången (förtryck intervall + tryckdisten rättegång). När själva rättegången trycket börjar, dubbelkolla trycket med hjälp av de tre blodtrycksmätare som är anslutna till systemet.
4. Under trycket disten rättegången bör observeras en stark EMG-signal (> 0,5 V) under och eventuellt efter 20 sek disten. Djuret kan uppvisa abdominella rörelse men djuret ska inte artikulera eller på annat sätt röra sig. Även sällsynta, om onormala rörelser eller läten observeras, öka isofluran nivå.

Om 1 ^st 60 mm Hg disten producerar en lämplig EMG-signal, upprepa steg 3,4 ytterligare två gånger med en intertrial intervall på 1-2 minuter.

Vid mottagande av starka signaler från de tre 60 mmHg studier, utföra experimentella distentions.

1. Många studier använder graderade distensions början vid lågt tryck (10-15 mm Hg) och arbeta upp till skadliga tryck (75-80 mmHg) i steg om 10-15 mmHg. Se representativa resultat nedan till exempel spår vid olika tryck.
2. Typiska studier inkluderar en 20 sek förtryck intervall, en 20 sek tryckdisten rättegång, och en 1-2 min intertrial intervall.
3. Utför tre distentions vid varje tryck och därefter i genomsnitt över tre studier (för att erhålla en enda visceromotor respons för varje tryck). I en alternativ metod, s.erform fem distensions vid varje tryck, kasta de höga och låga rättegångar, och i genomsnitt sedan de återstående tre svar.

När försöks distensions är klar, stoppa inspelningen, spara experimentet filen, och offra djur med godkända metoder.

4. Analys av rå EMG Traces

1. Analys av visceromotor svar (dvs. EMG inspelningar) är lätt gjort med hjälp ombord digitizer programvara eller via en tredje part program (Materials List) Följande anvisningar är allmänna anvisningar som skulle kunna användas för att analysera dessa data med hjälp av flera olika program eller manuell analys .
2. För att exportera EMG, tryck och stimulans signaldata från digitizer programvara gör följande:
   1. Öppna experimentell fil.
   2. Klicka på "File", "Exportera som."
   3. Ändra filtyp till "kalkylblad text (. Txt)," namnge filen och klicka på "Spara".
   4. I pop-fönster, ändra utgångssamplingsfrekvens till "1000," ändra starttiden till insamlingen för tillfället uppgifter började och ändra sluttiden för att "Maxtid ()." Markera rutan märkning "tidsförskjutning utgång så första raden är en 0,0 sek, "och klicka på" OK. "
   5. Uppgifterna kommer nu att exporteras som en textfil som kan öppnas i en mängd olika program. Filen ska innehålla fyra kolumner (Timer, VMR (EMG), Pressure, Stimulus).
3. För varje försöksdjur testad, utföra följande matematiska operationer.
   1. Rätta EMG-signal för hela datauppsättningen genom beräkning av absolutvärdet för varje tidpunkt.
   2. Bestäm den genomsnittliga EMG-svar under bakgrundsavsnittet av experimentet.
   3. Subtrahera det genomsnittliga bakgrunds EMG svar från varje åtgärdas datapunkt i försöket att få den bakgrundskorrigerade datamängden.
   4. Bestäm arean under kurvan (AUC) för varje 20 sekunder företryckintervallet i bakgrunden korrigerade datamängden.
   5. Bestäm AUC för varje 20 sek tryck buk rättegång i bakgrunden korrigerade datamängden.
   6. Dela varje tryck buk rättegång AUC (som erhållits i steg 4.3.5) vid lägsta förtryck intervallet AUC från hela experimentet (som erhållits i steg 4.3.4.). Detta är den normaliserade och bakgrundskorrigerade AUC för varje hel tryckdisten rättegång.
4. För varje försöksdjur, till genomsnittliga flera normaliserade försök från ett enda tryck erhålla normaliserade VMR i volt * sek (Vsek).
5. Utför lämpliga statistiken på uppgifter beroende på experimentell design.

Representative Results

En illustration av den övergripande UBD-VMR konfiguration kan ses i figur 1A. Ökande trycksteg inducerar en ökning av rå VMR (dvs. EMG) (Figur 1B.) Rå VMR, tryck och stimulans markeringssignal som bör iakttas under inspelning med hjälp digitizer programvara kan ses i figur 2. Den översta kanalen ses i Figur 2 är ett EMG trace (i V). Bakgrundssignalen av EMG spår ska vara stadig och låg amplitud (<0,2 V). Om bakgrunden är hög eller innehåller sporadiska stora spikar (> 0,5 V) kablar och inställningar förstärkare kan behöva justeras. Under vissa omständigheter omslagstrådar (från mus till förstärkare och / eller förstärkare för att digitizer) i folie kan minska en del buller. Den mellersta kanalen i figur 2 visar den trycksignal som kvantifieras av den tidsinställda tryckregulatorn i mmHg. Notera att signalen debut är en kurva. Detta beror på att fullt uttänjning avblåsan är inte ögonblicklig. När trycksignalen når det högsta värdet för den rättegången (t.ex. 75 mmHg i figur 2), bör trycket ligga kvar på det maximala värdet. Vid vissa tillfällen, kan luft läcka ut från urinröret runt katetern. Detta händer oftast vid höga tryck (t.ex..> 60 mmHg), kan observeras av en förändring i amplituden av trycksignalen, och kan minskas genom att tillsätta en liten mängd kirurgiska smörjmedel runt urinrörets mynning. Den sista kanalen (nedre delen av figur 2) visar den stimulans markeringskanal. Stimulansmarkeringskanal visar två separata signaler. I början av förtryck intervallet finns en momentan 2 V signalmarkör. Denna signal kan användas för att automatisera dataanalysprocessen för ett givet experiment. Närmare bestämt kan man programmera ett analyssystem för att skanna igenom en datafil söker stimulans markörer som stiger över 1,5 V. Detta gör att analyssystem för att quickly hitta varje fullständig prövning. Den andra komponenten av den stimulans kanalen är en 1 V-signal som inträffar under hela tryckdisten försök. Återigen kan närvaron av denna andra signal användas för enkel dataanalys.

Representativa data från en enda försöksdjur kan ses i figur 3 och tabell 1 Djuret var utspänd tre gånger på var och en av följande tryck:. (. Figur 3A, Tabell 1) 15, 30, 45, 60 och 75 mm Hg Den tre distentions beräknas i medeltal och representeras som en enda datapunkt i diagrammet. Lägg märke till att de normaliserade signalen ökar gradvis med ökande blåsan distentryck. Efter denna inledande buk set, fick detta djur två ytterligare uppsättningar av graderade blåsdisten. Såsom kan ses i figur 3B, den andra och tredje uppsättningar av distentions producerade liknande VMRs (vid varje tryck.) Dessa tre uppsättningar av distentions förekom under en 2,5 h periOD demonstrera stabiliteten hos lagrings-inställning och reproducerbarheten hos UBD stimulus och VMR svar i ett enda djur. Viktigt är den långsiktiga stabiliteten hos denna prep uppstår endast när isoflurananestesi gradvis trappas ned under loppet av en timme. En kortare anestesi förfarandet kan leda till en progressiv förlust i UBD VMR-signalen med varje uppsättning distentions (opublicerade observationer, Sadler och Kolber.) En annan kritisk faktor för stabiliteten i UBD VMR-systemet är att upprätthålla en stabil kroppstemperatur. Såsom framgår av fig 4, den UBD VMR (som svar på 60 mmHg dilatation) är betydligt lägre vid 33,5 ° C kroppstemperatur jämfört med 37,5 ° C.

Figur 1. Visceromotor svar (VMR) från UBD. (A) Schematic av UBD setup. Komprimerad luft tillförs in i urinblåsan via urinrörskateter. Under distensions, elektroder i magmuskel rekord EMG. Under hela förfarandet, är temperaturen upprätthålls med hjälp av en batteridriven värmedyna och overhead lampa. (B) Exempel EMG spår under UBD. När trycket ökar, ökar eleffekt från magmusklerna kongruent.

Figur 2. Skärmdump visar data under UBD rättegång. Tre kanaler visas. Den övre kanalen visar den råa EMG spår (i V) Mitten kanalen visar trycket (i mm Hg) som levereras till urinblåsan. Den nedre kurvan visar den stimulans markeringskanal som indikerar starten av förtryck intervallet och hela tryckdisten rättegång. Bilden är en 40 sek fullständig prövning (20 sek förtryck intervall plus 20 sek tryckdisten rättegång.)

Figur 3. Representativa data som visar graderade VMR. (A) De normaliserade VMR ökar gradvis med ökande tryck (15-75 mm Hg) levereras till blåsan för musen. (B) Efterföljande uppsättningar av urinblåsan distentions (15-75 mmHg = 1 set) visar liknande VMRs jämfört med första uppsättningen distentions.

. Figur 4 Kroppstemperaturen minskar UBD VMR En minskning av kroppstemperatur från 37,5 ° C till 33,5 ° C, orsakar en betydande minskning i UBD VMR. (N = 6,. Parat t-test * p <0,05)

Tabell 1. Representativa data för en full uppsättning av distentions. Tabellen visar data inklusive tryck disten AUC, förtryck intervall AUC, bakgrundskorrigerad tryck disten AUC, och normaliserade tryckdisten AUC. För varje tryck, fick djuret tre disten prövningar. Genomsnittet av den normaliserade tryckdisten AUC vid varje tryck plottas i figur 3A.

Discussion

Hos människor, interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS) utgör ett betydande kliniskt problem eftersom patienterna har invalidiserande smärta som ofta inte svarar på vanlig smärtbehandling ^15. En av de stora utmaningarna i att förstå och slutligen behandling av kronisk smärta i urinblåsan är att förstå de normala neurala processer som är involverade i svaret på skadliga blåsdisten. För att övervinna denna utmaning krävs en djurmodell av smärtor i urinblåsan. Denna modell bör vara reproducerbar, stabil och lätt att mäta. Lyckligtvis Ness och kollegor ¹⁰ utvecklat ett system som kan användas för att undersöka de fysiologiska reaktioner på skadliga blåsdisten.

Systeminställning är enkelt och kan göras med hjälp av i första hand off-the-shelf hårdvara och mjukvara. Den stora anpassad utrustning inblandade i UBD VMR-systemet är den tidsinställd tryckregulator. Denna maskin ger en analog-Till-digital omvandling av lufttrycket och sänder stimulans debut markörer till digitaliseraren hårdvara. Användningen av den tidsinställda tryckregulatorn förenklar dataanalys genom att automatiskt synkronisera trycket stimulus med den inspelade EMG (dvs.. VMR) Detta är viktigt eftersom det VMR inte nödvändigtvis startar exakt när blåsan är första utspänd och VMR hävdas ofta för en kort period (<5 sek) efter utgången av den dilatation. Icke desto mindre, med noggrann synkronisering, kan man enkelt utföra det UBD VMR förfarandet med en on / off regulator för att styra disten på / av och en timer som är i synk med den inspelade EMG-signalen.

En stor fördel med den UBD VMR systemet för förfrågning nervsystemet roll i blåssmärta är att svar på graderade blåsdistentrycket falla utmed en standardkurva med ökande tryck som inducerar större VMRs. Detta gör det möjligt för forskare att enkelt avgöra om en experimentell manipulation orsakar en ökning eller minskning av VMR både ofarliga och giftiga blåsdistentryck. Dessutom är signalen från ett enda djur mycket stabil över tid så att flera omgångar av graderad disten kan göras (Figur 3B.) Detta gör det möjligt för forskare att få en baslinje UBD VMR och sedan manipulera djur (exempelvis leverera ett läkemedel) för inom individer matchande ^13. Forskare har använt UBD-VMR-systemet (i möss och råttor) för att spela in eller manipulera ryggmärgen dorsala horn nervceller ¹⁶ och andra nervceller i det centrala nervsystemet (t.ex. rostrala ventrala medulla ¹⁷ eller amygdala ^13,16.) Dessa studier och andra fortsätter att lägga till vår grundläggande vetenskapliga förståelsen av den roll som olika delar av nervsystemet i behandlingen av urinblåsan sinnesintryck och i slutändan ett subjektivt smärta kände från denna nociceptiv ingång. Medan UBD VMR systemet innehåller många experimentella fördelar denre finns vissa begränsningar i modellen. För det första, det är omöjligt medan visceral blåsdisten väcker subjektiva känslor av "smärta" hos människor att veta om buken EMG inspelningar i möss är verkligen representativt för smärta. Ändå är UBD VMR svar hämmas av vanliga smärtstillande medel som tyder på att VMR är en smärta-liknande svar. För det andra, i den nuvarande UBD-VMR systemet djuren bedövas under inspelning. Även en jämförelse av levande kontra sövda UBD VMR har validerat användningen av anestesi ^10, det finns möjliga okända effekter av isofluran på smärtliknande reaktioner. För det tredje, är den beskrivna protokollet inte en överlevnads operation så flera inspelningar av individuella möss över tid är inte möjligt. Ändå kommer användningen av UBD-VMR-modellen samt andra viscerala smärtsystem möjliggör en mer fullständig förståelse av visceral smärta och kommer att leda till nya terapeutiska möjligheter för patienter som lider av IC / BPS och andra viscerala smärttillstånd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared heating blanket and monitoring system	Kent Scientific	Right-Temp System	This system is set up to monitor two separate temperatures.  This should include the animal and the heating blanket.  In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp.  However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off.  Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment.
Isoflurane vaporizer	Draeger	Vapor 19.1	Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane.
Isoflurane	multiple sources	n/a
100% Oxygen air tank	multiple sources	n/a	For ventilation of animal
Air breathing grade	multiple sources	n/a	For bladder distention
24 G 0.56 in IV catheter	BD Biosciences	381411	For bladder catheterization
Surgilube (sterile)	Savage Laboratories	0281-0205-02	Any surgical grade lubricate would work fine.
Mineral oil (sterile)	multiple sources	n/a
Saline (sterile)	multiple sources	n/a
AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation	Warner Instruments	W4 64-1318	Any silver wire with these specifications will work.  Wire does not need to be "chlorinated."
Ophthalmic ointment	multiple sources	n/a
Small surgical scissors	multiple sources	n/a
Sharp forceps	multiple sources	n/a
21 G Needle	multiple sources	n/a
Grass amplifier P511 with 3-lead input cable	Grass Instruments	P511 (F-P5IC3/REV1)	This is the "amplifier" used in the protocol.  Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in.
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent)	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	This is the "digitizer" used in the protocol.  Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal.
CED Spike2 software	Cambridge Electronic Design	Spike 2	This is the the "digitizer software" used in the protocol.  Should be from same manufacturer as digitizer.  Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range.
Flow chart from air tank to bladder catheter	n/a	n/a	Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder:  Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector.  Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer.  Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing  to a 3rd y connector.  Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter.
Gilmont Flowmeter	Gilmont	GF8321-1401	Multiple brands of flowmeters will work.  For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter).  For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min).
4-way Gang valve	Elite		This is a specific piece of equipment.  The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures.  In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes.  Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg.
1/4 in Tubing	multiple sources	n/a
3/32 inch Tubing	multiple sources	n/a
"Y" connectors (1/4 and 3/32 in)	multiple sources	n/a
Sphygmomanometer	CVS		Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application.
Timed Pressure Regulator	custom		This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal.  However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch.   Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4).  In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis.
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments.