Summary
ما يقرب من 3-8 ملايين شخص في الولايات المتحدة يعانون من متلازمة ألم التهاب المثانة الخلالي / المثانة (IC / BPS)، وهي حالة تتميز المنهكة في جزء من آلام الحوض. من أجل دراسة المساهمات الجهاز العصبي إلى حالة، يتم استخدام نموذج الفسيولوجية للألم المثانة البولية في الفئران والجرذان.
Abstract
ما يقرب من 3-8 ملايين شخص في الولايات المتحدة يعانون من متلازمة التهاب المثانة / المثانة الخلالي ألم (IC / BPS)، وهي حالة تتميز المنهكة زيادة الإلحاح وتكرار التبول، وكذلك كثرة التبول اثناء الليل وآلام الحوض العامة، وخاصة عند ملء المثانة أو يفرغ. على الرغم من سنوات من البحث، وسبب IC / BPS لا يزال بعيد المنال واستراتيجيات العلاج غير قادرين على توفير الإغاثة الكامل للمرضى. من أجل دراسة المساهمات الجهاز العصبي إلى حالة، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لتقليد الألم والأعراض المرتبطة IC / BPS. واحدة من هذه نموذج الفئران هو البولية المثانة انتفاخ (UBD). في هذا النموذج، يتم تسليم الهواء المضغوط الضغط محددة إلى المثانة من حيوان تخدير طفيفة على مدى فترة معينة من الزمن. في جميع أنحاء الداخلي، والأسلاك في عضلات البطن المائلة العلوية تسجيل النشاط الكهربائي من العضلات. ويعرف هذا النشاط باعتبارها استجابة الحشوي الحركي (VMR) وأناسا مقياس موثوق بها وقابلة للتكرار من حس الألم. هنا، نحن تصف الخطوات اللازمة لتنفيذ هذه التقنية في الفئران بما في ذلك التلاعب الجراحية، وتسجيل الفسيولوجية، وتحليل البيانات. مع استخدام هذا النموذج، يمكن كشف التنسيق بين الخلايا العصبية الحسية الأولية والحبل الشوكي afferents الثانوية، والمناطق الجهاز العصبي المركزي العالي التي تشارك في آلام المثانة. ويمكن بعد هذه المعرفة العلوم الأساسية أن تترجم سريريا لعلاج المرضى الذين يعانون من IC / BPS.
Introduction
ويعرف الألم المزمن رسميا باسم الألم الذي يستمر لثلاثة أشهر تقريبا، أو لمدة أطول من شفاء الأنسجة الطبيعية الوقت 1. هذا النوع من الألم هو واحد من الأسباب الرئيسية أن الناس هي التي تحرك التماس العناية الطبية (2) ويمكن أن تصل تكلفتها 635 مليار دولار سنويا 3. تعتبر استراتيجيات الألم المزمن الحالي التأقلم القديمة؛ بعد عقود من التقدم الطبي، مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (العقاقير المضادة للالتهابات) والمواد الأفيونية لا تزال العلاجات الأولية التي يحددها الأطباء. ولكن هذه العلاجات تستهدف جميع أنواع مختلفة من الألم في نفس الطريق، وتوفير تأثيرات مسكنة في جميع أنحاء الجسم بدلا من التركيز تحديدا على سبب هذا الحادث الألم بالضبط. من أجل مساعدة أولئك الذين يعانون من أفضل الألم المزمن، يجب أن تحول الانتباه البحوث نحو المسببات والعلاج الألم محددة المحتملة المرتبطة الأسباب الأكثر شيوعا لآلام المزمنة. الهدف من هذا manuscriحزب العمال هو لوصف النموذج المستخدم لفهم أفضل لحالة تعرف باسم التهاب المثانة الخلالي / متلازمة المثانة المؤلمة (IC / BPS).
IC / BPS هو الشرط المنهكة التي تؤثر على الملايين من الناس، والنساء في المقام الأول فوق سن ال 40 4. ولا تعرف الاسباب الحقيقية لIC / BPS، ومع ذلك ارتبط انتشار لعلم الوراثة 5، والوجبات الغذائية محددة، ومستويات التوتر عالية 6 . وتشمل أعراض IC / BPS ولكن لا تقتصر على: زيادة الحاجة الملحة للتبول، زيادة تواتر التبول، وآلام، وثقب، أو حرق الألم أثناء ملء المثانة ويفرغ، وكثرة التبول اثناء الليل 7. مرضى الذين يعانون من هذه الظروف لديهم مستويات أعلى من التوتر والقلق هي أكثر 8. هذه النتائج زيادة التوتر في زيادة الألم، والذي يؤدي إلى زيادة مستويات التوتر الأصلي. وقد أظهرت الدراسات أن مستويات الاكتئاب والقلق تقلل العلاجات التالية التي تخفف الألم البولية، وبالتالي كسر هذه الدورة بفعالية إيجابية ردود الفعل من أجل دراسة المساهمات الجهاز العصبي إلى حالة، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لتقليد الألم والأعراض المرتبطة IC / BPS. تقليديا، وقد تم صوغه التهاب المثانة في الحيوانات مع إدخال المواد الكيميائية المختلفة مثل زيت الخردل، والأسيتون، عديد السكاريد الشحمي، وحامض الهيدروكلوريك، وسيكلوفوسفاميد في المثانة. ومع ذلك لا يوجد عملاء لجهات أجنبية موجودة في البول العقيمة من المرضى IC / BPS، وبالتالي التشكيك في صحة هذه النماذج. آخر نموذج الفئران من آلام المسالك البولية هو انتفاخ المثانة البولية (UBD) 10. في هذا النموذج، يتم تسليم الهواء المضغوط الضغط محددة إلى المثانة حيوان مستيقظا أو تخدير طفيفة على مدى فترة معينة من الزمن. في جميع أنحاء الداخلي، والأسلاك في عضلات البطن المائلة أكتيف الكهربائية سجل متفوقةإيتي من العضلات (مع مخطط كهربية العضل (EMG)). ويعرف هذا النشاط باعتبارها استجابة الحشوي الحركي (VMR) وغير موثوق بها، وقياس استنساخه من حس الألم 10. مماثلة جوفاء الجهاز انتفاخ (مثل المثانة والمستقيم) على متطوعين من البشر صحية تنتج مشاعر الانزعاج وزيادات كبيرة في الألم ذكرت 11،12، والصفات التي غالبا ما تستخدم لتشخيص IC / BPS. وبالتالي، بالتزامن مع أساليب الكهربائية، والدوائية، وoptogenetic من التحفيز أو التثبيط، UBD هو نموذج مفيدة وصالحة لفهم كل من مكونات الجهاز العصبي المحيطي والمركزي من حس الألم المثانة والألم. هنا، نحن تصف الإجراء لUBD كما يستخدم حاليا في المختبر لدينا في غضون عضوات من سلالة الماوس المشتركة، C57BL/6J. بسبب صعوبات في عملية قسطرة للذكور، ويتم تنفيذ هذا الإجراء في المقام الأول في إناث الفئران. وقد تم تكييف هذا البروتوكول من تلك التي وضعتها نيس <م> وآخرون 10. ونشرت سابقا من مختبرنا 13. يصف بروتوكول الأربعة التالية المكونات الأساسية لهذا النموذج في الحيوانات تخدير: (1) القسطرة وجراحة المثانة القطب تسجيل (2) تحريض التخدير الجزئي (3) انتفاخ المثانة وتسجيل VMR، و (4) تحليل البيانات الخام من آثار VMR / EMG . وتناقش الفروق الدقيقة في إجراء UBD-VMR بسبب اختيار الكائن الحي، وعمق التخدير والاستقراء، ودرجة حرارة الجسم أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول التالية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة دوكين ويتسق مع المبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.
1. زرع الجراحية من سلك كهربائي والمثانة البولية القسطرة باستخدام تقنيات العقيمة (الوقت الإجمالي 5-10 دقيقة)
- وينبغي إعداد العناصر التالية قبل الجراحة تبدأ:
- مراقبة الفعالة وضبط درجة حرارة الجسم إلى 37.5 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام نظام مراقبة درجة الحرارة مع وسادة التدفئة التي تعمل بالبطاريات والحيوان هيئة التحقيق في درجة الحرارة (قائمة المواد) ربط النظام الآلي لمصباح الحرارة المنخفضة القوة الكهربائية للسيطرة إضافية من درجة حرارة الجسم.
- المعدات اللازمة للتخدير isoflurane ويشمل الهواء المضغوط (على سبيل المثال 100٪ O 2)، المرذاذ isoflurane و، isoflurane و، غرفة تحريض isoflurane و(لضربة قاضية الأولي)، مخروط الأنف، ونظام العادم.
- التجمع اله الأدوات الجراحية المناسبة، والرابع القسطرة، والأقطاب الكهربائية (قائمة المواد)
- لحث الدولة التخدير في غرفة تحريض على 2-3٪ isoflurane و. إزالة الماوس من الغرفة عند فقدان المنعكس التقويمي (0-1 دقيقة).
- وضع الماوس في مخروط الأنف مع 2-2.5٪ isoflurane و. قرصة أخمص القدمين للتحقق من التخدير الكامل. ينبغي أن يكون هناك أي رد من الحيوان. بدء الموقت.
- وضع 1 قطرة من مرهم للعين على كل عين من الماوس.
- بدوره الماوس فوق ذلك الجانب الظهري لأسفل.
- إدراج القسطرة من خلال مجرى البول والمثانة في.
- تراجع القسطرة الجراحية في التشحيم لتليين القسطرة.
- عقد بلطف فتح مجرى البول مع ملقط وأشار عمودي على الجسم الحيوان. عقد القسطرة مع مجموعة الثانية 2 من الملقط، إدراج بلطف نهاية القسطرة في مجرى البول في زاوية عمودية على الجسم الحيوان.
- عندما ذهبت قسطرة في مجرى البول ~ 1-2 مم، وضبط بلطف القسطرة بحيث يتم الآن موازية للجسمتهدف نحو الرأس. هذه الحركة أمر ضروري لتجنب عظم العانة.
- دفع برفق القسطرة نحو جسم الفأر. القسطرة يجب أن ينزلق الى تجويف الجسم بسلاسة ودون مقاومة. لا قوة القسطرة. إذا لم تدخل القسطرة بسلاسة، والعودة إلى موقف القسطرة متعامدة والبدء من جديد.
- مع القسطرة إدراجها بالكامل في المثانة، ودفع برفق على البطن الماوس لطرد محتويات المثانة. إزالة كل البول من القسطرة عن طريق دفع قطعة صغيرة من منشفة ورقية في افتتاح القسطرة. عندما يتم استيعابه منشفة ورقية مع البول، ويحل محل. إزالة البول باستمرار طوال البروتوكول المتبقية بما في ذلك خلال التجارب المثانة انتفاخ (انظر البروتوكول 3 أدناه).
- إدراج اثنين من الأسلاك الفضية في عضلات البطن وترك سلك فضية واحدة في الصدر (كما في الأرض.)
- استخدام الكحول أو اليود لتطهير منطقة الجانبي على يمين القسطرة (الجانب الأيسر من الحيوان الجسم.)
- تعرض عضلات البطن اليسرى.
- عقد الجلد بالقرب ترك عضلات البطن بالملقط. جعل 1-2 سم شق صغير مع مقص جراحي المتوسط.
- إدراج غيض من مقص في شق وتوسيع شق بلطف إلى 2 سم.
- استخدام ملقط لتحريك اللفافة المغطي لفضح عضلات البطن المائلة العلوية. يجب الحرص على عدم قطع / مزق أي من الأوعية الدموية الرئيسية التي تقع في هذه المنطقة.
- ينحني ثلاثة أسلاك الفضة في النصف. استخدام إبرة حادة 21 G لاتخاذ لدغة صغيرة من العضلات. ثم، ودفع الإبرة من خلال العضلات. عند إدراج في العضلات يجب الحرص على عدم ثقب أي الأعضاء الداخلية أو حث الضرر لا لزوم لها إلى العضلات.
- عصا نهاية خالية من الأسلاك الفضية واحد في افتتاح إبرة G 21. برفق الإبرة مرة أخرى من خلال العضلات لرسم سلك الفضة عن طريق لدغة العضلات. عندما إبرة خالية من العضلات، وسحب بلطف الأسلاك الفضية من خلال العضلات حتى في حلقة السلك هو مطاردة معلدغة العضلات.
- كرر الخطوات 1.7.3-1.7.4 للسلك الثاني العضلات. يجب وضع هذا السلك ~ 0.5 سم من السلك الأول العضلات. من المهم أن السلكين لا تلمس بعد الإدراج.
- إدراج سلك الفضة الثالث (الأرض) في الصدر أقل شأنا من القلب.
- استخدام إبرة حادة 21 G لاتخاذ لدغة صغيرة من الجلد (أنه ليس من الضروري إجراء شق أو حلاقة الجلد)، ودفع الإبرة من خلال الجلد.
- إدراج الأسلاك الفضية كما هو موضح أعلاه والجذب من خلال الجلد.
- وضع كمية صغيرة من 37.5 درجة مئوية الزيوت المعدنية المعقمة على العضلات تتعرض لإبقائها رطبة وسحب الجلد فوق العضلات كما يتعرض أقصى حد ممكن.
- حقن 0.5 مل تحت الجلد المالحة للمساعدة في الحفاظ على مستويات السوائل أثناء الخطوات اللاحقة.
- لفة بلطف الحيوان على الجانب بحيث درجة حرارة الجسم يمكن الحفاظ بسهولة.
2. الجزئي التخدير الإجراءات تنحى (توتةل الوقت ~ 75 دقيقة)
تمت الموافقة على بروتوكول التخدير التالية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة دوكين ويتسق مع المبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.
- مباشرة بعد القسم الأول (أعلاه) كاملة، وانخفاض isoflurane وإلى 1.5٪. عقد على هذا المستوى لمدة 15 دقيقة.
- انخفاض isoflurane ومثل هذا الحيوان هو تخدير جزئي.
- isoflurane وأقل بنسبة 0.125٪ كل 15 دقيقة حتى المعروضات الحيوانية استجابة انثناء إلى أخمص قدميه قرصة لكن لا نطق أو غير ذلك التحرك.
- عادة، وهو مستوى 0.8-1.0٪ isoflurane وهو الأمثل، ولكن يمكن أن تختلف مستويات بسبب الاختلافات في الاجهزة التخدير. النطق و / أو التمشي هي أحداث نادرة للغاية عندما التخدير هو في المستوى المناسب.
3 مخطط كهربية العضل (EMG) تسجيل خلال المثانة انتفاخ مع الضغوط مدرج (15-75 ملم زئبقي) (الوقت الإجمالي - متغير اعتمادا على التجربة)
- الإعداد مكبر للصوت، والتحويل الرقمي، وبرنامج تسجيل. في هذا الإعداد، والتحويل الرقمي لديها واحد من إدخال لمكبر للصوت واثنين من المدخلات لمنظم الضغط (ضغط والمدخلات التحفيز علامة، انظر أدناه القسم 3.1.2). بالضبط الأجهزة والبرمجيات الإعداد للتخصيص (انظر قائمة المواد للحصول على تعليمات محددة).
- إعداد نظام لتقديم رشقات نارية محددة من ضغط الهواء إلى الحيوان. ويشار إلى هذا النظام باسم "منظم ضغط موقوتة" في البروتوكول التالي. لأنها تتيح للتسليم الآلي بما في ذلك الضغط رقمنة ضغط الهواء، والسيطرة على طول المحاكمة، والتشغيل الآلي الفاصل بين المحاكمة، والسيطرة على عدد المحاكمة، والتحفيز إشارة رقمية بداية (انظر أندرسون وآخرون 14 لالتخطيطي من منظم الضغط في الوقت المناسب).
- ضبط منظم تدفق إلى 60 مم زئبق (ضغط الاختيار باستخدام مقياس ضغط الدم التناظرية.)
- ضبط منظم ضغط الوقت المناسب لتقديم فاصل prepressure 20 ثانية (وهذا سيكون إشارة التحفيز 2V سجلت في برنامج التحويل الرقمي) تليها 20 ثانية ضغط انتفاخ النبض.
- بدء محاكمة (فاصل prepressure + ضغط انتفاخ المحاكمة). عندما تبدأ المحاكمة الفعلية الضغط، مضاعفة فحص الضغط باستخدام مقاييس ضغط الدم 3 متصلا النظام.
- أثناء المحاكمة ضغط انتفاخ، ينبغي مراعاتها إشارة EMG قوية (> 0.5 V) خلال وربما بعد 20 ثانية انتفاخ. قد يحمل هذا الحيوان abdomiحركة نال ولكن الحيوان لا ينبغي أن نطق أو غير ذلك التحرك. على الرغم من نادرة، إذا لوحظت تحركات غير طبيعية أو الالفاظ، وزيادة مستوى isoflurane و.
- العديد من الدراسات استخدام الإنتفاخات متدرج بدءا من ضغط منخفض (10-15 ملم زئبقي) ويعمل ما يصل الى الضغوط الضارة (75-80 ملم زئبقي) في 10-15 زيادات مم زئبق. رؤية النتائج ممثل أدناه على سبيل المثال آثار في الضغوط المختلفة.
- وتشمل التجارب النموذجية فاصل زمني 20 ثانية prepressure، 20 ثانية ضغط انتفاخ المحاكمة، وفاصل intertrial 1-2 دقيقة.
- تنفيذ ثلاث distentions في كل ضغط ثم المتوسط عبر المحاكمات الثلاث (للحصول على استجابة الحشوي الحركي واحد لكل الضغط). في طريقة بديلة، صerform خمسة الإنتفاخات في كل ضغط، ونبذ المحاكمات العالية والمنخفضة، ومن ثم متوسط الاستجابات الثلاث المتبقية.
4. تحليل آثار EMG الخام
- تتم تحليل استجابات الحشوي الحركي (أي تسجيلات EMG) بسهولة باستخدام برنامج التحويل الرقمي على متن الطائرة أو من خلال برنامج من طرف ثالث (قائمة المواد) الإرشادات التالية هي الإرشادات العامة التي يمكن استخدامها لتحليل هذه البيانات باستخدام برامج متعددة أو باستخدام التحليل اليدوي .
- لتصدير EMG، والضغط، والبيانات إشارة التحفيز من برامج التحويل الرقمي قم بما يلي:
- فتح ملف التجريبية.
- انقر فوق "ملف" "تصدير باسم".
- تغيير نوع الملف إلى "نص جدول (. TXT)،" اسم الملف ثم انقر فوق "حفظ".
- في بونافذة ف تصل، تغيير معدل العينة الإخراج إلى "1000،" تغيير وقت البدء في جمع البيانات وتغيير اللحظة التي بدأت نهاية الوقت الى "MaxTime ()." حدد خانة وسم "وقت الإخراج تحول ذلك الخط الأول هو 0.0 ثانية، "وانقر على زر" موافق ".
- سيتم الآن تصدير البيانات كملف نصي يمكن فتحه في مجموعة متنوعة من البرامج. يجب أن يحتوي ملف أربعة أعمدة (مؤقت، VMR (EMG)، الضغط، التحفيز).
- لكل حيوان التجريبية اختبار، تنفيذ العمليات الحسابية التالية.
- تصحيح إشارة EMG لمجموعة البيانات بالكامل عن طريق حساب القيمة المطلقة من كل نقطة زمنية.
- تحديد الاستجابة المتوسط EMG خلال القسم خلفية التجربة.
- طرح هذا المتوسط EMG خلفية استجابة من كل نقطة بيانات مصححة في التجربة للحصول على خلفية تصحيح مجموعة البيانات.
- تحديد المنطقة تحت المنحنى (AUC) لكل 20 ثانية قبلفاصل الضغط في الخلفية تصحيح مجموعة البيانات.
- تحديد AUC لكل 20 ثانية المحاكمة ضغط انتفاخ في الخلفية تصحيح مجموعة البيانات.
- تقسيم كل AUC محاكمة ضغط انتفاخ (حصلت عليه في الخطوة 4.3.5) من أدنى prepressure الفاصل AUC من التجربة برمتها (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.4). هذا هو AUC تطبيع وتصحيح الخلفية لكل محاكمة كاملة ضغط انتفاخ.
- لكل حيوان التجريبية، متوسط المحاكمات تطبيع متعددة من ضغط واحدة للحصول على VMR تطبيع في فولت * ثانية (Vsec).
- إجراء الإحصاءات المناسبة على البيانات اعتمادا على التصميم التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن رؤية مثال على مجمل الإعداد UBD-VMR في الشكل 1A. زيادة الضغط خطوات لحث زيادة في VMR الخام (أي EMG) (الشكل 1B). وVMR الخام والضغط والتحفيز إشارة علامة التي ينبغي مراعاتها أثناء التسجيل باستخدام برنامج التحويل الرقمي يمكن أن ينظر في الشكل 2. القناة أعلى ينظر في الرقم 2 هو تتبع EMG (في V). وينبغي أن يكون إشارة خلفية التتبع EMG ثابت والسعة منخفضة (<0.2 V). إذا خلفية عالية أو تحتوي على طفرات كبيرة متفرقة (> 0.5 V) قد تحتاج إلى تعديل إعدادات الأسلاك ومكبر للصوت. في بعض الظروف التفاف الأسلاك (من الفأر إلى مكبر للصوت و / أو مكبر للصوت لمحول الأرقام) في احباط يمكن أن تقلل من بعض الضوضاء. القناة الوسطى في الشكل 2 يوضح إشارة الضغط كما كميا من قبل منظم ضغط موقوتة في مم زئبق. لاحظ أن ظهور إشارة منحنى. يحدث هذا بسبب انتفاخ الكامل للالمثانة ليست لحظية. مرة واحدة في إشارة ضغط يصل الحد الأقصى لقيمة تلك المحاكمة (مثلا 75 ملم زئبقي في الشكل 2)، وينبغي أن يظل الضغط في ذلك القيمة القصوى. في بعض الأحيان، يمكن أن الهواء يتسرب من مجرى البول حول القسطرة. يحدث هذا في أغلب الأحيان في الضغوط العالية (على سبيل المثال.> 60 مم زئبق)، ويمكن ملاحظة حدوث تغيير في السعة للإشارة الضغط، ويمكن تخفيض بإضافة كمية صغيرة من الشحم الجراحية حول فتحة مجرى البول. القناة النهائي (الجزء السفلي من الشكل 2) يبين قناة علامة التحفيز. القناة علامة التحفيز يظهر إشارتين منفصلة. في بداية الفاصل prepressure هناك لحظة 2 V إشارة علامة. هذه الإشارة يمكن أن تستخدم لأتمتة عملية تحليل البيانات لإجراء تجربة معينة. على وجه التحديد، يمكن للمرء أن برنامج نظام تحليل البيانات لفحص من خلال ملف بيانات يبحث عن علامات الحوافز التي ترتفع فوق 1.5 V. وهذا يسمح للنظام تحليل البيانات لوجه السرعهذ تجد كل محاكمة كاملة. المكون الثاني للقناة التحفيز هو إشارة 1 V التي تحدث أثناء المحاكمة بأكملها ضغط انتفاخ. مرة أخرى، فإن وجود هذه الإشارة الثانية يمكن استخدامها لتحليل البيانات سهلا.
ويمكن رؤية بيانات تمثيلية من حيوانات التجارب واحد في الشكل 3 والجدول 1 وكان الحيوان منتفخة ثلاث مرات في كل من ضغط التالية: (الشكل 3A؛ الجدول 1) 15، 30، 45، 60، و 75 ملم زئبقي و وبلغ متوسط ثلاثة distentions وممثلة على النحو نقطة بيانات واحدة في الرسم البياني. تلاحظ أن الزيادات إشارة تطبيع تدريجيا مع زيادة الضغوط انتفاخ المثانة. بعد هذه المجموعة انتفاخ الأولية، تلقى هذا الحيوان مجموعتين إضافية من متدرج انتفاخ المثانة. كما رأينا في الشكل 3B، مجموعات الثانية والثالثة من distentions أنتجت VMRs مماثلة (في كل ضغط.) هذه ثلاث مجموعات من distentions حدثت خلال 2.5 شبه ساعةالتطوير التنظيمي مما يدل على استقرار الإعداد تسجيل واستنساخ من التحفيز والاستجابة UBD VMR في حيوان واحد. الأهم من ذلك أن الاستقرار على المدى الطويل من هذه الإعدادية يحدث فقط عندما يكون التخدير isoflurane وصعدت إلى أسفل تدريجيا على مدى 1 ساعة. يمكن أن يؤدي إجراء التخدير أقصر إلى الفقدان التدريجي في إشارة UBD VMR مع كل مجموعة من distentions (الملاحظات غير منشورة، سادلر وكولبر.) وثمة عامل آخر حاسم في استقرار النظام UBD VMR هو الحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة. كما رأينا في الشكل 4، وUBD VMR (ردا على 60 ملم زئبقي انتفاخ) هو أقل من ذلك بكثير في 33.5 درجة مئوية درجة حرارة الجسم بالمقارنة مع 37.5 درجة مئوية.
الشكل 1. ردود حركي حشوي (VMR) من UBD. (A) Schematiج من الإعداد UBD. يتم تسليم الهواء المضغوط إلى المثانة عن طريق مجرى البول القسطرة. خلال الإنتفاخات، الأقطاب الكهربائية في سجل عضلات البطن EMG. في جميع أنحاء الإجراء بأكمله، والحفاظ على درجة حرارة باستخدام وسادة التدفئة التي تعمل بالبطاريات ومصباح في سماء المنطقة. (ب) مثال EMG يتتبع خلال UBD. كما يزيد من الضغط، خرج الكهربائية من عضلات البطن يزيد بشكل متطابق.
النار الشكل 2. الشاشة تظهر البيانات أثناء UBD المحاكمة. يتم عرض ثلاث قنوات. القناة الأعلى يظهر أثر EMG الخام (في خامسا) يبين قناة منتصف الضغط (في مم زئبق) التي يتم تسليمها إلى المثانة. يظهر التتبع أسفل القناة علامة التحفيز الذي يشير إلى بداية الفاصل prepressure وكامل محاكمة ضغط انتفاخ. الصورة هي للمحاكمة كاملة 40 ثانية (2 فاصل prepressure 0 ثانية بالإضافة إلى 20 ثانية ضغط انتفاخ المحاكمة.)
الشكل 3. الممثل تظهر البيانات متدرج VMR. (A) ويزيد تدريجيا مع VMR تطبيع ضغط متزايد (15-75 ملم زئبقي) تسليمها إلى المثانة من الفأرة. (ب) مجموعات لاحقة من distentions المثانة (15-75 ملم زئبقي = مجموعة 1) تظهر VMRs مماثلة بالمقارنة مع المجموعة الأولى من distentions.
الشكل 4 درجة حرارة الجسم تنخفض UBD VMR انخفاض في درجة حرارة الجسم من 37.5 درجة مئوية إلى 33.5 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض كبير في UBD VMR. (ن = 6؛ إقران اختبار t * P <0.05)
ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الجدول 1. بيانات الممثل لمجموعة كاملة من distentions. ويبين الجدول البيانات بما في ذلك الضغط انتفاخ AUC، prepressure الفاصل AUC، AUC خلفية تصحيح ضغط انتفاخ، وتطبيع ضغط انتفاخ الجامعة الأمريكية بالقاهرة. لكل الضغوط، تلقى الحيوان ثلاث محاكمات انتفاخ. يتم رسم متوسط تطبيع ضغط انتفاخ AUC في كل الضغط في الشكل 3A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في البشر، والخلالي متلازمة الألم التهاب المثانة / المثانة (IC / BPS) يمثل مشكلة سريرية هامة لأن المرضى قد المنهكة الألم الذي هو في كثير من الأحيان لا تستجيب للعلاج الألم العادية 15. واحدة من التحديات الرئيسية في فهم وعلاج الألم في نهاية المطاف المثانة المزمن هو فهم العمليات العصبية العادية التي تشارك في الاستجابة لانتفاخ المثانة الضارة. من أجل التغلب على هذا التحدي، نموذج حيواني من آلام المثانة هو ضروري. وينبغي أن يكون هذا النموذج استنساخه، ومستقرة، وسهولة قياس. لحسن الحظ، وضعت نيس وزملاؤه 10 نظام التي يمكن استخدامها للتحقيق في الاستجابات الفسيولوجية الضارة لانتفاخ المثانة.
إعداد النظام واضح وصريح ويمكن أن يتم ذلك باستخدام قبالة الجاهزة للاستخدام في المقام الأول الأجهزة والبرمجيات. قطعة مخصصة الرئيسي للمعدات المشاركين في نظام UBD VMR هو منظم الضغط في الوقت المناسب. يوفر هذا الجهاز تناظريةإلى الرقمية تحويل الضغط الجوي ويرسل علامات ظهور التحفيز إلى الأجهزة التحويل الرقمي. استخدام منظم ضغط توقيت يبسط إلى حد كبير تحليل البيانات عن طريق المزامنة التحفيز الضغط مع EMG المسجلة (أي. VMR) تلقائيا وهذا أمر مهم لأن VMR لا يبدأ بالضرورة على وجه التحديد عندما المثانة هي منتفخة الأولى وغالبا ما يتم الحفاظ على VMR ل فترة قصيرة (<5 ثانية) بعد نهاية انتفاخ. ومع ذلك، مع تزامن دقيق، واحدة يمكن أن تؤدي بسهولة الإجراء UBD VMR مع منظم على / قبالة السيطرة على انتفاخ تشغيل / إيقاف مؤقت والذي هو في تزامن مع إشارة EMG المسجلة.
والميزة الرئيسية لنظام UBD VMR لاستجواب دور الجهاز العصبي في آلام المثانة هو أن الردود على المثانة انتفاخ متدرج الضغوط تقع على طول منحنى القياسية مع تزايد الضغوط حمل VMRs أكبر. وهذا يسمح للباحث لتحديد بسهولة إذا رجل التجريبيةيسبب ipulation زيادة أو نقصان في VMR في الضغوط المثانة انتفاخ كلا حميدة والضارة. بالإضافة إلى ذلك، الإشارة من حيوان واحد هو مستقر جدا عبر الزمن بحيث جولات متعددة من انتفاخ متدرج يمكن القيام به (الشكل 3B) وهذا يسمح للباحثين للحصول على خط الأساس UBD VMR ثم التلاعب الحيوان (مثل تسليم المخدرات) ل في موضوع مطابقة-13. وقد استخدم الباحثون نظام UBD-VMR (في الفئران والجرذان) لتسجيل أو التلاعب الشوكي الخلايا العصبية الحبل الظهري القرن 16 والخلايا العصبية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي (مثل منقاري بطني النخاع 17 أو اللوزة 13،16). مواصلة هذه الدراسات وغيرها إضافة إلى فهمنا العلمية الأساسية لدور مختلف مكونات الجهاز العصبي في تجهيز المثانة المدخلات الحسية والألم في نهاية المطاف ذاتية شعرت من هذه المدخلات مسبب للألم. في حين أن النظام UBD VMR يتضمن العديد من المزايا التجريبيةإعادة بعض القيود لهذا النموذج. الأولى، في حين الحشوية المثانة انتفاخ تثير مشاعر ذاتية من "الألم" في البشر فمن المستحيل معرفة ما إذا تسجيلات EMG البطن في الفئران تمثل حقا من الألم. على الرغم من ذلك، يتم تثبيط الاستجابات UBD VMR بواسطة المسكنات شيوعا مما يدل على أن VMR هو استجابة مثل الألم. الثانية، في النظام UBD-VMR الحاضر، يتم تخدير الحيوانات أثناء التسجيل. على الرغم من أن المقارنة بين العيش مقابل تخدير UBD VMR تمت المصادقة على استخدام التخدير 10، وهناك آثار غير معروفة ممكن من isoflurane والردود على مثل الألم. الثالث، بروتوكول صفها ليست عملية جراحية بقاء حتى تسجيلات متعددة من الفئران الفردية على مر الزمن ليست ممكنة. ومع ذلك، فإن استخدام نموذج UBD-VMR وكذلك نظم الألم الحشوية تسمح لفهم أكثر اكتمالا من الألم الحشوي وسوف تؤدي إلى سبل علاجية جديدة للمرضى الذين يعانون من IC / BPS وغيرها من الشروط الألم الحشوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف الدكاترة. روبرت Gereau، هنري لاي، ولارا من الفخار للحصول على مساعدة مفيدة في إعداد هذا النظام. نود أيضا أن نعترف مصادر التمويل لهذا العمل (بيشكتاش - الجمعية الدولية لدراسة الألم في وقت مبكر الوظيفي بحوث غرانت من المسح الضوئي | مؤسسة تصميم إنجر وJENS بروون وصندوق المرض اللعين Hunkele جامعة دوكين).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
