Summary
Ongeveer 3-8.000.000 mensen in de Verenigde Staten heeft last van interstitiële cystitis / pijn in de blaas syndroom (IC / BPS), een invaliderende aandoening die gekenmerkt wordt voor een deel door bekkenpijn. Om zenuwstelsel bijdragen aan de toestand te bestuderen, is een fysiologisch model urineblaas pijn in muizen en ratten.
Abstract
Ongeveer 3-8.000.000 mensen in de Verenigde Staten lijden aan interstitiële cystitis / blaas pijn syndroom (IC / BPS), een invaliderende aandoening gekenmerkt door verhoogde urgentie en frequentie van urineren, en nocturie en algemene bekkenpijn, vooral bij blaasvulling of plassen. Ondanks jaren van onderzoek, de oorzaak van IC / BPS blijft ongrijpbaar en behandelingsstrategieën zijn niet in staat om een volledige verlichting te bieden aan patiënten. Om zenuwstelsel bijdragen aan de toestand te bestuderen, hebben vele diermodellen ontwikkeld om de pijn en symptomen geassocieerd met IC / BPS nabootsen. Een dergelijk muizenmodel is urineblaas uitzetting (UBD). In dit model wordt perslucht van een specifieke druk geleverd aan de blaas van een licht verdoofd dier gedurende een bepaalde periode. Gedurende de procedure draden in de superieure schuine buikspieren elektrische activiteit van de spier. Deze activiteit is bekend als de visceromotorische respons (VMR) en isa betrouwbare en reproduceerbare meting van nociceptie. Hier beschrijven we de stappen die nodig zijn om deze techniek uit te voeren in muizen, waaronder chirurgische manipulaties, fysiologische opname en data-analyse. Met het gebruik van dit model, kan de coördinatie tussen primaire sensorische neuronen, ruggenmerg secundaire afferenten en hogere centrale zenuwstelsel die betrokken zijn bij pijn in de blaas worden ontrafeld. Deze fundamentele wetenschap kennis kan vervolgens klinisch worden vertaald naar patiënten die lijden aan IC / BPS behandelen.
Introduction
Chronische pijn wordt officieel gedefinieerd als pijn die houdt ongeveer drie maanden, of langer dan de normale weefsel genezing tijd 1. Dit type van pijn is een van de belangrijkste redenen dat mensen gedreven worden om medische hulp te zoeken 2 en kan oplopen tot $ 635.000.000.000 dollar per jaar 3. Huidige chronische pijn coping-strategieën zijn archaïsch beschouwd; na decennia van medische vooruitgang, NSAID's (niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen) en opioïden zijn nog steeds de door artsen voorgeschreven primaire behandelingen. Deze behandelingen gericht maar alle verschillende soorten pijn op dezelfde wijze verschaffen analgetische effecten over het lichaam, in tegenstelling tot specifiek gericht op de oorzaak van dat exacte pijn incident. Om beter te kunnen helpen die lijden aan chronische pijn, moet het onderzoek aandacht worden verlegd naar de etiologie en de mogelijke pijn-specifieke behandelingen in verband met de meest voorkomende oorzaken van chronische pijn. Het doel van dit manuscript is om een model dat wordt gebruikt om beter te begrijpen een aandoening die bekend staat als de Tussenliggende / Pijnlijke blaas syndroom (IC / BPS) te beschrijven.
IC / BPS is een invaliderende aandoening die miljoenen mensen, vooral vrouwen boven de leeftijd van 40 4 beïnvloedt. De exacte oorzaken van IC / BPS zijn niet bekend, maar de prevalentie is gekoppeld aan genetica 5, specifieke diëten en hoge stress niveaus 6 . Symptomen van IC / BPS omvatten, maar zijn niet beperkt tot: verhoogde urgentie om te urineren, verhoogde frequentie van het plassen, pijn, piercing, of brandende pijn tijdens het vullen van de blaas en de lediging en nocturia 7. Patiënten die deze aandoeningen ervaren hebben meer stress en zijn meer angstig 8. Deze verhoogde stress resulteert in een toename van pijn, waarbij de oorspronkelijke stress verhoogt. Studies hebben aangetoond dat depressie en angst niveaus dalen volgende behandelingen die urine pijn te verlichten, dus effectief deze positieve feedback cyclus breken Om zenuwstelsel bijdragen aan de toestand te bestuderen, hebben vele diermodellen ontwikkeld om de pijn en symptomen geassocieerd met IC / BPS nabootsen. Traditioneel is cystitis is opnieuw bij dieren met de introductie van diverse chemicaliën zoals mosterdolie, aceton, lipopolysaccharide, zoutzuur en cyclofosfamide in de blaas. Er is echter geen buitenlandse agenten aanwezig zijn in de steriele urine van IC / BPS-patiënten, waardoor de validiteit van deze modellen ondervraging. Een andere muizenmodel van urologische pijn is urineblaas uitzetting (UBD) 10. In dit model wordt perslucht van een specifieke druk geleverd aan de blaas van een wakkere of licht verdoofd dier gedurende een bepaalde periode. Tijdens de gehele procedure, draden in de superieure schuine buikspieren opnemen elektrische activheid van de spier (een elektromyogram (EMG)). Deze activiteit is bekend als de visceromotorische respons (VMR) en betrouwbaar, reproduceerbaar maat nociceptie 10. Soortgelijke hol orgaan uitzetting (bijvoorbeeld blaas, rectum) bij gezonde vrijwilligers veroorzaakt gevoel van ongemak en significante verhogingen van pijn gerapporteerd 11,12, eigenschappen die vaak worden gebruikt om IC / BPS diagnose. Dus in samenhang met elektrische, farmacologische en optogenetic werkwijzen stimulatie of remming, UBD is een nuttig en geldig model voor het begrijpen van zowel perifere als centrale zenuwstelsel onderdelen blaas nociceptie en pijn. Hier beschrijven we de procedure voor de UBD als wordt momenteel gebruikt in ons laboratorium binnen vrouwelijke leden van de gemeenschappelijke muizenstam, C57BL/6J. Vanwege moeilijkheden bij de katheterisatie proces mannetjes, wordt deze procedure hoofdzakelijk uitgevoerd bij vrouwelijke muizen. Dit protocol is een aangepaste versie van die ontwikkeld door Ness <em> et al.. 10 en eerder gepubliceerde uit ons lab 13. Het volgende protocol beschrijft vier primaire componenten van dit model in verdoofde dieren: (1) blaaskatheter en registratie-elektrode chirurgie (2) gedeeltelijke verdoving inductie (3) blaas uitzetting en VMR opnemen, en (4) data-analyse van rauwe VMR / EMG sporen . Subtiele verschillen in de UBD-VMR procedure door de keuze van het organisme, anesthesie diepte en inductie en lichaamstemperatuur worden hieronder besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de Duquesne Universiteit en is in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health.
1. Chirurgische Implantatie van Draadelektroden en Urineblaas Catheter met steriele technieken (totale tijd 5-10 min)
- De volgende items moeten worden voorbereid voor het starten van de operatie:
- Actief te monitoren en aan te passen lichaamstemperatuur tot 37,5 ± 0,5 ° C met behulp van temperatuur monitoring systeem met een batterij-aangedreven verwarming pad en dierlijk lichaam temperatuursensor (Materials List) Sluit automatisch systeem een laag wattage warmtelamp voor extra controle van de lichaamstemperatuur.
- Apparatuur die nodig is voor isofluraananesthesie omvat perslucht (bijv. 100% O 2), isofluraan vaporizer, isofluraan, isofluraan inductie kamer (voor de eerste knock-down), neuskegel, en het uitlaatsysteem.
- Monteer the juiste chirurgische instrumenten, IV katheter, en elektroden (Materials List)
- Induceren verdoving staat in inductie kamer bij 2-3% isofluraan. Verwijder de muis uit zijn ondergebracht als oprichtreflex verloren (0-1 min).
- Plaats de muis in de neuskegel met 2-2,5% isofluraan. Knijpen teen te controleren op volledige narcose. Er mag geen reactie van het dier. Start timer.
- Breng 1 druppel ofthalmische zalf elk oog van de muis.
- Draai de muis over dus dorsale zijde naar beneden is gericht.
- Steek katheter via de plasbuis en in de blaas.
- Dompel katheter in chirurgische glijmiddel om katheter te smeren.
- Voorzichtig Houd urethrale opening met spitse tang loodrecht op het lichaam dier. Houden katheter met de 2 e set van tang, breng dan katheter uiteinde in urethra onder een hoek loodrecht op het lichaam dier.
- Wanneer katheter gestoken in urethra ~ 1-2 mm, zacht passen katheter zodat het nu parallel aan het lichaamhet streven naar het hoofd. Deze beweging is noodzakelijk om het schaambeen voorkomen.
- Duw voorzichtig katheter naar het lichaam van de muis. De katheter schuiven in de lichaamsholte soepel en zonder weerstand. Heeft katheter niet forceren. Als katheter niet soepel in te voeren, terug te keren naar de loodrechte katheter positie en opnieuw beginnen.
- Met katheter volledig is ingebracht in de blaas, duw naar beneden op de buik van de muis om de inhoud van de blaas te verdrijven. Verwijder alle urine uit katheter door op een klein stukje papier handdoek in katheteropening. Wanneer papieren handdoek is doorweekt met urine, te vervangen. Verwijder urine continu tijdens de resterende protocol ook tijdens blaas uitzetting experimenten (zie Protocol 3 hieronder.)
- Plaats twee zilveren draden in linker buikspieren en een zilveren draad in de borst (als grond.)
- Alcohol of jodium stippellijn laterale desinfecteren rechts van katheter (linkerkant van het lichaam dier.)
- Expose linker buikspier.
- Houd de huid in de buurt van links buikspier met een pincet. Maak een kleine 1-2 cm incisie met medium chirurgische schaar.
- Steek punt van een schaar in incisie en voorzichtig uit te breiden incisie tot 2 cm.
- Gebruik een tang om overliggende fascia naar superieure schuine buikspier bloot. Wees voorzichtig niet te snijden / rippen een van de grote bloedvaten die zich in deze regio.
- Buig drie zilveren draden in de helft. Gebruik scherpe 21 G-naald een klein hapje van de spier te nemen. Duw naald door spier. Bij het invoegen in de spieren wees voorzichtig geen interne organen niet te doorboren of te veroorzaken onnodige schade aan de spier.
- Plak een vrije einde van een zilveren draad in de opening van de 21 G naald. Trek de naald terug door de spier om de zilveren draad te trekken door de spier beet. Wanneer de naald is vrij van spier, trek zilveren draad door spier totdat de lus in de draad gelijk ligt met despier beet.
- Herhaal de stappen 1.7.3-1.7.4 voor de tweede spier draad. Deze draad moet worden geplaatst ~ 0,5 cm van de eerste spier draad. Het is belangrijk dat de twee draden niet na inbrengen niet raken.
- Plaats de derde zilverdraad (massa) in de borst inferieur aan het hart.
- Gebruik scherpe 21 G-naald een klein hapje van de huid te nemen (het is niet nodig om een incisie te maken of scheren de huid) en duw de naald door de huid.
- Steek zilver draad zoals hierboven beschreven en haal deze door de huid.
- Plaats een kleine hoeveelheid van 37,5 ° C steriele minerale olie over de blootliggende spieren te vochtig en trek huid over zoveel zichtbare spieren mogelijk.
- Injecteer 0,5 ml zoutoplossing subcutaan te helpen vocht op peil te houden tijdens de daaropvolgende stappen.
- Schud dier op kant zodat lichaamstemperatuur gemakkelijk kan worden gehandhaafd.
2. Gedeeltelijke Anesthesie Step-down procedure (Total tijd ~ 75 min)
De volgende anesthesie protocol is goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de Duquesne Universiteit en is in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health.
- Onmiddellijk na sectie I (hierboven) is voltooid, lager isofluraan tot 1,5%. Houden op dit niveau gedurende 15 minuten.
- Lagere isofluraan zodat het dier gedeeltelijk verdoofd.
- Lagere isofluraan met 0,125% elke 15 min tot dier vertoont een buiging reactie op teen knijpen, maar niet hardop of anderszins bewegen.
- Typisch, een niveau van 0,8-1,0% isofluraan optimaal echter niveaus te compenseren voor verschillen in de anesthesie opstellingen. Vocalisatie en / of ambulantie zijn uiterst zeldzame gebeurtenissen als anesthesie is op het juiste niveau.
. 3 Elektromyogram (EMG) opname Bij Blaas Uitzetting met Graded Drukken (15-75 mmHg) (totale tijd - variabel, afhankelijk van experiment)
- Setup een versterker, een digitizer, en opnamesoftware. In deze opstelling, de digitizer heeft een ingang voor de versterker en twee ingangen voor de drukregelaar (druk en stimulus marker ingangen, zie verder paragraaf 3.1.2). Exact hardware en software configuratie is aan te passen (zie Materialen Lijst voor specifieke instructies).
- Het inrichten van een systeem om specifieke uitbarstingen van luchtdruk te leveren aan dier. Dit systeem wordt aangeduid als de "timed drukregelaar" in het volgende protocol. Het zorgt voor geautomatiseerde druk levering waaronder de digitalisering van de luchtdruk, de controle van het proces lengte, inter-trial interval automatisering, controle van trial nummer, en stimulusaanvang digitaal signaal (zie Anderson et al.. 14 voor schema van een getimede drukregelaar).
- Zet de stroom regulator tot 60 mmHg (check druk met behulp van een analoge bloeddrukmeter.)
- Stel de getimede drukregelaar een 20 seconden voordruk interval (de tijd de 2V stimulus signaal geregistreerd digitizer software) gevolgd door 20 seconden druk uitzetting impuls leveren.
- Start het proces (voordruk interval + druk distention trial). Wanneer de werkelijke druk proef begint, controleer de druk met behulp van de 3 bloeddrukmeters aangesloten op het systeem.
- Tijdens de druk uitzetting proces, moet een sterk EMG signaal (> 0,5 V) in acht worden genomen tijdens en eventueel na 20 sec uitzetting. Het dier kan abdomi vertoneninterne beweging, maar het dier moet niet hardop of anderszins bewegen. Hoewel zeldzaam, als abnormale bewegingen of geluiden worden waargenomen, verhoogt de isofluraan niveau.
- Veel studies gebruiken graded distensies beginnend bij lage druk (10-15 mmHg) en werken tot schadelijke druk (75-80 mmHg) in stappen van 10-15 mmHg. Zie representatieve resultaten hieronder bijvoorbeeld sporen bij verschillende drukken.
- Typische studies omvatten een 20 sec voordruk interval, een 20 sec druk uitzetting proces, en een 1-2 min. interval tussen.
- Voer drie distentions bij elke druk en dan gemiddeld over de drie onderzoeken (een enkele visceromotorische respons voor elk druk te verkrijgen). Bij een alternatieve werkwijze, perform vijf distensies bij elke druk, gooi de hoge en lage proeven, en vervolgens het gemiddelde van de overige drie reacties.
4. Analyse van Raw EMG Traces
- Analyse van visceromotorische reacties (bijvoorbeeld EMG) kunnen eenvoudig via on-board digitizer software of door een programma van derden (Materials List) De volgende instructies zijn algemene instructies die kunnen worden gebruikt om deze informatie te analyseren met behulp van verschillende programma's of via handmatige analyse .
- EMG, druk exporteren en stimulus signaal gegevens uit digitizer software het volgende doen:
- Open experimentele bestand.
- Klik op "Bestand" "Exporteren als."
- Wijzig het bestand naar "spreadsheet tekst (. Txt)," noem het bestand en klik op 'Opslaan'.
- In het pop-up venster, verander de output sample rate op "1000", verander de begintijd naar het moment dat het verzamelen van gegevens begon en verander de eindtijd "MaxTime ()." Selecteer het vakje markering "time shift-uitgang, zodat eerste lijn is een 0.0 sec, "en klik op" OK. "
- De gegevens worden nu geëxporteerd als een tekstbestand dat in een verscheidenheid van programma's kunnen worden geopend. Het bestand moet vier kolommen (Timer, VMR (EMG), Pressure, Stimulus) bevatten.
- Voor elke experimentele dieren getest, voert u de volgende wiskundige bewerkingen.
- Storing EMG signaal voor de gehele door het berekenen van de absolute waarde van elk tijdstip gegevensset.
- Bepaal de gemiddelde EMG respons tijdens het achtergrond gedeelte van het experiment.
- Trek dit gemiddelde achtergrond EMG respons van elke verholpen gegevenspunt in het experiment om de achtergrond gecorrigeerde dataset te verkrijgen.
- Bepaal het oppervlak onder de curve (AUC) voor elke 20 sec predruk interval op de achtergrond gecorrigeerde dataset.
- Bepaal de AUC voor elke 20 sec druk uitzetting proces in de achtergrond gecorrigeerde dataset.
- Verdeel elke druk uitzetting proef AUC (verkregen in stap 4.3.5) door de laagste voordruk interval AUC van het hele experiment (verkregen in stap 4.3.4.). Dit is de genormaliseerde en achtergrond gecorrigeerde AUC voor elke volledige druk uitzetting proces.
- Voor elk proefdier gemiddelde multiple genormaliseerde proeven van een druk om de genormaliseerde VMR in Volt * s (Vsec) te verkrijgen.
- Voer de betreffende statistieken over de gegevens, afhankelijk van de experimentele opzet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een illustratie van de algemene UBD-VMR opstart te zien in figuur 1A. Toenemende stappen induceren een toename in het ruwe VMR (bijvoorbeeld EMG) (Figuur 1B). Het ruwe VMR, druk en stimulus teller signaal dat tijdens het opnemen met digitizer software moet worden opgemerkt is te zien in Figuur 2. Het bovenste kanaal gezien in Figuur 2 is het EMG spoor (in V). De achtergrond signaal van de EMG trace moet gelijkmatig en lage amplitude (<0,2 V) zijn. Als achtergrond hoog is of bevat sporadische grote spikes (> 0,5 V) de draden en de versterker instellingen moet mogelijk worden aangepast. In sommige omstandigheden rond draden (van muis tot versterker en / of versterker te digitizer) in folie kan wat lawaai te verminderen. De middelste kanaal Figuur 2 toont het druksignaal zoals gekwantificeerd door de getimede drukregelaar in mmHg. Merk op dat het signaal ontstaan is een curve. Dit gebeurt omdat de volledige uitzetting vande blaas niet onmiddellijk. Zodra het druksignaal de maximumwaarde voor dat proces (bijv. 75 mmHg in figuur 2) bereikt, dient de druk die maximale waarde blijft. Bij gelegenheid kan lucht lekken uit de plasbuis rond de katheter. Dit gebeurt meestal bij hoge druk (bijv..> 60 mmHg), kan worden waargenomen door een verandering in de amplitude van het druksignaal en kan worden verminderd door toevoeging van een kleine hoeveelheid chirurgische vloeistof dan de urethrale opening. De laatste kanaal (bodem van figuur 2) toont de stimulus marker kanaal. De stimulans marker kanaal toont twee afzonderlijke signalen. Aan het begin van de voordruk interval is een kortstondige 2 V-signaal marker. Dit signaal kan worden gebruikt om de gegevens analyseproces voor een gegeven experiment automatiseren. Specifiek kan men een gegevensanalyse te programmeren om te scannen via een databestand zoekt stimulus markers die boven 1,5 V. Hierdoor kan de data-analyse systeem quickly vinden elke volledige proces. De tweede component van de stimulus kanaal een 1 V signaal dat optreedt tijdens de gehele druk uitzetting proces. Ook kan de aanwezigheid van dit tweede signaal worden gebruikt voor eenvoudige gegevensanalyse.
Representatieve gegevens van een experimentele dier kan worden gezien in figuur 3 en tabel 1 Het dier was opgezwollen drie voor elk van de volgende druk. (. Figuur 3A, tabel 1) 15, 30, 45, 60 en 75 mmHg The drie distentions worden gemiddeld en weergegeven als een gegevenspunt in de grafiek. Merk op dat het genormaliseerde signaal geleidelijk toeneemt met toenemende blaas uitzetting druk. Na deze eerste uitzetting set, kreeg dit dier twee extra sets gesorteerde blaas buik. Zoals te zien in figuur 3B, tweede en derde reeksen distentions een vergelijkbare VMRS (bij elke druk.) Deze drie reeksen distentions voorgedaan in een 2,5 hr period tonen de stabiliteit van de opname opstart en de reproduceerbaarheid van de UBD stimulus en VMR respons in een dier. Belangrijk is dat de stabiliteit op lange termijn van deze prep treedt alleen op wanneer de isofluraan anesthesie geleidelijk naar beneden getrapte de loop van 1 uur. Een kortere anesthesieprocedure kan leiden tot een progressief verlies van de UBD VMR signaal met elke set distentions (ongepubliceerde observaties, Sadler en Kolber.) Een andere factor bij de stabiliteit van de UBD VMR systeem is het handhaven van een stabiele lichaamstemperatuur. Zoals in figuur 4, de UBD VMR (in reactie op 60 mmHg distensie) aanzienlijk lager 33.5 ° C lichaamstemperatuur tegen 37,5 ° C.
Figuur 1. Visceromotorische reacties (VMR) van UBD. (A) Schematic van UBD setup. Perslucht wordt geleverd in de blaas via urethrakatheter. Tijdens distensies, elektroden in buikspier opnemen EMG. Gedurende de gehele procedure, wordt de temperatuur gehandhaafd met behulp van een op batterijen werkende verwarming pad en overhead lamp. (B) Voorbeeld EMG sporen tijdens UBD. Als de druk toeneemt, elektrische output van buikspieren verhoogt congruent.
Figuur 2. Screen shot waarin gegevens tijdens UBD proef. Drie kanalen worden getoond. De bovenste kanaal toont de ruwe EMG trace (in V.) Het middelste kanaal toont de druk (in mmHg) dat wordt naar de blaas wordt geleverd. De bodemspoor toont de stimulus marker kanaal dat de start van de voordruk interval en de gehele druk uitzetting proces aangeeft. Afbeelding is een 40 sec volledige studie (20 sec voordruk interval plus 20 sec druk uitzetting proces.)
Figuur 3. Representatieve gegevens tonen gesorteerde VMR. (A) De genormaliseerde VMR geleidelijk toeneemt met toenemende druk (15-75 mmHg) van de blaas van de muis. (B) Na sets van blaas distentions (15-75 mmHg = 1 set) vertonen gelijkaardige VMRS vergelijking met eerste set distentions.
. Figuur 4 lichaamstemperatuur daalt UBD VMR Een verlaging van de lichaamstemperatuur van 37,5 ° C tot 33,5 ° C veroorzaakt een significante afname van de UBD VMR. (N = 6;. Gepaarde t-test * P <0,05)
Tabel 1. Representatieve gegevens voor een volledige set van distentions. Tabel toont gegevens waaronder de druk uitzetting AUC, voordruk interval AUC, achtergrond gecorrigeerde druk uitzetting AUC en genormaliseerde druk uitzetting AUC. Voor elke druk ontvingen de dieren drie uitzetting proeven. Het gemiddelde van de genormaliseerde druk uitzetting AUC bij elke druk uitgezet in Figuur 3A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij de mens, interstitiële cystitis / pijn in de blaas syndroom (IC / BPS) is een belangrijke klinische probleem omdat patiënten hebben invaliderende pijn die vaak niet reageert op reguliere pijnbehandeling 15. Een van de grote uitdagingen in het begrijpen en uiteindelijk behandeling van chronische pijn in de blaas op de normale neurale processen die betrokken zijn bij de respons op pijnlijke blaas uitzetting begrijpen. Om dit probleem te ondervangen, een diermodel van blaaspijn noodzakelijk. Dit model dient reproduceerbaar, stabiel en gemakkelijk te meten zijn. Gelukkig Ness en collega 10 een systeem dat kan worden gebruikt om de fysiologische reacties op schadelijke blaas buik onderzoeken.
Systeeminstellingen is eenvoudig en kan gedaan worden met behulp van voornamelijk off-the-shelf hardware en software. De belangrijkste aangepaste stuk van de apparatuur die bij de UBD VMR-systeem is de getimede drukregelaar. Dit apparaat een analoogNaar-digitaal conversie luchtdruk en stuurt stimulusaanvang markers om de digitaliseerder hardware. Het gebruik van de getimede drukregelaar gegevensanalyse sterk vereenvoudigd door automatische synchronisatie van drukstimulus met de opgenomen EMG (dwz. VMR) Dit is belangrijk omdat de VMR niet noodzakelijkerwijs start precies wanneer de blaas eerste opgezwollen en VMR vaak gehandhaafd een korte periode (<5 seconden) na het einde van de uitzetting. Niettemin, met zorgvuldige synchronisatie, kan men gemakkelijk de UBD VMR procedure uitvoeren met een aan / uit regelaar op distensie aan / uit en een timer die synchroon met de opgenomen EMG signaal.
Een groot voordeel van de UBD VMR voor het ondervragen zenuwstelsel rol blaaspijn dat reacties op gegradeerde blaas distensie druk komt langs een standaardcurve met toenemende druk induceren groter VMRS. Hierdoor kan de onderzoeker gemakkelijk bepalen of een experimentele manipulation veroorzaakt een toename of afname van de VMR zowel onschadelijke en schadelijke blaas uitzetting druk. Bovendien, het signaal van een dier is zeer stabiel in de tijd, zodat meerdere rondes van gegradeerde uitzetting kan (figuur 3B). Hiermee onderzoekers een basislijn UBD VMR verkrijgen en bewerken van het dier (bv. leveren een geneesmiddel) voor intra-individuele matching 13. Onderzoekers hebben de UBD-VMR-systeem (bij muizen en ratten) gebruikt om op te nemen of te manipuleren ruggenmerg dorsale hoorn neuronen 16 en andere neuronen in het centrale zenuwstelsel (bv. rostral ventrale medulla 17 of amygdala 13,16.) Deze studies en anderen blijven toe te voegen aan onze fundamentele wetenschappelijke begrip van de rol van de verschillende onderdelen van het zenuwstelsel in de verwerking van blaas zintuiglijke input en uiteindelijk de persoonlijke pijn gevoeld van deze nociceptieve ingang. Terwijl de UBD VMR systeem omvat vele experimentele voordelen dere zijn enkele beperkingen aan het model. Enerzijds moet de inwendige blaas uitzetting roept subjectieve "pijn" bij mensen is het onmogelijk te weten of abdominale EMG muizen werkelijk representatief pijn. Toch zijn UBD VMR reacties geremd door gemeenschappelijke pijnstillers te suggereren dat de VMR is een pijn-achtige reactie. Ten tweede, in de onderhavige UBD VMR-systeem, worden de dieren verdoofd tijdens de opname. Hoewel een vergelijking van de live versus verdoofde UBD VMR het gebruik van verdoving 10 heeft gevalideerd, zijn er mogelijk onbekende effecten van isofluraan op straffe-achtige reacties. Ten derde, de beschreven protocol maakt geen overleving operatie zodat meerdere opnamen van individuele muizen in de tijd niet mogelijk. Toch zal het gebruik van de UBD-VMR model evenals andere viscerale pijn systemen zorgen voor een meer volledig begrip van viscerale pijn en zal leiden tot nieuwe therapeutische mogelijkheden voor patiënten die lijden aan IC / BPS en andere viscerale pijn voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij willen Drs erkennen. Robert Gereau, Henry Lai, en Lara Crock voor hun nuttige hulp bij het opzetten van dit systeem. We willen ook graag financieringsbronnen erkennen voor dit werk (BJK - Internationale Vereniging voor de Studie van Pijn Early Career Research Grant door de Scan | Design Foundation door Inger & JENS BRUUN en de Duquesne Universiteit Hunkele Gevreesde Fonds Disease).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
