Abstract
פרוטוקול זה מתאר זיהוי מהיר של חיידקי colorimetric Escherichia coli, סלמונלה spp., ויסטריה מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות. כאן, מים מסוננים דרך הטושים השתנה סטרילי מור (MMS), שמורכבים ממסנן גזה פשוט סגור במחסנית פלסטיק, להתרכז חיידקים. לאחר סינון, מוספים להלא סלקטיבי או סלקטיבי לחיידקי היעד מבוצעים ב- MMS. לגילוי colorimetric של חיידקי היעד, ההעשרה מכן assayed באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) משובצים עם מצעי חיידקים אינדיקטיביים. כל מצע מגיב עם אנזימים חיידקיים היעד מעיד, שהניבו מוצרים צבעוניים שיכול להיות מזוהה מבחינה ויזואלית (זיהוי איכותי) בμPAD. לחלופין, תמונות דיגיטליות של μPADs הגיב יכולות להיות שנוצרו עם סריקה משותפת או מכשירי צילום ונותחו באמצעות תוכנת ImageJ, אלגעייה לפרשנות אובייקטיבית וסטנדרטית יותר של תוצאות. למרות נהלי ההקרנה ביוכימית נועדו לזהות את החיידקים פתוגנים האמור, במקרים מסוימים המיוצרים על ידי אנזימי חיידקי רקע או השפלה של מצעי colorimetric עשוי לייצר חיובי כוזב. לכן, יש צורך באישור שימוש מפלה יותר לאבחון. יחד עם זאת, פלטפורמת ריכוז וזיהוי חיידקים זה היא זול, רגיש (0.1 CFU / גבול גילוי מיליליטר), קלה לביצוע, ומהירה (ריכוז, העשרה, וזיהוי מבוצעים בתוך כ 24hr), מצדיקים את השימוש בו כשיטת סינון ראשונית לאיכות המיקרוביאלית של מים לחקלאות.
Introduction
חשוב שסוכני מחלה במזון מזוהים במהירות ורצוי בהגדרות המבוסס על שדה במטרה להפחית את הנטל של מחלה במזון. אסטרטגיות נפוצות כדי לזהות חיידקים פתוגנים במזון כוללות אפיון ביוכימי, culturing סלקטיבית והפרש, בידוד וזיהוי של מערכת חיסון, וזיהוי מולקולרי. עם זאת, שיטות אלה הקשו על ידי זיהום סדיר, גודל מדגם קטן נבדק, הריכוזים נמוכים לעתים קרובות של החיידקים פתוגניים במזון, דורשים זמני עיבוד ארוכים, ו / או אינם ישימים להגדרות שדה. יתר על כן, תרכובות במטריצות מזון רבות מוגבלים לזיהוי ואבחון יישומים. על מנת לשפר את הסיכוי לגילוי חיידקים, ארצות הברית מנהל המזון והתרופות אמריקניות הציעו כי בדיקות מים לחקלאות (כגון מים מים לשטוף והשקיה) אשר גם באה במגע עם שטח פנים גדול של תוצרת טרייה או משמשת ככלי עבור pזיהום roduce הוא חלופה לבדיקה ישירה של מזון 1. למרות זאת, הפתוגן-הנטל הטבעי לעתים קרובות הנמוך בשילוב עם אפקט הדילול של דגימת מים החקלאית הנציג עושה שיטות הכנת מדגם לריכוז הפתוגן חיוניות. שיטה כזו תדרוש דגימה בכמויות גדולות של מים (≥ 10 L), פתוגן ריכוז נאות, ותאימות עם אסטרטגיות זיהוי במורד הזרם.
מטליות הותאמו מור (MMS) הם מכשירים זולים, פשוט, ומחוספסים המשמשים לריכוז חיידקים מכמויות גדולות (≥ 10 L) של המים 2-4. MMS מורכב מקלטת פלסטיק מלאה עם גזה, המשמשת כמסנן גס לכמויות גדולות של מים נשאבות באמצעות הקלטת באמצעות משאבת peristaltic. MMS הוא שיטה בלתי מפלה של ריכוז חיידקים (≥ ריכוז 10 פי) הלוכדת חלקיקי חומר אורגני ולא אורגני, כולל מיקרואורגניזמים בli מעובדדגימות פאונד. סביר להניח כי את היעילות מצוינת של ריכוז של מיקרואורגניזמים המטרה על ידי MMS יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה כי מיקרואורגניזמים צפויים להיות מחובר לשבריר סחף החימר או מיקרו אגרגטים האורגניים של המוצקים מרחפים 3. העיצוב המחוספס של MMS מאפשר להתגבר על מרבית הליקויים הקשורים לשיטות סינון אחרות עבור לכידה וריכוז של חיידקים ממים, כגון סתימה של מסננים, חוסר יכולת לעבד כמויות גדולות, דגימות עם מסנן גבוה עכירות, ועלויות גבוהות. מסיבות אלה, ה-FDA ממליצה שMMS של ישולב נהלים רשמיים לנהלי איסוף דגימה סביבתיים וקשורות לייצר 5.
הנה, שיטה מתוארת לריכוז, להעשרה, וזיהוי של Escherichia coli, סלמונלה spp., וחיידקים ליסטריה ממים חקלאיים. MMS משמש לריכוז של bacteria, ומשמש גם ככלי להעשרת חיידקים סלקטיבית או לא סלקטיבית. גילוי חיידקים מושגת ביוכימית באמצעות מכשירים אנליטיים מבוסס נייר (μPADs) 6. יכול להיות מיוצר μPADs כרשתות fluidic או בדיקות מקום באמצעות מגוון של שיטות, כולל photolithography, הדפסת דיו, הטבעה, ושעוות הדפסת 7-11. דוגמאות של עיצובי fluidic יכולות להיות דפוסי ערוץ הדנדריטים בי המדגם מופקד במרכז ובהמשך זורם למאגרי דיסטלי או דפוסי ערוץ אחד שבו המדגם או המצע הם משכו מהמאגרים החיצוניים של הערוץ על ידי פעולת נימים למרכז 12. עבור פרוטוקול זה, בחרנו להעסיק למערכי 7 מ"מ בקוטר נייר שעוות מקום שנעוצים עם מצעי chromogenic שיכול להיות מעובד על ידי אנזימים מעידים על מיקרואורגניזמים נבדקו כאן: β-D-galactopyranoside האדום Chlorophenol (CPRG) ו 5 - bromo-4-כלורו-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)לצורך זיהוי של β-galactosidase וβ-glucuronidase הופק על ידי א coli; caprylate 5-bromo-6-כלורו-3-indolyl (caprylate מגנטה) לצורך זיהוי של C8-esterase מיוצר על ידי spp סלמונלה.; ופוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-מיו-אינוסיטול (X-InP) לצורך זיהוי של C פוספוליפאז phosphatidylinositol הספציפי (PI-PLC) המיוצר על ידי ל ' חיידקי 6. לפיכך, נוכחותו של חיידק מסוים ניתן להבחין באופן חזותי ללא הצורך בציוד מורכב או נתונים לפרשנות. הסגוליות והרגישות של זיהוי μPAD colorimetric מבוסס אנזים של חיידקי היעד הספציפיים אלה כבר נחקרו בעבר 6. בנוסף, הרגישות של שיטת ריכוז איתור המשולבת עבור חיידקי היעד אלה הוערכה על ידי יוצרות עלייה חדה של כמויות גדולות של מים עם רמות שנקבעו מראש של מיקרואורגניזמים (נתונים שלא פורסם וBisha et al. 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ריכוז חיידקים מכמויות גדולות של מים לחקלאות באמצעות MMS
- MMS הכנה
- לחתוך קטע מלבני של אריג 4 רובדי מדידת 40 x 12 סנטימטר.
- מקפלים את הגזה לאורך שני הצירים כדי להשיג מלבן 20 x 6 סנטימטר.
- מגלגל את הגזה בחוזקה לאורך הציר הארוך שלה כדי ליצור ספוגית גלילית של כ 6 סנטימטר ו -3 ס"מ קוטר.
- החיטוי ספוגית הגזה ברדיד אלומיניום, לא חיטוי את הקלטת. לטהר את הקלטת על ידי השריית אותו ל30 דקות ב10% אקונומיקה משק בית, ולבטל את הכלור השיורי על ידי השריית את הקלטת ל15 דקות בpentahydrate thiosulfate נתרן (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O) פתרון (50 מ"ג / ליטר הכין במים סטריליים).
- הכנס את ספוגית לקלטת-MMS.
הערה: אם הגרסה שאינה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, להתחיל עם גיליון 4 הרובד של אריגיasuring 80 x 22 סנטימטר, לקפל אותו ל40 x 11 ס"מ ומגלגלים אותו לצורת גליל כ 11 סנטימטר ו -6 ס"מ קוטר. - להרכיב-MMS.
- צרף צינורות ויניל לברזים משני צידי MMS, כדי להבטיח את צינורות שומרת באופן מלא לברזים, ולתקן את הצינור לתוך משאבת peristaltic. ודא כי במעלה הזרם בצינור של משאבת peristaltic הוא באורך מספיק לדגימה.
- ריכוז של חיידקים
- לדוגמא לפחות 10 L של מים לחקלאות על ידי הפעלת משאבת peristaltic במהירות גבוהה.
- לאחר הדגימה היא שלמה, למשוך את מפרצון משאבת peristaltic מדגימת המים ולהמשיך להפעיל את המשאבה עד שאין מים בשפכים הוא ציין יציאת MMS.
- אם סעפת משמשת להפעלה כמה דגימות באותו הזמן, לאסוף את השפכים של כל-MMS, וכאשר 10 L מסונן דרך MMS אחת לסגור את הברז לMMS מסוים ולהמשיך להפעיל את המשאבה.
- כאשר דגימת is הושלם, למשוך את מפרצון משאבת peristaltic מהמים לחקלאות, לפתוח את כל השסתומים של הסעפת, ולהמשיך להפעיל את המשאבה עד שאין מים בשפכים הוא ציין יציאת MMSs.
- כאשר ריכוז הושלם עבור כל MMSs, להסיר בזהירות את הצינור ויניל מברזי MMS ומכסה את הברזים משני צידי ב-MMS. MMS כתרים בחוזקה יכול להיות מאוחסן במשך שעות עד 12 לפני הוספת מדיה העשרה.
2. MMS העשרה והכנת דוגמאות
- העשרה
- הברג החוצה את המכסה של MMS, וסביבה נקיה מחיידקים להוסיף 20 מיליליטר של מרק העשרת סטרילי המתאים. השתמש באחת MMS לכל העשרה סלקטיבית. לחלופין, לבצע העשרה הלא סלקטיבי להפיץ כל שלושת חיידקי היעד במדגם זהה.
הערה: אם הגרסה שאינה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, סביבה נקיה מחיידקים להסיר את מסנן גזה מהקלטת ומניח בשקית סטרילית לפני המודעהדינג 225 מיליליטר של התקשורת להעשרה המתאימה.- להעשרתו של ע ' coli, להוסיף 20 מיליליטר של מים שנאגרו peptone (BPW) בתוספת 8 מ"ג / ליטר של hydrochloride vancomycin.
- להעשרה של spp סלמונלה., להוסיף 20 מיליליטר של BPW בתוספת תוסף סלמונלה (4 מיליליטר / L).
- להעשרתו של ל ' חיידקי, להוסיף 20 מיליליטר של מרק Vidas UP ליסטריה (LPT).
- להעשרה הלא סלקטיבי בו זמנית לכל שלושת מיקרואורגניזמים באמצעות MMS יחיד, השתמש מרק preenrichment אוניברסלי (UPB).
- הברג את המכסה של MMS על גב בחוזקה. ודא שברזיהם בחוזקה כתרים כדי שלא יישפכו וזיהום אפשרי בהעשרה.
- דגירה MMS לתקופה של עד 18-24 שעות בחממה רועדת בסל"ד 200. השתמש 42 מעלות צלזיוס למשך E. spp coli וסלמונלה. העשרה סלקטיבית. השתמש ב-C ° 30 לL. העשרה סלקטיבית חיידקי, ולהשתמש 37 & #176; C להעשרה הלא סלקטיבי.
- הברג החוצה את המכסה של MMS, וסביבה נקיה מחיידקים להוסיף 20 מיליליטר של מרק העשרת סטרילי המתאים. השתמש באחת MMS לכל העשרה סלקטיבית. לחלופין, לבצע העשרה הלא סלקטיבי להפיץ כל שלושת חיידקי היעד במדגם זהה.
- לדוגמא הכנה
- כאשר דגירה הושלמה, להסיר את MMS מהחממה, uncap אחד מהברזים, ועדינות לוותר על 0.5 מיליליטר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. לחלופין, להתיר MMS וטפטף החוצה 0.5 מיליליטר של העשרת הלילה.
הערה: אם לא הגרסה חד פעמית של קלטת MMS משמשת, פיפטה 0.5 מיליליטר של העשרה מהשקית. - לניתוח colorimetric של E. העשרה סלקטיבית coli, או לניתוח של המוספים להלא סלקטיבי, sonicate 0.5 מיליליטר של העשרה בW 5, 22 קילוהרץ ל20 שניות באמצעות sonicator בדיקה.
- כאשר דגירה הושלמה, להסיר את MMS מהחממה, uncap אחד מהברזים, ועדינות לוותר על 0.5 מיליליטר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. לחלופין, להתיר MMS וטפטף החוצה 0.5 מיליליטר של העשרת הלילה.
3. הכנה והטבעה של מצעי Colorimetric בμPADs
- הכן מספיק μPADs עבור כל דגימה ויעד שנבדק. כדי לזהות E. coli להכין μPADs CPRG ו-X-Gluc, לspp סלמונלה. איתור להכין μPADs MC, ועבור ל ' monocytאיתור ogenes להכין μPADs X-InP.
- הכן את חיץ HEPES [M 0.1 HEPES עם 0.1% הסרום אלבומין שור (BSA)] למצעי colorimetric ולהתאים את ה-pH של למאגר על פי המצע שהוא הולך להיות בשימוש: pH 7.5 להכנת CPRG או X-Gluc, pH 9 לMC, ו-pH 7 לX-InP.
- הכן פתרונות מניות של מצעים בpH מותאם חיץ HEPES בריכוזים של 3 מ"מ (CPRG), 62.5 מ"מ (X-Gluc), 15 מ"מ (MC), 100 מ"מ (X-InP). הגן על פתרונות המניות מהאור.
- הנח את μPADs בתוך צלחת פטרי סטרילית, ולאחר מכן להשתיל microspot μPAD עם 24 μl של כל פתרון מניות מצע.
4. באיתור ובניתוח נתונים
- איתור
- הוסף 6 μl של המדגם המועשר לכל microspot μPAD המתאים כלול בצלחת פטרי.
- הנח את הכיסוי אחורי על צלחת פטרי ולאטום אותו עם Parafilm.
- דגירה מדגםעם μPAD ב37 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שעות, כדי לאפשר פיתוח צבע וייבוש של microspots.
- בדיקה ויזואלית של התוצאות
- לבצע זיהוי על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה של השינויים בצבע של μPADs.
הערה: בדרך כלל, תגובות חריפות המייצרות שינויי צבע סופיים צפויות הבא 18-24 שעות של העשרה, שאמור לייתר את הצורך בהמשך הבירור וצריך להיחשב חיובי. - לקבוע את קיומו של א מדגם חיובי coli על ידי התבוננות microspots נעוץ בשינוי CPRG מצהוב לאדום סגול וmicrospots נעוץ בשינוי X-Gluc בין חסר צבע לכחול ירוק.
- לקבוע את נוכחותם של ל ' חיידקי לדגימה חיובית על ידי התבוננות microspots המוטבעת עם שינוי X-InP בין חסר צבע לכחול כהה.
- לקבוע את הנוכחות של spp סלמונלה. מדגם חיובי על ידי microspots התבוננות שנעוצים בשינוי MC מcolorless לסגול סגול.
- לבצע זיהוי על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה של השינויים בצבע של μPADs.
- תוכנת ניתוח נתונים בעזרת
הערה: נערך על מנת לקבוע באופן ברור אם תגובות חלשות הן חיוביות או שליליות ולאפשר ניתוח חצי כמותית של התוצאות.- לאפשר μPADs לייבוש באופן מלא.
- סרוק את μPAD באמצעות סורק שטוח מיטה.
- השתמש בתוכנת ImageJ לעבד את התמונה.
- "פתח את" תמונה סרוקה להיות מנותח בImageJ נמצא תחת לשונית "קובץ" בתפריט הראשי (או העיתונות "CLT + O").
- היפוך צבעים בתמונת בחירה "מרחב" הממוקם תחת הלשונית "ערוך" בתפריט הראשי (או העיתונות "CLT + Shift + I").
- השתמש בכרטיסייה "נתח" בתפריט הראשי ובחר "מדידות הגדר ..." כדי לבחור את המדידות דיווחו מנותחות.
- ודא כי "עוצמת הממוצעת האפורה", "לימיט לסף," ואת "קופסות תווית תצוגה" הןבדק, ולחץ על "אישור". זה מגדיר את אופן התוכנה מנתח כל אזור שנבחר וכיצד היא מדווחת עליו.
- השתמש בכלי "הסגלגל" לצייר מעגל שמתאר את האזור שברצונך למדוד בתוך.
- תחת הלשונית "נתח" בחר "מדוד", (או לחץ "CLT + M"). התוכנה תהיה למדוד את עוצמת האפורה הממוצעת באזור המוגדר ולדווח על כך במסך מוקפץ שניתן להעתיק ולהדביק להצטיין לניתוח נוסף.
הערה: לניתוח מדויק יותר, לפחות שתי חזרות טכניות של כל דגימה צריכה להתבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שתואר בפרוטוקול זה, ריכוז של חיידקים באמצעות MMS (איור 1) יכול להתבצע בתוך כ 15-20 דקות. MMS בנבנה מאקריל ניטריל אקרילוניטריל (ABS) בשני מרכיבים נפרדים; מיכסה ומחסנית הן עם הרכבה רז שולבה בי ספוגית גזה גלילית מוכנסת (איור 1 א). לאחר מכן שני הרכיבים דפוקים יחד ויוצרים MMS (איור 1). עיבוד מבוסס MMS הוא מונע על ידי משאבת peristaltic סוללות, המאפשר דגימות להיות מרוכזים בהגדרות שדה. על ידי צימוד ריכוז MMS, העשרה סלקטיבית (18-24 לשעה), וμPADs; מים לחקלאות יכולים להיות במהירות (כ 24hr), בקלות, ובזול לגילוי פתוגנים חשובים במזון ומיקרואורגניזמים חיווי, כוללים א ' coli, סלמונלה spp., ול ' חיידקי. עם פרוטוקול זה, חיידקי היעד אלה ניתן לזהות אד ברמות נמוכות כמו 0.1 CFU / מיליליטר. מבחני μPAD מבוססים על זיהוי של אנזימי חיידקים מעידים כי מגיבים עם מצעי colorimetric (איור 2). מבחני איתור E. coli, אך לא א coli O157: H7, לייצר מוצר כחול ירוק (איור 2 א). כמו כן, assay שמזהה רובו של ע ' זני חיידק מייצר מוצר אדום סגול תגובה (איור 2). מבחני איתור spp סלמונלה. (איור 2 ג) ול ' חיידקי (איור 2 ד) לייצר צבעים סגולים סגולים ואינדיגו, בהתאמה. הבדיקה יכולה להתפרש על ידי העין (איכותי), ופסקי דין חזותיים הם בדרך כלל מניח את הדעת לאפליה בין דגימות חיוביות ושליליות. לחלופין, ניתן להשפיע על תמונות דיגיטליות באמצעות תוכנת ImageJ (איור 3 א), כדי לאפשר לפרשנות נתונים אובייקטיבית וסטנדרטית יותר (איור 3 ב).
ss = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 1. הקלטת השתנה מור ספוגית (MMS). () MMS מפורק. MMS מופק במדפסת 3-D מאקריל ניטריל אקרילוניטריל (ABS) והוא מורכב משלושה מרכיבים עיקריים: מחסנית עם הרכבה רז שולבה בי ספוגית גלילית גזה (מקופלת 4 רובדי) מוכנסת והוא הכתירה עם מיכסה שיש הרכבה ברז משולבת. (ב) MMS התאסף.
תגובות colorimetric איור 2. חיידקים אינדיקטיביים. מצעים (X-Gluc, CPRG, MC, ו-X-InP) נעוץ בmicrospots של μPADs מגיבות עם אנזימי חיידקים אינדיקטיביים (&# 946;-glucuronidase, β-galactosidase, C8-esterase, וPI-PLC) כדי לייצר שינוי colorimetric. (א) תגובת X-Gluc חיובית היא אינדיקציה א הגנרית coli, אך לא א coli O157: H7; (ב) תגובת CPRG חיובית היא אינדיקציה לכך שE. coli נמצאים; (ג) תגובת MC חיובית מעידה על קיומו של spp סלמונלה.; (ד) ותגובת X-InP חיובי מעידים על קיומו של ל ' חיידקי.
.. איור 3 חזותיים וImageJ ניתוחים של בדיקות μPAD colorimetric חיידקים מעידים מציג תמונות colorimetric דיגיטציה לכל assay עם שניהם שלילי (-) ובדיקה חיובית (+). בדיקות שליליות בוצעו באמצעות lysates של speci חיידקיםes שאינו מקודד את אנזימי היעד ובדיקות חיוביות עם lysates או מוספים של חיידקי היעד. (1) לא עברתי שינוי תמונות סרוקה. תמונות סרוקות (2) תומרנה לגוונים אפורים באמצעות תוכנת ImageJ, ו (3) צבע הפוך תמונות לפרשנות מאוחרת יותר של עוצמת אפורה. (4) עוצמת אפורה הממוצעת שנמדדה באמצעות ImageJ בתוך כל microspot של μPAD (microspot דוגמא מצויינים על ידי החץ והעיגול הצהובים). B מראה את העוצמות הממוצעת האפורות (שנקבעו על ידי ImageJ) עבור כל μPAD colorimetric מבחן חיובי ושלילי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה משולבת לאיתור E. coli, סלמונלה spp., ול ' חיידקי במים לחקלאות. כאן, ריכוז MMS של חיידקים מכמויות גדולות (10 L) של מים לחקלאות, בשילוב עם העשרה בקטריאלי, וזיהוי colorimetric חיידקים-מעידים באמצעות μPADs. הליך MMS יכול להתמודד עם תוכן גבוה חלקיקים בדגימות המים תוך התמקדות החיידקים פי 10, הוא איתן ודי פשוט עבור יישומים בתחום על ידי אנשים שקבלו הכשרה מינימאלית, וניתן לבצע עם עלויות מינימליות. על ידי שילוב של צעד העשרת חיידקים, חיידקים חיים מזוהים ואת הרגישות של השיטה היא מאוד משופרת. העשרה מגבירה את היעד להיות assayed, וכאשר בשילוב עם תקשורת צמיחה סלקטיבית, מפחיתה את צמיחת חיידקים לא רצויה בדגימות שיכולים לתרום לתוצאות חיוביות כוזבות. זיהוי סופי מתבצע עם μPADs, המספק פשוט,חסכוני, וקל לפרש פתרון למסך לפתוגנים במזון חשובים. ההליך כולו, ובכלל זה ריכוז MMS, העשרה בן לילה, וזיהוי colorimetric, ניתן לבצע בתוך יום אחד, ומזהה זיהום חיידקים ברמות מעטים ככל 0.1 CFU / מיליליטר.
כדי לפשט את השיטה ולצמצם את האפשרות של זיהום, MMS משמש כמכל להעשרה בקטריאלי. הוספת העשרה זו להליך מגבירה את רגישות, סגוליות, מוסיפה גמישות לשיטה. אמנם רק שלושה מוספים סלקטיבית נוצלו כאן, מוספים לשיפור לחיידקים יכולים להיות מפותח. לדוגמא, אנו בוחנים את האפשרות של שילוב מעוררים ספציפיים לתקשורת להעשרה מנת לשפר את הייצור של אנזימי כתב המשמשים לזיהוי colorimetric.
ΜPADs משמש לזיהוי הפתוגן הם פשוטים לשימוש, מערכי נקודה אחת שעלות קטנה כמו $ 0.002/device לפני התוספת של מצע כתב colorimetric. אפילו היוו ריאגנטים העשרה ומצעי colorimetric, עלות כל בדיקה היא כמה סנטים, למעט ל ' חיידקי למבחן אשר נאמד ב1.28/test $ עקב גבוהה כיום העלות של X-InP. עם זאת, עלות זו משווה לטובה לשיטות זיהוי הנוכחיות לפתוגנים במזון 6. בצורתו הנוכחית שלהם, μPADs חייב להיות מוכן מייד לפני הבדיקה בשל יציבות מצע עני. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו בודקים בנוסף לייצוב תוספים והערכת אחסון יבש כדי להגדיל את חיי מדף המצע / μPAD. בנוסף, אנו מפתחים μPADs המרובב באמצעות מספר אתרים לדוגמה / מגיב מחוברים זה לזה על ידי ערוצי microfluidic.
למרות היתרונות שפורטו בעבר לבדיקות μPAD, בעיות עם סגוליות assay אפשריות: 1) אנזימי הכתב אינם excluמיוצר שהבהב על ידי חיידקי היעד, חיידקי רקע ובכך לזהם עשויים לתרום לתוצאה חיובית כוזבת. 2) אם חלקיקי צבע כהים נמשך בתקשורת ההעשרה, זה יכול לטשטש את ניתוח חזותי וImageJ כאשר הועבר μPAD. 3) assay הנוכחי לא יכול לזהות באופן ספציפי א O157 coli: H7. כתוצאה מכך, השיטה מתאימה יותר כתנופת מבחן מתן סינון ראשונית לבדיקה ואישור להתנהל נוספים. עם זאת, רבים מהחסרונות האלה מופנים בקלות. שילוב פנל גדול יותר של מצעי colorimetric מעידים יאפשר קביעה מדויקת יותר של חיידק היעד, כוללים א ' O157 coli: H7. באופן דומה, הליכי העשרה סלקטיבית נוספים יכולים למזער את החיידקים מזהמים במדגם. כדי לצמצם את ההשפעה של חלקיקים בהעשרה, מסנן גס יכול לשמש לפני החלת דגימות לμPAD.
לסיכום, thiמחקר של מוכיח כי MMS בשילוב עם העשרה וμPADs יכול לשמש כדי לזהות רמות נמוכות של E. coli, סלמונלה spp. ול ' חיידקי במים לחקלאות. עם כמה שינויים, ההליך הוא נייד ותוכל להיות מיושם בהגדרות שדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 x 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10 ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , Administration USFaD. (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. , WO2012125781 A3 (2012).
- T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).
