Abstract
Dit protocol beschrijft de snelle colorimetrische detectie van Escherichia coli, Salmonella spp., En Listeria monocytogenes van grote volumes (10 L) van landbouwproducten wateren. Hier wordt water gefiltreerd door steriele Modified Moore swabs (MMS), die bestaan uit een eenvoudige gaasfilter ingesloten in een plastic behuizing, bacteriën concentreren. Na filtratie, zijn niet-selectief of selectief verrijkingen voor de doelbacteriën uitgevoerd in de MMS. Voor colorimetrische detectie van de doelgroep bacteriën, zijn de verrijkingen vervolgens getest met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) ingebed met bacteriën-indicatief substraten. Elk substraat reageert met doelwitspecifieke indicatieve bacteriële enzymen, genereren gekleurde producten die visueel (kwalitatieve detectie) kunnen worden gedetecteerd op de μPAD. Als alternatief kunnen digitale beelden van de gereageerde μPADs worden gegenereerd met gemeenschappelijke scannen of fotografische apparaten en het gebruik van ImageJ software, al geanalyseerdgende voor meer objectieve en gestandaardiseerde interpretatie van de resultaten. Hoewel de biochemische screening procedures tot de bovengenoemde bacteriële pathogenen te identificeren, in sommige gevallen enzymen die door microbiota achtergrond of de afbraak van de colorimetrische substraten produceren vals positief. Daarom wordt bevestigd met behulp van een meer discriminerende diagnose nodig. Toch is dit bacteriële concentratie en detectieplatform is goedkoop, gevoelig (0,1 CFU / ml detectielimiet), gemakkelijk uit te voeren en snel (concentratie, verrijking, en detectie wordt uitgevoerd binnen ongeveer 24 uur), het gebruik als een eerste screeningsmethode rechtvaardigen voor de microbiologische kwaliteit van landbouwproducten water.
Introduction
Het is belangrijk dat voedsel overgedragen ziekten agenten snel en bij voorkeur worden gedetecteerd in het veld op basis van de instellingen om de last van voedsel overgedragen ziekten te verminderen. Gemeenschappelijke strategieën van voedselinfecties bacteriële pathogenen te detecteren omvatten biochemische profilering, selectieve en differentiële kweken, immunologische isolatie en detectie en moleculaire detectie. Echter, deze methoden gehinderd door sporadische besmetting, kleine steekproeven getest, de vaak lage concentraties van de pathogene bacteriën, vereisen lange doorlooptijden, en / of zijn niet van toepassing voor lokale instellingen. Verder verbindingen in veel voedingsmatrices zijn remmend voor detectie en diagnostische toepassingen. Om de kans op microbiële detectie te verbeteren, heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration stelde dat het testen van water voor de landbouw (zoals waswater en irrigatiewater) die ofwel in contact komt met een groot oppervlak van verse producten of dient als een voertuig voor produce besmetting is een levensvatbaar alternatief voor directe testen van levensmiddelen 1. Zelfs zo, de vaak lage natuurlijke pathogeen-belasting in combinatie met het verwateringseffect van de vertegenwoordiger agrarische watermonster maakt vanm pathogeen concentratie essentieel. Een dergelijke methode zou vereisen bemonstering grote hoeveelheden water (≥ 10 L), voldoende pathogeen-concentratie, en compatibiliteit met downstream detectie strategieën.
Gemodificeerde Moore swabs (MMS) zijn goedkoop, eenvoudig en robuust apparaten die worden gebruikt voor het concentreren van bacteriën uit grote volumes (≥ 10 L) water 2-4. De MMS bestaat uit een kunststof cassette gevuld met gaas, dat als een grof filter voor grote volumes water gepompt door de cassette via een peristaltische pomp. De MMS is een niet-discriminerende wijze van bacteriële concentratie (≥ 10 voudige concentratie) dat organische en anorganische deeltjes bestaand materiaal vangt waaronder micro-organismen in verwerkt liquid monsters. Het is waarschijnlijk dat de uitstekende werkzaamheid concentratie van target micro-organismen door de MMS kan worden verklaard door het feit dat micro-organismen zullen naar verwachting worden bevestigd aan de slib-kleifractie of organische micro-aggregaten van de zwevende stoffen 3. Het robuuste ontwerp van de MMS maakt overwinnen meeste tekortkomingen geassocieerd met andere filtratie methoden voor het vangen en concentratie van de bacteriën uit water, zoals verstopping van filters, onvermogen om grote volumes verwerken, filter monsters met hoge troebelheid en hoge kosten. Om deze redenen is de FDA de aanbeveling dat van MMS in officiële procedures voor milieu-en produceren van-gerelateerde monstername procedures 5 worden opgenomen.
Hier wordt een werkwijze beschreven voor de concentratie, verrijking, en detectie van Escherichia coli, Salmonella spp. En Listeria monocytogenes uit agrarische wateren. Een MMS wordt gebruikt voor concentratie van bactEria, en dient ook als een schip voor selectieve of niet-selectieve verrijking van bacteriën. Bacteriële detectie wordt biochemisch bereikt met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) 6. μPADs kunnen worden vervaardigd als fluïde netwerken of spot testen met behulp van verschillende methoden, met inbegrip fotolithografie, inkjet printen, stampen, en wax afdrukken 7-11. Voorbeelden van vloeibare ontwerpen kunnen dendritische kanaalrasters waar het monster wordt aangebracht in het midden en stroomt vervolgens distaal reservoirs of eenkanaals patronen waarbij het monster of substraat uit de buitenste reservoirs van het kanaal worden getrokken door capillaire werking naar het centrum 12. Voor dit protocol, hebben wij ervoor gekozen om in dienst voor 7-mm-diameter van wax-papier spot arrays ingebed met chromogene substraten die kunnen worden verwerkt door enzymen die een indicatie van de hier geteste micro-organismen: Chlorophenol rood β-D-galactopyranoside (CPRG) en 5 - broom-4-chloor-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)voor de detectie van β-galactosidase en β-glucuronidase door E. coli; 5-broom-6-chloor-3-indolyl caprylaat (magenta caprylaat) voor de detectie van C8-esterase door Salmonella spp.; en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-myo-inositol fosfaat (X-InP) voor de detectie van fosfatidylinositol-specifieke fosfolipase C (PI-PLC) door L. monocytogenes 6. Aldus kan de aanwezigheid van een bepaalde bacterie visueel geobserveerd zonder omslachtige apparatuur of data interpretatie. De specificiteit en gevoeligheid van de enzymatische colorimetrische μPAD detectie van deze specifieke doelstelling bacteriën eerder onderzocht 6. Bovendien is de gevoeligheid van de geïntegreerde concentratie-detectiemethode voor deze doelgroep bacteriën werd geëvalueerd door spiking grote hoeveelheden water met vooraf bepaalde niveaus van micro-organismen (ongepubliceerde gegevens en Bisha et al.. 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Concentratie bacteriën uit grote hoeveelheden Agricultural Water gebruik van MMS
- MMS Voorbereiding
- Snijd een rechthoekige doorsnede van 4-laags kaasdoek meet 40 x 12 cm.
- Vouw de kaasdoek langs beide assen tot een rechthoek van 20 x 6 cm te verkrijgen.
- Rol het kaasdoek strak langs zijn lengteas een cilindrische uitstrijkje van ongeveer 6 cm lang en 3 cm in diameter vormen.
- Autoclaaf de kaasdoek wattenstaafje in aluminiumfolie, doe de cassette niet in een autoclaaf. Maak de cassette door het weken voor 30 min in 10% bleekmiddel en deactiveer het resterende chloor met het weken van de cassette gedurende 15 min in een natrium thiosulfaat pentahydraat (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O)-oplossing (50 mg / L bereid in steriel water).
- Steek het staafje in het MMS-cassette.
OPMERKING: Als de niet-disposable versie van het MMS-cassette wordt gebruikt, te beginnen met een 4-laags vel kaasdoek measuring 80 x 22 cm, vouwen om 40 x 11 cm en rol het een cilinder ongeveer 11 cm hoog en 6 cm in diameter vormen. - Monteer de MMS.
- Hechten vinyl slang aan aansluitingen aan beide zijden van de MMS, zodat de slang volledig voldoet aan de aansluitingen, en bevestig slang in de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de buis stroomopwaarts van de peristaltische pomp is van voldoende lengte voor bemonstering.
- Concentratie Bacteria
- Voorbeeld tenminste 10 L landbouwproducten water door uitvoering van de peristaltische pomp met hoge snelheid.
- Na bemonstering voltooid is, trekt de peristaltische pomp inlaat van het watermonster en doorgaan met het uitvoeren van de pomp tot er geen afvalwater wordt waargenomen verlaten van de MMS.
- Wanneer een spruitstuk wordt gebruikt om meerdere monsters draaien op hetzelfde moment, verzamel het effluent van elk MMS, en wanneer 10 L wordt gefiltreerd door een MMS sluit de klep voor die MMS blijven rijden de pomp.
- Bij de bemonstering is voltooid, trekt de peristaltische pomp inlaat van het water voor de landbouw, open alle kleppen van het spruitstuk, en doorgaan met het uitvoeren van de pomp tot er geen afvalwater wordt waargenomen verlaten van de mms.
- Wanneer de concentratie is voltooid voor alle MMS'en, verwijder voorzichtig de vinyl slang van de MMS tappen en dop de aansluitingen aan beide zijden van de MMS. Goed afgesloten MMS kan worden bewaard tot 12 uur voor het toevoegen verrijkingsmedia.
2. MMS Verrijking en Monstervoorbereiding
- Verrijking
- Schroef het deksel van de MMS, waarna aseptisch 20 ml van de geschikte steriele verrijkingsbouillon. Gebruik een MMS voor elke selectieve verrijking. Als alternatief, het uitvoeren van een niet-selectieve verrijking voor alle drie de doelbacteriën voortplanten in hetzelfde monster.
OPMERKING: Als de niet-disposable versie van het MMS-cassette wordt gebruikt, aseptisch verwijderen kaasdoek filter uit de cassette en plaats in een steriele zak voordat advertentieding 225 ml van de juiste verrijking media.- Voor verrijking van E. coli, voeg 20 ml gebufferd peptonwater (BPW) aangevuld met 8 mg / l vancomycine hydrochloride.
- Voor verrijking van Salmonella spp., Voeg 20 ml BPW aangevuld met de Salmonella supplement (4 ml / L).
- Voor verrijking van L. monocytogenes, voeg 20 ml VIDAS UP Listeria (LPT) bouillon.
- Voor gelijktijdige niet-selectieve verrijking voor alle drie micro-organismen met behulp van een enkele MMS, gebruiken universele preenrichment bouillon (UPB).
- Schroef het deksel van de MMS terug stevig vast. Zorg ervoor dat de aansluitingen goed zijn afgedekt om morsen en mogelijke besmetting tijdens verrijking te voorkomen.
- Incubeer de MMS voor maximaal 18-24 uur in een incubator schudden bij 200 rpm. Gebruik 42 ° C voor E. coli en Salmonella spp. selectieve verrijkingen. Met 30 ° C voor L. monocytogenes selectieve verrijking, en het gebruik van 37 & #176, C voor niet-selectieve verrijking.
- Schroef het deksel van de MMS, waarna aseptisch 20 ml van de geschikte steriele verrijkingsbouillon. Gebruik een MMS voor elke selectieve verrijking. Als alternatief, het uitvoeren van een niet-selectieve verrijking voor alle drie de doelbacteriën voortplanten in hetzelfde monster.
- Monstervoorbereiding
- Bij incubatie is voltooid, verwijdert u het bericht van de incubator, verkondigen een van de aansluitingen, en zachtjes afzien ongeveer 0,5 ml in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Als alternatief, schroef de MMS en pipet uit 0,5 ml 's nachts verrijking.
OPMERKING: Als het niet-disposable versie van de MMS-cassette wordt gebruikt, pipet 0,5 ml van verrijking uit de zak. - Voor colorimetrische analyse van E. coli selectieve verrijking of voor de analyse van de niet-selectieve aanrijking ultrasone trillingen 0,5 ml verrijking 5 W, 22 kHz gedurende 20 seconden met behulp van een probe sonicator.
- Bij incubatie is voltooid, verwijdert u het bericht van de incubator, verkondigen een van de aansluitingen, en zachtjes afzien ongeveer 0,5 ml in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Als alternatief, schroef de MMS en pipet uit 0,5 ml 's nachts verrijking.
3. Voorbereiding en Inbedding van Colorimetric Substrates in μPADs
- Bereid genoeg μPADs voor elk monster en doelwit getest. E. detecteren coli bereiden CPRG en X-Gluc μPADs, voor Salmonella spp. detectie bereiden MC μPADs, en voor L. monocytogenes detectie bereiden X-InP μPADs.
- Bereid HEPES buffer [0,1 M HEPES met 0,1% runderserumalbumine (BSA)] voor de colorimetrische substraten en de pH van de buffer naar het substraat die zal worden gebruikt: pH 7,5 voor de bereiding van CPRG of X-Gluc, pH 9 MC en pH 7 voor X-InP.
- Bereid voorraadoplossingen van de substraten in de pH HEPES buffer bij concentraties van 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Bescherm de voorraad oplossingen van licht.
- Plaats de μPADs in een steriele petrischaal, dan verankeren de μPAD microspot met 24 pi van elk substraat voorraad oplossing.
4. Detectie en Data-analyse
- Opsporing
- Voeg 6 pl van het verrijkte monster elke passende μPAD microspot in een petrischaal.
- Plaats het deksel terug op de petrischaal en verzegelt het met Parafilm.
- Incubeer het monsterde μPAD bij 37 ° C gedurende maximaal 3 uur om voor kleurontwikkeling en drogen van de microspots.
- Visueel onderzoek van de resultaten
- Voer detectie door een eenvoudige visuele inspectie van de kleurveranderingen van de μPADs.
OPMERKING: Typisch, sterke reacties die definitief kleurveranderingen te produceren naar verwachting volgende 18-24 uur van verrijking, die moet voorkomen de noodzaak van verdere verduidelijking en moeten positief worden beschouwd. - Bepaal de aanwezigheid van een E. coli positief monster door het observeren microspots ingebed met CPRG verandering van geel naar rood-violet en microspots ingebed met X-Gluc verandering van kleurloos naar blauw-groen.
- Bepaal de aanwezigheid van L. monocytogenes positief monster door het observeren microspots ingebed met X-InP verandering van kleurloos tot indigo.
- Bepaal de aanwezigheid van een Salmonella spp. positief monster door het observeren microspots ingebed met MC verandering van colorless tot paars-mauve.
- Voer detectie door een eenvoudige visuele inspectie van de kleurveranderingen van de μPADs.
- Software Aided Data Analysis
OPMERKING: Uitgevoerd duidelijk bepalen of zwakke reacties positief of negatief en een semi-kwantitatieve analyse van de resultaten mogelijk.- Laat de μPADs volledig droog.
- Scan de μPAD met een flatbedscanner.
- Gebruik ImageJ software om de afbeelding te verwerken.
- "Open" gescande afbeelding in ImageJ zich onder het "Bestand" tab in het hoofdmenu (of druk op "Clt + O") te analyseren.
- Keer het beeld "omkeren" onder het tabblad "Bewerken" in het hoofdmenu (of druk op "Clt + Shift + I") te selecteren.
- Gebruik de "Analyze" tab in het hoofdmenu en selecteer "Set Metingen ..." om de gerapporteerde metingen onderzocht selecteren.
- Zorg ervoor dat de "Mean grijze intensiteit," "Beperk tot drempel," en "Display label" dozen zijngecontroleerd, en druk op "OK." Dit stelt hoe de software analyseert elke geselecteerde gebied en hoe wordt deze gemeld.
- Gebruik de "Oval" tool om een cirkel die het gebied dat u wilt binnen meten contouren tekenen.
- Onder de tab "Analyze" selecteer "Measure" (of druk op "Clt + M"). De software zal de gemiddelde grijze intensiteit te meten binnen het gebied gedefinieerd en rapporteren in een pop-up scherm dat kan worden gekopieerd en geplakt naar Excel voor verdere analyse.
Opmerking: Voor nauwkeurigere analyses ten minste twee technische replicaten van elk monster moet worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in dit protocol, kan de concentratie van bacteriën met behulp van de MMS (figuur 1) worden uitgevoerd binnen ongeveer 15-20 minuten. De MMS in opgebouwd uit acrylonitril-butadieen-styreen (ABS) in twee afzonderlijke componenten; een deksel en een patroon beide met een geïntegreerde spigot samenstel waarin een cilindrische kaasdoek wattenstaafje wordt geplaatst (figuur 1A). Beide componenten worden dan geschroefd tezamen de MMS (Figuur 1B). MMS-gebaseerde verwerking wordt aangedreven door een batterij-aangedreven slangenpomp, waardoor monsters moet worden geconcentreerd in lokale instellingen. Door de koppeling van MMS concentratie, selectieve verrijkingen (18-24 uur), en μPADs; agrarische water kan snel (ongeveer 24 uur) zijn, gemakkelijk, en goedkoop gescreend op belangrijke pathogenen en indicator micro-organismen, met inbegrip van E. coli, Salmonella spp. en L. monocytogenes. Met dit protocol kunnen deze doelbacteriën te detecterened op een niveau zo laag als 0,1 CFU / ml. De μPAD assays zijn gebaseerd op de detectie van bacteriën indicatieve enzymen die reageren met colorimetrische substraten (figuur 2). Assays detecteren E. coli, maar niet E. coli O157: H7, produceren een blauw-groen product (Figuur 2A). Ook de bepaling dat een meerderheid van E. detecteert coli stammen produceert een rood-violet reactieproduct (figuur 2B). Assays detecteren Salmonella spp. (Figuur 2C) en L. monocytogenes (figuur 2D) purper-mauve en indigo kleuren, respectievelijk. De test kan worden geïnterpreteerd door het oog (kwalitatief), en visuele uitspraken zijn meestal voldoende voor het onderscheid tussen positieve en negatieve monsters. Als alternatief kan gedigitaliseerde beelden worden gemanipuleerd met ImageJ software (figuur 3A) om te zorgen voor meer objectieve en gestandaardiseerde interpretatie van gegevens (Figuur 3B).
Figuur 1. Het Modified Moore zwabber (MMS) cassette. (A) De gedemonteerde MMS. De MMS wordt geproduceerd in een 3-D printer van acrylonitril-butadieen-styreen (ABS) en bestaat uit drie hoofdonderdelen: een cartridge met een ingebouwde spie vergadering waarin een cilindrische kaasdoek wattenstaafje (gevouwen 4-laags) is geplaatst en wordt afgedekt met een deksel met een geïntegreerde spie montage. (B) De geassembleerde MMS.
Figuur 2. Bacteriën-indicatief colorimetrische reacties. Substrates (X-Gluc, CPRG, MC, en X-InP) ingebed in de microspots van de μPADs reageren met bacteriën-indicatieve enzymen (&# 946;-glucuronidase, β-galactosidase, C8-esterase en PI-PLC) een colorimetrische veranderingen. (A) X-Gluc Een positieve reactie is een indicatie van generieke E. coli, maar niet E. coli O157: H7; (B) een positieve CPRG reactie is een indicatie dat E. coli aanwezig zijn; (C) een positieve MC reactie duidt op de aanwezigheid van Salmonella spp.; (D) en X-InP een positieve reactie op de aanwezigheid van L. monocytogenes.
.. Figuur 3 Visuele en ImageJ analyses van de bacterie-indicatieve colorimetrische μPAD proeven A toont gedigitaliseerde colorimetrische beelden voor elke test met zowel een negatieve (-) en positieve (+)-test. Negatieve testen werden uitgevoerd met lysaten van bacteriële species dat niet het doelwit enzymen en positieve tests coderen met lysaten of verrijkingen van de doelbacteriën. (1) Ongewijzigde gescande afbeeldingen. (2) Gescande afbeeldingen omgezet naar greyscale behulp ImageJ software, en (3) kleur omgekeerd beelden voor latere interpretatie van grijs intensiteit. (4) Gemiddeld grijs intensiteit gemeten met ImageJ binnen elk microspot de μPAD (voorbeeld microspot wordt aangegeven door de gele pijl en cirkel). B toont de gemiddelde grijswaarde intensiteiten (bepaald volgens ImageJ) per colorimetrische μPAD positieve en negatieve test. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een geïntegreerde werkwijze voor het detecteren E. coli, Salmonella spp. en L. monocytogenes in landbouwproducten water. Hier, MMS concentratie van de bacteriën uit grote volumes (10 L), van de landbouw water, is gekoppeld met bacteriële verrijking, en bacteriële-indicatieve colorimetrische detectie met behulp μPADs. De MMS procedure kan omgaan met hoge deeltjes gehalte in het water monsters terwijl concentreren van de bacteriën 10-voudig, is robuust en eenvoudig genoeg voor veldtoepassingen door minimaal opgeleid personeel, en kan worden uitgevoerd met minimale kosten. Door het opnemen van een bacteriële verrijking stap worden levende bacteriën gedetecteerd en de gevoeligheid van de werkwijze is sterk verbeterd. Verrijking versterkt de doelstelling te worden getest, en in combinatie met selectieve groei media, vermindert ongewenste microbiota groei in monsters die kunnen bijdragen tot vals positieve resultaten. Uiteindelijke detectie wordt uitgevoerd met μPADs, waarmee een eenvoudige,kosteneffectief en eenvoudig te gebruiken oplossing interpreteren om het scherm voor belangrijke voedselpathogenen. De gehele procedure, zoals MMS concentratie nachts verrijking en colorimetrische detectie kan worden uitgevoerd binnen een dag, en detecteert bacteriële besmetting op niveaus zo weinig als 0,1 CFU / ml.
Om de werkwijze te vereenvoudigen en de kans op verontreiniging, wordt de MMS als container voor bacteriële verrijking. Deze verrijking Aan de procedure verhoogt de gevoeligheid, specificiteit, voegt flexibiliteit in de werkwijze. Hoewel slechts drie selectieve verrijkingen hier werden gebruikt, kon verbeterd verrijkingen voor de bacteriën worden ontwikkeld. Zo onderzoeken wij de mogelijkheid van het opnemen van specifieke inductoren in de verrijking media om de productie van het reporter enzymen die voor colorimetrische detectie te verbeteren.
De μPADs gebruikt voor detectie van pathogenen zijn eenvoudig te gebruiken enkele plek arrays die kosten zo weinig als $ 0.002/device Vóór de toevoeging van de reporter colorimetrisch substraat. Zelfs boekhouding voor verrijking reagentia en colorimetrische substraten, de kosten van elke test een paar cent, behalve L. monocytogenes test die wordt geschat op $ 1.28/test vanwege de huidige hoge kosten van X-InP. Toch is dit kosten steekt gunstig af bij de huidige detectiemethoden voor voedselpathogenen 6. In hun huidige vorm, moet de μPADs onmiddellijk bereid voorafgaand aan het testen als gevolg van slechte stabiliteit substraat. Om deze beperking te overwinnen, testen we de toevoeging van stabiliserende additieven en evalueren droge opslag aan substraat / μPAD houdbaarheid te verhogen. Daarnaast ontwikkelen we multiplex μPADs gebruik van meerdere monster / reagens sites door het microfluïdische kanalen met elkaar verbonden.
Ondanks de voordelen die eerder beschreven voor de μPAD testen, problemen assay specificiteit mogelijk: 1) De reporter enzymen niet exclutend door de doelgroep bacteriën, kan worden vervuild achtergrond microbiota bijdragen tot een vals positief resultaat. 2) Indien donker gekleurde deeltjes volhardt in de verrijking media, kan het visuele en ImageJ analyse verduisteren wanneer overgebracht naar de μPAD. 3) De huidige test niet specifiek kunnen detecteren E. coli O157: H7. Derhalve is de werkwijze meer geschikt als een eerste screening test gangmaker voor verdere testen en bevestiging te worden uitgevoerd. Desalniettemin zijn veel van deze tekortkomingen gemakkelijk aangepakt. Het opnemen van een groter panel van indicatieve colorimetrische substraten maakt een meer precieze bepaling van het doel bacterie, waaronder E. coli O157: H7. Evenzo zouden aanvullende selectieve verrijking procedures de verontreinigende microbiota in de steekproef te minimaliseren. Om het effect van deeltjes in verrijkingen verminderen, kan een grof filter worden gebruikt voor het aanbrengen monsters naar de μPAD.
Tot slot, this studie toont aan dat de MMS combinatie met verrijking en μPADs kunnen worden gebruikt om lage niveaus van E. detecteren coli, Salmonella spp. en L. monocytogenes in landbouwproducten water. Met kleine aanpassingen procedure is draagbaar en kan in veld instellingen worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 x 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10 ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , Administration USFaD. (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. , WO2012125781 A3 (2012).
- T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).
