Abstract
Dieses Protokoll beschreibt schnellen kolorimetrischen Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser. Hier wird das Wasser durch sterile Tupfer Modified Moore (MMS), die eine einfache Gewebefilter in einem geschlossenen Kunststoffpatrone aus filtriert, um Bakterien zu konzentrieren. Nach der Filtration sind nicht-selektive oder selektive Anreicherungen für die Ziel Bakterien in der MMS durchgeführt. Zum kolorimetrischen Nachweis der Target-Bakterien sind die Anreicherungen dann unter Verwendung von Papier-basierten Analysevorrichtungen (μPADs) mit Bakterien-Richt Substrate eingebettet getestet. Jedes Substrat reagiert mit dem Ziel anzeigenden bakteriellen Enzymen, die Erzeugung farbigen Produkte auf dem μPAD visuell (qualitativer Nachweis) detektiert werden kann. Alternativ können digitale Bilder der umgesetzten μPADs mit gemeinsamen Scannen oder fotografische Geräte erzeugt und mit ImageJ-Software, al analysiert werdengende für mehr objektive und standardisierte Interpretation der Ergebnisse. Obwohl die biochemischen Screening-Verfahren wurden entwickelt, um die oben genannten bakteriellen Krankheitserregern zu identifizieren, kann in einigen Fällen durch Enzyme Hintergrund Mikrobiota oder den Abbau der farbmetrischen Substraten ein falsch positives zu produzieren. Daher Bestätigung mit einem diskriminierender Diagnose erforderlich ist. Dennoch ist diese Bakterienkonzentration und Detektionsplattform preiswerte, empfindliche (0,1 CFU / ml Nachweisgrenze), leicht durchzuführen und eine schnelle (Konzentration, Anreicherung und Nachweis innerhalb von etwa 24 Stunden durchgeführt wird), rechtfertigen ihre Verwendung als ein Anfangsscreeningverfahren für die mikrobiologische Qualität der landwirtschaftlichen Wasser.
Introduction
Es ist wichtig, dass lebensmittelbedingten Krankheitserreger schnell und vorzugsweise im Bereich der Basis-Einstellungen, um die Belastung der Lebensmittelerkrankungen reduzieren erkannt. Gemeinsame Strategien, um lebensmittelbedingten bakteriellen Krankheitserregern erkennen sind biochemische Profiling, selektiven und differentiellen Kultivierung, Isolierung und immunologische Nachweis und molekulare Erkennung. Allerdings sind diese Methoden durch sporadische Kontamination behindert, getestet kleinen Stichproben, die oft geringen Konzentrationen der lebensmittelbedingten pathogenen Bakterien, lange Bearbeitungszeiten, und / oder sind nicht für Feldeinstellungen. Ferner können Verbindungen, in vielen Nahrungs Matrizen hemmend Erkennung und Diagnostik. Um die Wahrscheinlichkeit von mikrobiellen Erkennung verbessern, hat die US-amerikanischen Food and Drug Administration vorgeschlagen, dass die Prüfung der landwirtschaftlichen Wasser (wie z. B. Waschwasser und Bewässerung), die entweder in Kontakt mit einer großen Oberfläche von frischen Produkten oder dient als Vehikel produce Kontamination ist eine praktikable Alternative zur direkten Prüfung von Lebensmitteln ein. Auch so macht der oft geringen natürlichen Erreger-Belastung verbunden mit der Verdünnungseffekt des repräsentativen landwirtschaftlichen Wasserprobe Probenvorbereitungsverfahren für Erreger-Konzentration wesentlich. Ein solches Verfahren würde erfordern Abtasten großer Wassermengen (≥ 10 L), angemessene pathogen-Konzentration und Kompatibilität mit nachgeschalteter Nachweisstrategien.
Geändert Moore Tupfer (MMS) sind preiswert, einfach und robuste Geräte für die Konzentration von Bakterien große Mengen (≥ 10 l) Wasser 2-4 verwendet. Der MMS besteht aus einer Kunststoffkassette mit Gaze, die als Grobfilter für große Wassermengen durch die Kassette unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe gepumpt dient gefüllt. Die MMS ist eine nicht-diskriminierende Methode der Bakterienkonzentration (≥ 10 fache Konzentration), die organischen und anorganischen Partikelmaterial erfasst einschließlich Mikroorganismen in verarbeiteten liquid Proben. Es ist wahrscheinlich, dass die ausgezeichnete Wirksamkeit der Konzentration der Ziel-Mikroorganismen durch den MMS kann durch die Tatsache, dass Mikroorganismen sollen zu dem Schluff-Lehm-Fraktion oder organische Mikroaggregate der suspendierten Feststoffe 3 befestigt werden erläutert. Das robuste Design des MMS können für die Überwindung meisten Mängel mit anderen Filtrationsverfahren für die Erfassung und Konzentration von Bakterien aus Wasser, wie das Verstopfen von Filtern, die Unfähigkeit, große Mengen zu verarbeiten, Filterproben mit hoher Trübung und hohen Kosten verbunden. Aus diesen Gründen wird die FDA empfiehlt, dass die MMS in offiziellen Verfahren für Umwelt-und produzieren bezogenen Probensammelverfahren 5 eingearbeitet werden.
Hier wird ein Verfahren zur Konzentration, Anreicherung und den Nachweis von Escherichia coli, Salmonella spp. Und Listeria monocytogenes aus landwirtschaftlichen Wasser beschrieben. Eine MMS ist für die Konzentration von bact verwendetEria, und dient auch als Behälter für die selektive oder nicht selektive Bakterienanreicherung. Nachweis von Bakterien biochemisch mit Papier-basierten Analysegeräte (μPADs) 6 gelöst. μPADs als fluidische Netzwerke oder Spot-Tests mit einer Vielzahl von Verfahren der Photolithographie, Tintenstrahldruck, Stanz-, und Wachsdruck 7-11 hergestellt werden. Beispiele von Fluid Motive können dendritische Kanalmuster, wo die Probe in der Mitte abgeschieden und fließt anschließend zu dem distalen Reservoirs oder Einzelkanalmuster in der die Probe oder das Substrat von der äußeren Reservoirs der Kanal durch Kapillarwirkung in der Mitte 12 herausgezogen werden. Aus diesem Protokoll, die wir gewählt haben, um für 7-mm-Durchmesser Wachs-Papier-Spot-Arrays mit chromogenen Substraten eingebettet, die durch Enzyme, die auf den hier getesteten Mikroorganismen verarbeitet werden können, beschäftigen: Chlorphenolrot β-D-galactopyranosid (CPRG) und 5 - Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc)für den Nachweis von β-Galactosidase und β-Glucuronidase von E. hergestellt coli; 5-Brom-6-chlor-3-indolyl Caprylat (magenta Caprylat) zum Nachweis von C8-Esterase von Salmonella spp. und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-myo-inositol-phosphat (X-InP) für die Detektion von Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) von L. hergestellt monocytogenes-6. Somit kann das Vorhandensein eines bestimmten Bakteriums visuell ohne die Notwendigkeit für komplexe Anlagen oder die Interpretation der Daten zu beobachten. Die Spezifität und Sensitivität der Enzymbasis μPAD kolorimetrischen Detektion dieser spezifischen Zielbakterien zuvor erforscht worden 6. Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit der integrierten Konzentrationsnachweisverfahren für diese Zielbakterien durch Aufstocken von großen Volumina von Wasser mit vorbestimmten Mengen an Mikroorganismen (unveröffentlichte Daten und Bisha et al. 13) ausgewertet.
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Protocol
1. Konzentration der Bakterien aus großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser Mit MMS
- MMS Vorbereitung
- Schneiden Sie einen rechteckigen Querschnitt von 4-lagige Gaze 40 x 12 cm.
- Falten Sie die Gaze an beiden Achsen, um ein Rechteck von 20 x 6 cm erhalten.
- Rollen Sie die Gaze dicht entlang seiner Längsachse um einen zylindrischen Tupfer von ca. 6 cm hoch und 3 cm im Durchmesser bilden.
- Autoklavieren die Gaze Tupfer in Aluminium-Folie, nicht die Kassette im Autoklaven. Dekontaminieren Kassette durch Eintauchen für 30 min in 10% Haushaltsbleichmittel, und Deaktivieren des restlichen Chlors durch Einweichen der Kassette für 15 min in einer Natriumthiosulfat-Pentahydrat (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O)-Lösung (50 mg / L in sterilem Wasser).
- Legen Sie den Tupfer in die MMS-Kassette.
HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, mit einem 4-Blattlage Gaze beginnen michasuring 80 x 22 cm, falten Sie es auf 40 x 11 cm und rollen Sie es zu einem Zylinder etwa 11 cm hoch und 6 cm im Durchmesser bilden. - Montieren Sie die MMS.
- Bringen Vinylschlauch mit Zapfen auf beiden Seiten der MMS, die Gewährleistung der Schlauch voll haftet an den Zapfen, und fixieren Schlauch in die Schlauchpumpe. Sicherzustellen, dass die Rohrleitung stromaufwärts von der peristaltischen Pumpe eine ausreichende Länge für die Probenahme.
- Konzentration der Bakterien
- Probe mindestens 10 l Wasser landwirtschaftlichen indem die peristaltische Pumpe mit hoher Geschwindigkeit.
- Nach Abschluss der Probenahme ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass aus der Wasserprobe und weiter laufen, bis die Pumpe kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS.
- Wenn ein Verteiler wird verwendet, um mehrere Proben gleichzeitig laufen, sammeln das Abwasser von je MMS, und wenn 10 L wird durch eine einzige MMS gefiltert schließen Sie das Ventil für diese bestimmte MMS und weiterlaufen die Pumpe.
- Bei der Beprobung is abgeschlossen ist, ziehen Sie die Schlauchpumpe Einlass von der landwirtschaftlichen Wasser, öffnen alle Ventile des Verteilers und die Pumpe läuft weiter, bis kein Abwasser beobachtet Verlassen des MMS.
- Wenn die Konzentration wurde für alle MMS abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Vinyl-Schläuche von den MMS-Zapfen und der Kappe die Zapfen an beiden Seiten der MMS. Dicht verschlossen MMS kann für bis zu 12 h vor der Zugabe Anreicherungsmedien gespeichert werden.
2. MMS Anreicherung und Probenvorbereitung
- Bereicherung
- Schrauben Sie den Deckel der MMS, und aseptisch 20 ml des geeigneten sterilen Anreicherungsbouillon. Verwenden Sie eine MMS für jede selektive Anreicherung. Alternativ führen eine nicht-selektive Anreicherung, alle drei Zielbakterien in der gleichen Probe zu propagieren.
HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, aseptisch entfernen Gaze-Filter aus der Kassette und legen Sie in einem sterilen Beutel vor Anzeigeding 225 ml des entsprechenden Anreicherungsmedien.- Zur Anreicherung von E. coli, 20 ml gepuffertes Peptonwasser (BPW) mit 8 mg / l Vancomycin-Hydrochlorid ergänzt.
- Zur Anreicherung von Salmonella spp., 20 ml BPW, ergänzt mit der Salmonellen-Ergänzung (4 ml / L).
- Zur Anreicherung von L. monocytogenes, 20 ml VIDAS UP Listeria (LPT) Brühe.
- Für den gleichzeitigen Nicht-selektive Anreicherung für alle drei Mikroorganismen mit Hilfe eines einzigen MMS, Universal Voranreicherung Brühe (UPB).
- Schrauben Sie den Deckel der MMS wieder fest. Stellen Sie sicher, dass die Zapfen sind fest verschlossen, um Verschmutzungen und mögliche Kontamination während der Anreicherung zu vermeiden.
- Die MMS inkubieren bis zu 18-24 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 200 UpM. Verwenden Sie 42 ° C für E. coli und Salmonella spp. selektive Anreicherung. Verwenden Sie 30 ° C für L. monocytogenes selektive Anreicherung und verwenden 37 & #176, C für nicht-selektive Anreicherung.
- Schrauben Sie den Deckel der MMS, und aseptisch 20 ml des geeigneten sterilen Anreicherungsbouillon. Verwenden Sie eine MMS für jede selektive Anreicherung. Alternativ führen eine nicht-selektive Anreicherung, alle drei Zielbakterien in der gleichen Probe zu propagieren.
- Probenvorbereitung
- Wenn Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die MMS aus dem Inkubator, uncap einer der Zapfen, und sanft zu verzichten etwa 0,5 ml in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ lösen Sie die MMS-und Pipette aus 0,5 ml über Nacht Bereicherung.
HINWEIS: Wenn die nicht-Wegwerf-Version des MMS-Kassette verwendet wird, pipettiert 0,5 ml der Anreicherung aus der Tasche. - Für farbmetrische Analyse von E. coli selektive Anreicherung oder für die Analyse von nicht-selektiven Anreicherung, beschallen 0,5 ml Anreicherungs bei 5 W, 22 kHz für 20 sec unter Verwendung einer Ultraschallsonde.
- Wenn Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die MMS aus dem Inkubator, uncap einer der Zapfen, und sanft zu verzichten etwa 0,5 ml in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ lösen Sie die MMS-und Pipette aus 0,5 ml über Nacht Bereicherung.
3. Vorbereitung und Einbetten von Farbmetrische Substrate in μPADs
- Vorbereitung genug μPADs für jede Probe und Ziel getestet. Um zu erkennen, E. coli vorzubereiten CPRG und X-Gluc μPADs, Salmonella spp. Erkennung vorzubereiten MC μPADs und für L. monocytogenes Erkennung bereiten X-InP μPADs.
- Vorbereitung HEPES-Puffer [0,1 M HEPES mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)] für die kolorimetrische Substrate und der pH-Wert des Puffers nach dem Substrat, die gehen, verwendet werden: pH 7,5 für die Herstellung von CPRG oder X-Gluc, pH 9 für MC und pH 7 für X-InP.
- Stammlösungen der Substrate im pH HEPES-Puffer bei Konzentrationen von 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Schützen Sie die Stammlösungen aus Licht.
- Legen Sie die μPADs in einer sterilen Petrischale, die dann einbetten μPAD Mikrospots mit 24 ul jedes Substrat-Stammlösung.
4. Erkennung und Datenanalyse
- Entdeckung
- In 6 ul der Probe angereichert mit jedem geeigneten μPAD Mikrospots in einer Petrischale enthalten.
- Legen Sie die Abdeckung wieder auf die Petrischale und verschließen Sie diese mit Parafilm.
- Inkubierenmit der μPAD bei 37 ° C für 3 h bis zur Farbentwicklung und Trocknung der Mikrospots zu ermöglichen.
- Visuelle Prüfung der Ergebnisse
- Führen Erfassung durch einfache visuelle Prüfung der Farbänderungen der μPADs.
HINWEIS: In der Regel sind starke Reaktionen, die endgültige Farbveränderungen erzeugen nach 18-24 Stunden der Bereicherung, die die Notwendigkeit zur weiteren Klärung zu vermeiden sollte und was als positiv erwartet. - Bestimmung der Anwesenheit eines E. coli positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit CPRG Umschlag von gelb nach rot-violett und Mikrospots mit X-Gluc Umschlag von farblos nach blau-grün eingebettet eingebettet.
- Bestimmen Sie die Anwesenheit eines L. monocytogenes-positiven Probe durch Beobachtung Mikrospots mit X-InP Umschlag von farblos nach indigo eingebettet.
- Bestimmung der Gegenwart von Salmonella spp. positive Probe durch Beobachtung Mikrospots mit MC Wechsel von col eingebettetorless bis violett-lila.
- Führen Erfassung durch einfache visuelle Prüfung der Farbänderungen der μPADs.
- Aided Software Data Analysis
HINWEIS: geführt, um eindeutig festzustellen, ob schwache Reaktionen positiv oder negativ sind und eine semi-quantitative Analyse der Ergebnisse zu ermöglichen.- Lassen Sie die μPADs vollständig trocken.
- Scannen Sie den μPAD mit einem Flachbett-Scanner.
- Verwenden Sie ImageJ-Software, um das Bild zu verarbeiten.
- "Öffnen", um das gescannte Bild in ImageJ unter dem Reiter "Datei" im Hauptmenü (oder drücken Sie "Clt + O") befindet analysiert werden.
- Kehren Sie die Bildauswahl "Invert" unter der Registerkarte "Bearbeiten" im Hauptmenü befindet (oder drücken Sie "Clt + Shift + I").
- Verwenden Sie die Registerkarte "Analysieren" im Hauptmenü und wählen Sie "Set Maße ...", um die gemeldeten Messungen analysiert auswählen.
- Stellen Sie sicher, dass die "mittlere Intensität grau", "Limit to Schwelle" und "Display Label"-Boxen sindüberprüft, und drücken Sie "OK". Dieser legt fest, wie die Software analysiert jedes Bereich ausgewählt und wie sie es Berichte.
- Verwenden Sie das "Oval"-Tool, um einen Kreis, der den Bereich, den Sie innerhalb messen wollen skizziert ziehen.
- Unter dem Reiter "Analyze" wählen Sie "Measure" (oder drücken Sie "Clt + M"). Die Software wird die durchschnittliche Grauintensität innerhalb des definierten Bereiches messen und es in einem Pop-up-Bildschirm, kopiert und zur weiteren Analyse übertreffen werden.
HINWEIS: Für eine genauere Analyse, zumindest zwei technische Replikate von jeder Probe durchgeführt werden sollte.
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Representative Results
Wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Konzentration der Bakterien unter Verwendung der MMS (Fig. 1) innerhalb von ca. 15-20 Minuten durchgeführt werden. Die MMS aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) in zwei getrennten Komponenten aufgebaut ist; einen Deckel und eine Kassette sowohl mit einem integrierten Zapfhahnanordnung in die ein zylindrischer Gaze Tupfer eingeführt wird (Fig. 1A). Beide Komponenten werden dann zusammengeschraubt, welche die MMS (Abbildung 1B). MMS-basierte Verarbeitung wird durch eine batteriebetriebene peristaltische Pumpe angetrieben wird, so dass für Proben, die in Feldeinstellungen konzentriert werden. Durch die Kopplung von MMS-Konzentration, selektiven Anreicherungen (18-24 h) und μPADs; Agrar Wasser kann schnell (ca. 24 Std.) sein, einfach und billig für wichtige Krankheitserregern und Indikator Mikroorganismen, einschließlich E. abgeschirmt coli, Salmonella spp., und L. monocytogenes. Bei diesem Protokoll werden diese Zielbakterien zu detektieren könnened in Konzentrationen so niedrig wie 0,1 CFU / ml. Die μPAD Assays basieren auf der Detektion von Bakterien-Enzyme, die anzeigt (Fig. 2) mit kolorimetrischen Substraten reagieren basiert. Assays Nachweis von E. coli, aber nicht E. coli O157: H7, produzieren eine blau-grüne Produkt (2A). Auch der Test, der eine Mehrheit von E. erkennt coli-Stämmen erzeugt eine rot-violette Reaktionsprodukt (2B). Assays Nachweis von Salmonella spp. (Fig. 2C) und L. monocytogenes (2D) purpurrot-lila und indigo Farben auf. Der Test kann mit dem Auge (qualitativ) interpretiert werden, und visuelle Beurteilungen sind in der Regel für die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben zufriedenstellend. Alternativ können digitalisierte Bilder mit ImageJ Software (3A), die für mehr objektive und standardisierte Dateninterpretation (3B) ermöglichen, manipuliert werden.
Abbildung 1. Swab Der modifizierte Moore (MMS) Kassette. (A) Die demontierten MMS. Die MMS ist in einem 3-D-Drucker aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) hergestellt und besteht aus drei Hauptkomponenten: Eine Kassette mit eingebautem Zapfhahnanordnung in die ein zylindrischer Gaze Tupfer (4-lagig gefaltet) eingesetzt ist und mit einem verkappten Deckel mit einem integrierten Zapfhahnanordnung. (B) Die versammelten MMS.
2. Bakterien-Richt kolorimetrischen Reaktionen. Substrate (X-Gluc, CPRG, MC, und X-InP) in den Mikrospots der μPADs eingebettet reagieren mit Bakterien-Richt Enzyme (&# 946;-Glucuronidase, β-Galactosidase, C8-Esterase-und PI-PLC), um eine farbmetrische Veränderung zu erzeugen. (A) eine positive X-Gluc-Reaktion ist ein Anzeichen für generische E. coli, aber nicht E. coli O157: H7; (B) eine positive Reaktion CPRG ist eine Anzeige, daß E. coli vorhanden sind; (C) eine positive Reaktion MC zeigt das Vorhandensein von Salmonella spp. (D) und eine positive X-InP-Reaktion zeigt die Anwesenheit von L. monocytogenes.
.. Abbildung 3 Visuelle und ImageJ analysiert der Bakterien-Richtfarbmetrischen Tests μPAD A zeigt digitalisierte farbmetrische Bilder für jeden Test sowohl mit einem negativen (-) und positiven (+)-Test. Negative Tests wurden unter Verwendung von bakteriellen Lysaten Spezidass es nicht die Zielenzyme und positive Tests zu kodieren mit Lysaten oder Anreicherungen der Zielbakterien. (1) Nicht modifizierte gescannte Bilder. (2) Die gescannten Bilder in Graustufen umgewandelt mit ImageJ-Software, und (3) Farbe invertiert Bilder für die spätere Interpretation der Grauintensität. (4) Durchschnittsgrauintensität gemessen mit ImageJ in jedem Mikrospots der μPAD (ein Beispiel Mikrospots wird durch die gelbe Pfeil und Kreis angedeutet). B zeigt die durchschnittlichen Grau Intensitäten (von ImageJ bestimmt) für jedes farbmetrischen μPAD positiven und negativen Test. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein integriertes Verfahren zur Detektion von E. coli, Salmonella spp., und L. monocytogenes in landwirtschaftlichen Wasser. Hier MMS Bakterienkonzentration aus großen Volumina (10 l) der landwirtschaftlichen Wasser wird mit Bakterienanreicherung gekoppelt und gegen Bakterien anzeigt colorimetrische Detektion mit μPADs. Der MMS-Verfahren mit hoher Partikelgehalt in den Wasserproben zu bewältigen, während die Konzentration der Bakterien 10-fach, ist robust und einfach genug für den Feldeinsatz durch minimal geschultes Personal, und kann mit geringen Kosten durchgeführt werden. Durch Einbringen eines bakteriellen Anreicherungsschritt werden lebende Bakterien detektiert und die Empfindlichkeit des Verfahrens stark verbessert wird. Enrichment verstärkt das Ziel, die untersucht werden, und wenn es mit selektiven Wachstumsmedien kombiniert, reduziert unerwünschte Mikrobiota Wachstum in Proben, die zu falsch positiven Ergebnissen beitragen könnten. Abschlusserfassungs mit μPADs, die eine einfache bereitzustellen geführt,kostengünstig und einfach zu interpretieren, um Lösung für wichtige lebensmittelbedingten Krankheitserreger zu untersuchen. Das gesamte Verfahren, einschließlich MMS-Konzentration über Nacht Anreicherung, und colorimetrische Detektion kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden, und erfasst eine bakterielle Verunreinigung in Mengen so wenig wie 0,1 CFU / ml.
Zur Vereinfachung des Verfahrens und die Möglichkeit der Kontamination zu reduzieren, wird die MMS als Behälter für Bakterienanreicherung verwendet. Das Hinzufügen dieser Bereicherung des Verfahrens erhöht die Sensitivität, Spezifität, erhöht die Flexibilität in der Methode. Obwohl nur drei selektive Anreicherungen wurden hier verwendet wird, könnte verbessert Bereicherungen für die Bakterien entwickelt werden. Zum Beispiel werden wir die Möglichkeit der Übernahme spezifischer Induktoren in die Anreicherungsmedien, um die Produktion der Reporterenzyme für kolorimetrische Detektion verwendet zu verbessern.
Die für die Erregernachweis verwendet μPADs sind einfach zu bedien einzigen Spot-Arrays, die kosten so wenig wie $ 0.002/device Vor der Zugabe des kolorimetrischen Reportersubstrat. Selbst wenn man für die Anreicherung Reagenzien und farbmetrische Substrate, sind die Kosten für jeden Test ein paar Cent, mit Ausnahme der L. monocytogenes-Test, der bei $ 1.28/test aufgrund der derzeit hohen Kosten der X-InP geschätzt wird. Dennoch vergleicht diese Kosten günstig zu aktuellen Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern 6. In ihrer derzeitigen Form, die μPADs muss unmittelbar vor der Prüfung aufgrund der schlechten Stabilität Substrat hergestellt werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, testen wir die Zugabe von stabilisierenden Zusätzen und Auswertung trockene Lagerung zu Substrat / μPAD Haltbarkeit zu erhöhen. Darüber hinaus entwickeln wir μPADs Multiplex mit mehreren Proben / Reagenz-Sites, die miteinander durch mikrofluidische Kanäle verbunden.
Trotz der Vorteile, die zuvor für die μPAD Tests ausführlich, sind Probleme, mit Assay-Spezifität möglich: 1) Die Reporterenzyme sind nicht ausschließlichlich von den Ziel Bakterien hergestellt wird, kann dadurch eine Verunreinigung Hintergrund Mikrobiota zu einem falsch positiven Ergebnis beitragen. 2) Wenn dunkel gefärbten Partikel bleibt in der Anreicherungsmedien, kann es visuelle und ImageJ Analyse verschleiern, wenn sie der μPAD übertragen. 3) Der aktuelle Test kann E. nicht spezifisch nachzuweisen coli O157: H7. Folglich ist die Methode besser geeignet als ein Anfangs Screening-Test, Impulse für die weitere Prüfung und Bestätigung durchgeführt werden. Dennoch sind viele dieser Mängel sind leicht gerichtet. Die Aufnahme einer größeren Gruppe von Richt kolorimetrischen Substrate wäre für eine genauere Bestimmung der Zielbakterium, einschließlich E. erlauben coli O157: H7. Ebenso könnte zusätzliche selektive Anreicherungsverfahren die kontaminierenden Mikrobiota in der Probe zu minimieren. Um die Auswirkung der Partikel Anreicherungen zu verringern, könnte ein Grobfilter vor dem Aufbringen der Proben auf μPAD verwendet werden.
Abschließend this Studie zeigt, dass die MMS kombiniert mit Anreicherung und μPADs kann verwendet werden, um geringe Mengen an E. nachzuweisen coli, Salmonella spp. und L. monocytogenes in landwirtschaftlichen Wasser. Mit einigen Modifikationen, ist das Verfahren, tragbar und in der Lage, im Bereich Einstellungen angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 x 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10 ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
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