Summary
Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en snabb, billig strategi för noggranna masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik. Här visar vi en robust metod för beredning och analys av proteinblandningar med hjälp av redi strategi som kan tillämpas på nästan alla prov typ.
Abstract
Stabil isotopmärkning av peptider genom reduktiv dimetylering (redi märkning) är en metod att exakt kvantifiera proteinuttrycksskillnader mellan prover med masspektrometri. Redi märkning utförs med antingen vanlig (ljus) eller deutererade (tunga) former av formaldehyd och natriumcyanoborhydrid att lägga två metylgrupper till varje fri amin. Här visar vi en robust protokoll för redi märkning och kvantitativ jämförelse av komplexa proteinblandningar. Protein prover för jämförelse smälts in i peptider, märkt att bära antingen lätta eller tunga metyl-taggar, blandade, och co-analyseras av LC-MS/MS. Relativa protein abundances kvantifieras genom att jämföra jonkromatogram toppytorna för tunga och lätta märkta versioner av drifts peptiden extraheras från hela MS-spektra. Metoden som beskrivs här innefattar provberedning genom omvänd fas-fast fas-extraktion, i kolonnen Redi märkning av peptider, peptid fraktionering med basiskt pH reversed-fas (BPRP) kromatografi och StageTip peptidrening. Vi diskuterar fördelar och begränsningar med Redi märkning med avseende på andra metoder för stabila isotopen inkorporering. Vi belyser nya applikationer med hjälp Redi märkning som en snabb, billig och säker metod för att jämföra protein abundances i nästan alla typer av prov.
Introduction
Att mäta koncentrationsskillnader av många proteiner mellan komplexa prover är en central utmaning i proteomik. Alltmer, detta görs genom att märka proteiner i varje prov med olika isotop-taggar, som kombinerar proverna, och med hjälp av masspektrometri för att kvantifiera skillnaderna koncentrations. Det finns flera metoder för stabil isotopisk märkning av proteiner och peptider. 15 N märkning 1 och SILAC 2 införa isotopmarkörer metaboliskt in vivo, medan ICAT 3, iTRAQ 4, och reduktion dimetylering 5 lägga stabila isotoptaggar efter proteinextraktion och matsmältning. Bland dessa metoder är reduktiv dimetylering (redi märkning) ökar i popularitet som en billig och reproducerbar metod för att kvantifiera proteinkoncentrations skillnader i nästan alla typer av prov.
Redi märkning involverar reagerande peptider med formaldehyd för att bilda en Schiffsk bas, som därefter reducerasav cyanoborhydrid. Denna reaktion dimethylates fria aminogrupper på N-terminalen och lysinsidokedjor och monomethylates N-terminal proliner. Protokollet som beskrivs här metylerar peptider i prov 1 med en "lätt" etikett med reagenser med väteatomer i sin naturliga utbredning isotop-och prov 2 med en "tung" etikett med deutererad formaldehyd och cyanborhydrid (figur 1). Varje dimetylerade aminogrupp på en peptid resulterar i en massa skillnad på 6,0377 Da mellan lätta och tunga former, som används för att skilja mellan de två formerna med hjälp av en masspektrometer. Närmare bestämt är de relativa peptid abundances kvantifierats som förhållandet MS1 extraherade jonkromatogram utrymmen (MS1 topparea-förhållande) av lätt och tung version för varje peptid jonpar. Den relativa förekomsten av ett protein beräknas som median MS1 toppareaförhållandet mellan alla peptider i proteinet. I denna rapport beskriver vi ett robust protokoll för uppförandeing Redi märkningsexperiment genom LC-MS/MS som inkluderar omvänd fas peptid fastfasextraktion, on-column Redi märkning, peptid fraktionering med basiskt pH med omvänd fas (BPRP) kromatografi och rening av peptidblandningar med användning StageTips (Figur 2) . Vi diskuterar fördelar och begränsningar med att använda Redi märkning av kvantitativa proteomik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Denna metod har tidigare beskrivits 12.
1. Protein Isolering
Bered en mg cellulärt protein genom att lysera cellerna, företrädesvis genom fysikaliska metoder såsom fransk press, bead stryk eller sonikering. Undvik lysozym-medierad cell-lys, eftersom enzymet kommer att förbrylla mätningar masspektrometri.
2. TCA-utfällning av proteiner
Lägg till en volym triklorättiksyra (TCA) till 4 volymer protein och kyla på is under 10 min för att fälla ut proteiner. Centrifugera vid 12.000 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten i 1 ml iskall aceton och centrifugera vid 12.000 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och invertera röret på bänken för att torka pelleten i 15 min. Butiksprotein pellets vid -80 ° C.
3. Denaturera proteiner och minska disulfidbindningar
Resuspendera proteiner till ~ 2 mg / ml i 500 | il denaturering och buffert reduktion (antingen 4 M urea eller 3% SDS i 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Eventuellt innefattar en proteasinhibitor i bufferten. Inkubera proteiner i 30 minuter vid 56 ° C, följt av 10 minuter vid rumstemperatur.
4. Aklylate fria sulfhydrylgrupper att Irreversibelt Disrupt disulfidbindningsbildning
Bered en färsk 0,3 M jodacetamid i vatten. VARNING! Jodacetamid är mycket giftigt. Tillsätt 25 | il 0,3 M jodacetamid (15 mM slutlig koncentration) till 500 | il protein och inkubera i 20 minuter i mörker vid rumstemperatur. Släck jodacetamid genom tillsats 10 ^ il (5 mM slutlig DTT-koncentration) och 300 mM DTT. Förvara alkylerade proteiner vid -80 ° C.
5. Protein Digestion
TCA-utfällning av proteiner (såsom beskrivits i steg 2) och återsuspendera i 1 ml av 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M urea. Bered en stamlösning av Lysyl endoproteinase (Lys-C) i vatten vid en koncentration av 2 ug / ul och tillsätt 5 pl till proteinlösningen. Inkubera blandningen i 16 h vid rumstemperatur. Se till den slutliga Lys-C-koncentrationen är 10 ng / ul och proteinet till LysC förhållande (vikt / vikt) är 1/50 till 1/200. Resuspendera 20 ug Sequencing Grade trypsin i 40 ul av 50 mM ättiksyra, tillsätt 5 | il (10 | ig trypsin) till Lys-C-digerering, och inkubera under 6 h vid 37 ° C. Använd samma proteaskoncentrationen och proteas-to-protein-förhållanden för Lys-C som användes för trypsin.
6. Omvänd fas Peptide Extraktion
- Surgör peptider genom tillsats av trifluorättiksyra (TFA) till en slutlig koncentration av 0,5% (pH ≈ 2). Bifoga en C18-kolonn till en utvinningskanal. Använd högsta möjliga flöde för alla steg utom lastning och eluering av peptiderna.
- Våt kolonn med 6 ml acetonitril (ACN). Tvätta kolonnen med 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA och sedan ekvilibrera med 6 ml 0,1% TFA. Låt intekolumn för att köra torrt mellan stegen.
- Stoppa vakuumtryck och ladda 500 | ig av peptidema på kolonnen med en flödeshastighet av cirka 1 ml / min. När peptider har bundet till kolonnen, omstart vakuum och tvätta med 6 ml 0,1% TFA och därefter med 3 ml citronsyrabuffert (0,09 M citronsyra, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5).
Obs: Högre peptid mängder kan märkas men C18 kolonn bindande förmåga bör vara minst två gånger högre än peptid mängd för att undvika provförlust.
7. On-kolumn peptid Märkning av Reduktiv dimetylering (Redi Labeling)
Utför detta steg i en kemisk huva som vätecyanid frigörs i låg koncentration under märkningsprocessen.
- Förbered 12 ml av "lätta" och "tunga" redi buffertar för att metylera peptid fria aminer. Ljus redi buffert består av 0,8% formaldehyd och 0,12 M natriumcyanoborhydrid bär väten i thEIR naturliga isotopfördelningar i citronsyrabuffert. Tung redi buffert består av 0,8% deutererad formaldehyd och 0,12 M deutererat natriumcyanoborhydrid i citronsyrabuffert.
- Inkubera kolonn innehållande peptider genom att tillsätta 10 ml, antingen lätt eller tung Redi buffert till de peptidinnehållande kolonnerna vid en flödeshastighet av 1 ml / min och upprepa för att säkerställa fullständig märkning. Tvätta kolonnen med 6 ml 0,1% TFA och därefter med 1 ml 0,5% ättiksyra.
- Stoppa vakuum och eluera märkta peptider först med 1 ml 40% ACN, 0,5% ättiksyra, därefter med 1 ml 80% ACN, 0,5% ättiksyra med användning av en flödeshastighet av cirka 0,5 ml / min. Om du vill kan mäta effektiviteten i enskilda prover märkning av masspektrometri före blandning tunga och lätta prov (se "Representativa resultat"). Blanda 01:01 tunga och lätta märkta peptid prover som skall kvantifieras med masspektrometri.
8. Separat peptidblandning av Basic pH Omvänd fas (BPRP) Kromatografi </ P>
Grund pH omvänd fas (BPRP) kromatografi för att separera peptidblandningen i flera fraktioner, som självständigt analyseras av LC-MS/MS att öka proteome täckning.
- Fraktionera peptidblandningen på en C18-HPLC-kolonn genom att använda en gradient av ökande ACN-koncentration i 10 mM ammonium-bikarbonat (pH 8). Börja med 5% (vol / vol) ACN för 5 min, öka till 35% ACN i 60 min, och sedan till 90% ACN i 1 min. Behåll 90% ACN för 4 min innan minska ACN till 5% att åter jämvikta kolonnen under 9 min. Samla 96 fraktioner av lika volym i en 96-brunnsplatta (A1 till H12). Övervaka fraktionering med hjälp av en UV-detektor vid 220 nm medan peptider eluering från kolonnen (10-70 min för de villkor som beskrivs här).
- Kombinera fraktioner från brunnarna A1, C1, E1, och G1 (fraktion A1), från brunnar B1, D1, F1, och H1 (fraktion B1), från brunnar A2-, C2-, E2-och G2 (fraktion A2) och följaktligen för återstående fraktionerna. Avlägsna solvent med hjälp av en vakuumcentrifug. Resuspendera peptider från fraktioner A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 och B12 i 130 ul av 1 M urea/0.5% TFA och rening med användning StageTips såsom beskrivs i steg 9. Store fraktioner B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 och A12 vid -20 º C.
9. Rena Peptider med stop and go Extraction (StageTips)
Förbered C18-StageTip 7 mikrokolonner genom packning 200 jil pipettspetsar med två C18-skivor med en innerdiameter (ID) av 1,07 mm. Put Stage Tips i Eppendorf-rör. Använd en mikrocentrifug för att tvätta tips med 130 | il metanol, sedan 130 ul 80% ACN, 0,5% ättiksyra. Jämvikta StageTips med 130 l 0,1% TFA. Överför peptidblandningen till StageTips och tvätta med 130 | il 0,1% TFA, därefter 40 | il 0,1% TFA, därefter 40 | il 0,5% ättiksyra. Eluera peptider först med 20 | al 40% ACN, 0,5% ättiksyra, därefter 20 | il 80% ACN, 0,5% ättiksyra. Kombinera eluaten ennd torka genom vakuumfiltrering.
10. Mikrokapillär LC-MS/MS
- Lös peptider i 1-5 | il 5% myrsyra, 5% ACN till en koncentration av approximativt 1 pg / pl. Lös ~ 1 ^ g peptider på en 100 | im x 20 cm C18-omvända HPLC faskolonn med en gradient av 6-22% ACN i 0,125% myrsyra som tillämpas över 75 eller 100 min vid en flödeshastighet av ca 300 nl / min.
- Identifiera peptider genom att använda en LTQ Orbitrap Velos 12 eller liknande vätskekromatografi-masspektrometri plattform med en masspektrometer som ger hög upplösning och hög massnoggrannhet. Använd masspektrometer i databeroende läge med en full MS scan (upplösning på 60.000) förvärvade i Orbitrap analysatorn. Generera linjära jonfälla MS / MS-spektra för de 20 mest förekommande joner upptäckts i hela MS-spektrumet. Ställ in automatisk förstärkningskontroll (AGC) mål till 1 x 10 6 för hela MS och 2.000 för MS / MS. Ställ maximala jon ackumulering tider till 1.000 msekför MS och 150 msek för MS / MS. Uteslut fragmenterade peptidbildande joner från ytterligare urval från MS / MS för 20-60 sek.
11. MS / MS Data Acquisition
Identifiera peptider genom att jämföra MS / MS spectra RAW-filer till en teoretisk databas med en algoritm såsom SEQUEST 8 med användning av dessa parametrar (tabell 1).
Tabell 1. Peptiddatabas sökparametrar.
| Allmänna parametrar | fullt tryptisk uppslutning med upp till 2 missade klyftor |
| 25 ppm moderjon tolerans | |
| 1,0 Da fragmentjon tolerans | |
| Statiska Modifieringar | 57,02146 Da på cystein, carboxyamidomethylation |
| 28,03130 Da på lysin och peptidens N-terminal, lätt dimetylering etikett | |
| Dynamiska Modifieringar | 15,99491 Da på metionin, oxidation |
| 6,03766 Da på lysin och peptiden N-terminalen, tung dimetylering etikett |
- Filtrera peptider till en 1% falsk upptäckten hastighet med en metod såsom den måls decoy 9 strategi med användning av en databas av öppna läsramar i den verkliga och den omvända orienteringar.
12. Peptid Kvantifiering
Beräkna områdena för tunga och lätta par MS1 extraherade jonkromatogram (MS1 topp områden) och peptid signal-till-brus (S / N) nyckeltal 10. Inkludera peptid par bara när deras genomsnittliga signal-till-noise-kvoten är större än fem. Kvantifiera relativa förekomsten av en peptid i de två prover som förhållandet MS1 toppytorna för tunga och lätta versioner av samma peptid (MS1 topparea-förhållande). Beräkna de relativa protein abundances som medianförhållandet MS1 topparean för samtliga peptider i proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utvärderade noggrannhet, precision och reproducerbarhet Redi märkning med hjälp av Saccharomyces cerevisiae och Clostridium phytofermentans helcellslysat. Vi kvantifieras först att redi märkning av en blandning av C. phytofermentans proteinlysat från cellulosa (tung märkt, H) och glukos (ljus etikett, L) kulturer. När filtreras till en 1% peptid falsk upptäckten hastighet, innehöll detta prov 11194 unika peptidsekvenser med en effektivitet Redi märkning 98%. Ofraktionerat S. cerevisiae protein lysat liknande sätt märkas med H-eller L-reagens blandas vid olika förhållanden, och analyseras. Protein uttrycksskillnader (log 2 (median MS1 toppytor)) reproducerbart återspeglar förhållandena vid vilka H-och L prover blandades inom ett brett spektrum av blandningsförhållanden (Figur 3). Specifikt var vecket-förändring på 99% av proteinerna mätt som är mindre än 1,6 gånger för 1:01 blandade proverna. Ide 01:10 och 10:01 prover, 99% av proteinerna inom 3,8 gånger det förväntade förhållande, som visar en ökning i standardavvikelse på större avstånd från en 01:01 blandning. När Redi märkning påfördes Clostridium phytofermentans proteomet, kvantifierats vi mer än 2000 proteiner med 94% proteiner mäts inom 2-faldiga nivåerna för replikatodlingar växer på glukos (figur 4A). Protein vika förändringar för dubbla par av kulturer (glukos kontra cellulosa) var också starkt korrelerade (r2 = 0,82), (Figur 4B). S. cerevisiae jämförelser (Figur 3) är från en enda kultur och därmed visar teknisk reproducerbarhet Redi baserade kvantitativa proteomik. C. phytofermentans mätningar (figur 4A, B) jämför replikera kulturer så uttrycks olikheter både mätfel och biologisk variation mellan kulturer. Tillsammans utgör dessa erfarenheterment stödjer att REDI proteomik är en noggrann och reproducerbar metod för att kvantifiera proteinuttrycksskillnader mellan komplexa prover.
Figur 1. Reduktiv dimetylering av peptider med hjälp av tunga och lätta reagens att dimethylate gratis aminer. Detsamma peptid märkt med tung respektive lätt reagens har en 6,0377 Da massförskjutning per fri amin. Den peptid som visas här är märkt både vid N-terminalen och på en lysin-sidokedja. Bild anpassas från ref 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Översikt av protokoll för kvantitativa proteomik genom reduktiv dimetylering. Röda siffror ovanför pilarna motsvarar steg som beskrivs i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utvärdering av redi märkning med hjälp av Saccharomyces cerevisiae helcellslysat. Prover från en enda kultur var märkta med antingen tung (H) och lätta (L) reagenser, blandas vid olika förhållanden (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L, och 10H: 1 liter), och proteinskillnader mellan H och L prover kvantifieras som log 2 median MS1 toppareaförhållanden (log 2 H / L-förhållande). Den 2 värdet R för en linjär trendlinje genom alla uppgifterpoäng var 0,96 (svart linje); Pearsons korrelationen var 0,98. Förtroende gränser (röda linjer) visar den absoluta vinkelräta avståndet från trendlinjen inom vilken 95% av datapunkterna hittades för varje prov. Bild anpassas från ref 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av REDI-märkt Clostridium phytofermentans proteiner från kulturer som växer av olika kolkällor. A) Proteinexpression i ett glukos kultur relativt ett replikat glukos kultur, en hemicellulosa kultur, och ett cellulosakultur. Den fraktion av proteiner som uttrycks i tvåfaldiga nivåer: glukos-glukos (94%), glukos-hemicellulosa (80%) och Glucose-cellulosa (49%). B) Vik förändringar i proteinuttryck för glukos kontra cellulosa kulturer är starkt korrelerade (r2 = 0,82) för dubbla par av kulturer. Bilder anpassas från ref 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera punkter gör stabila isotopen märkning av peptider med hjälp av reduktiv dimetylering (redi märkning) en attraktiv metod för kvantitativ proteomik: billiga märkningsreagens (reagenser kostar mindre än $ 1 per prov), snabb reaktionshastighet (~ 10 min), frånvaro av sidoprodukter, hög reproducerbara (figurerna 3, 4), stabila reaktionsprodukter, förmåga att använda något proteas, och hög joniseringseffektivitet av märkta peptider. Kemisk märkning av Redi är också fördelaktigt i förhållande till metabolisk märkning, eftersom det inte kräver stammar eller cellinjer med specifika aminosyra auxotrophies eller tillväxt på ett syntetiskt medium. Som sådan kan Redi appliceras på nästan alla typer av proteinprov inklusive nya mikrober 12 för vilka några mutanta stammar är tillgängliga 13 och humana stamceller 14 bl 15.
En begränsning av redi märkningen är en lägre förmåga att multiplex prover relativt othennes metoder såsom isobar märkning (t.ex. iTRAQ eller TMT), där det för närvarande upp till åtta prover kan samtidigt kvantifieras 16. Den metod som vi beskriver här tillåter kvantitativ jämförelse av två differentiellt märkta prover. Ytterligare isotop kombinationer av formaldehyd och cyanborhydrid kan användas för att producera upp till 3 etiketter som skiljer sig med minst 4 Da 17 och redi märkning har nyligen förlängts till 5 multiplexade prover 18. En annan utmaning för Redi märkningen är att deuterade peptider eluerar något innan ljus kära när du använder omvänd fas-kromatografi. För att kontrollera om detta "deuterium effekt", bör peptid kvantifiering alltid baseras på hela extraherade jonkromatogram (MS1 topparea) i stället för intensiteter från en skanning.
Den redi proteomik protokoll som beskrivs här innehåller många förbättringar 11,15,17 gjorts sedan den första beskrivningen av minskning dimetyl-märkningav peptider för masspektrometri 5. Vi beskrev en "on-column" märkningsmetod för att tillåta högre peptid belopp och effektiviteten märkning kan verifieras innan provblandning, men "i lösning" och "online" märkning metoder finns också 19. Förutom proteome kvantifiering är Redi märkning tillämpas för isoform bestämning 20 och kan kombineras med andra metoder för att analysera posttranslationella modifieringar såsom fosforylering 11,18 acetylering 21, och glykosylering 22. På grund av sin mångsidighet och billig, kvantitativ kemi, kommer Redi märkningen bli allt tillämpas på kvantitativa proteomik på nya och spännande sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
