Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Summary

Interaksjoner mellom proteiner er grunnleggende for alle cellulære prosesser. Ved hjelp Bioluminescence Resonance Energy Transfer, kan interaksjonen mellom et par av proteiner bli overvåket i levende celler og i sanntid. Videre kan effekten av potensielt sykdomsfremkallende mutasjoner vurderes.

Abstract

Analyser basert på Bioluminesens Resonance Energy Transfer (BRET) gi en sensitiv og pålitelig metode for å overvåke protein-protein interaksjoner i levende celler. Bret er den ikke-strålingen overføring av energi fra en donor luciferase enzym til en "akseptor" fluorescerende protein. I den mest vanlige konfigurasjonen av denne analyse, er den donor Renilla reniformis luciferase og akseptor er Gul Fluorescent Protein (YFP). På grunn av at effektiviteten av energioverføringen er sterkt avstandsavhengig, observasjon av Bret fenomen krever at donor-og akseptor være i umiddelbar nærhet. For å teste for en interaksjon mellom to proteiner av interesse i dyrkede pattedyrceller, er et protein uttrykt som en fusjon med luciferase og andre som en fusjon med YFP. En interaksjon mellom de to proteiner av interesse kan bringe donor og akseptor tilstrekkelig nær for energioverføring å oppstå. Sammenlignet med andre teknikker for å undersøke protein-protein imoter, den BRET analysen er sensitiv, krever lite hands-on tid og få reagenser, og er i stand til å oppdage interaksjoner som er svak, forbigående, eller avhengig av biokjemiske miljøet funnet innenfor en levende celle. Det er derfor en ideell metode for å bekrefte putative interaksjoner slått av gjær to-hybrid eller massespektrometri proteomikk studier, og i tillegg er det vel-egnet for kartlegging samspill regioner, der effekten av post-translasjonelle modifikasjoner av protein-protein-interaksjoner og evaluere virkningen av mutasjoner identifisert i pasientens DNA.

Introduction

Både klassisk hydraulikk og neste generasjons sekvenseringsanalyser av menneskelige lidelser er avslørende den kliniske relevansen av proteiner som er involvert i en rekke biologiske mekanismer. Det er ofte slik at det forut for deres identifikasjon i slike undersøkelser, har det vært liten eller ingen undersøkelse av den biologiske rollen til disse proteiner. En fruktbar vei å begynne å utforske den biologiske funksjonen til et protein av interesse er å identifisere hvilke andre proteiner den samhandler med i sin fysiologisk sammenheng. Karakteriserer molekylære nettverk på denne måten gir innsikt i de biologiske mekanismer ligger til grunn for menneskelig fenotype.

Den mest brukte storskala screening tilnærminger for å identifisere kandidatinteraksjonspartnere for proteiner av interesse er gjær to-hybrid screening ^en og massespektrometri-baserte proteomikk ^to. Disse metodene kan være svært vellykket i å foreslå potensielle samspill proteiner, men are utsatt for falske positive resultater. Derfor, bekreftelse på en interaksjon identifisert av gjær to-hybrid eller massespektrometri screening krever validering av interaksjonen ved hjelp av en andre teknikk. Vanligvis en co-immunoprecipitation eller trekk-ned-analysen brukes til dette formålet ^tre. En ulempe ved bruk av slike teknikker for validering er kravet til cellelyse, som ødelegger de intracellulære betingelsene som kan være nødvendig for å opprettholde visse protein interaksjoner. En andre ulempe er at svake eller flyktige protein interaksjoner kan bli forstyrret under vasketrinnene. Videre har disse assays krever betydelig praktisk tid, er begrenset i antall prøver som kan behandles samtidig, og krever ofte tidkrevende optimalisering av reagenser og protokoller.

For å overvinne noen av problemene i forbindelse med ko-immunoprecipitation eksperimenter, har flere bestemmelser blitt utviklet basert på fluorescerende og bioluminescent proteiner som kan anvendes i levende celler. Den første av disse analysene ble basert på fluorescens (eller Förster) Resonance Energy Transfer (FRET), den ikke-strålingsenergioverføring mellom to fluorescerende proteiner med overlappende emisjon og eksitasjon spektra ^4.. Effektiviteten av energioverføringen er sterkt avstandsavhengig, og derfor observasjon av FRET fenomen krever at donor-og akseptor fluoroforer være i umiddelbar nærhet. For å teste for en interaksjon mellom to proteiner av interesse, er et protein uttrykt som en fusjon med donor-fluorofor (vanligvis cyan fluorescerende protein, CFP), og den andre som en fusjon med akseptor fluorofor (ofte gul fluorescerende protein; YFP). En interaksjon mellom de to proteiner av interesse kan bringe giver-og akseptor fluoroforer tilstrekkelig tett for energioverføring å oppstå, noe som vil resultere i en målbar økning i utslippet av lys fra YFP akseptor i forhold til CFP donor. FRET har vært vellykket i å oppdage protein-protein interaksjoner i levende celler ^fire. Den største ulempen med å bruke FRET for detektering protein-protein-interaksjoner er kravet for ekstern belysning for eksitering av donor-fluoroforen. Eksterne belysnings resulterer i høy bakgrunn i utslipps signal, uønsket magnetisering av akseptor, og fotobleking av både donor-og akseptor fluoroforer. Disse effektene følsomheten av analysen for å påvise protein-protein interaksjoner redusere.

En modifikasjon av FRET assay som overvinner problemet med høy bakgrunn mot ekstern belysning er Bioluminescence Resonance Energy Transfer (Bret) assay ^5,6. I Bret system donor fluoroforen er erstattet av et luciferase-enzymet. Således energien for magnetisering av akseptor fluoroforen er generert i systemet ved oksidasjon av et luciferase-substrat, slik at ekstern belysning unødvendig. I den mestvanlig konfigurasjon av denne analyse, er den donor Renilla reniformis luciferase og akseptor er YFP (for en diskusjon av alternative donor-og akseptor proteiner se Pfleger et al. ^5). Følgelig, i dette system, er et protein av interesse fusjonert til luciferase og et potensielt veksel protein til YFP, eller vice versa. Den BRET analysen krever tillegg av coelenterazine som substrat for luciferase. Fordi coelenterazine er cellepermeable, er det mulig å utføre BRET assays i levende celler. Imidlertid er innfødt coelenterazine ustabilt i vandig løsning, og den enzym uavhengig nedbrytning av coelenterazine både reduserer konsentrasjonen av substratet er tilgjengelig for analyse og genererer autoluminescence, noe som reduserer følsomheten av målinger av luciferase-aktivitet. Bruken av Bret i levende celler er blitt muliggjort ved utviklingen av beskyttede coelenterazines, som er stabile i vandig oppløsning, men spaltes av esterase cytosoliskes etter diffusjon gjennom cellemembranen for å generere aktiv coelenterazine inne i cellen ^7..

Etter tillegg av underlaget til celler uttrykker luciferase-og YFP-fusjonsproteiner, er energioverføring som følge av protein-protein interaksjoner kvantifisert ved å overvåke utslipp fra luciferase og YFP. Ettersom protein interaksjoner kan overvåkes direkte i levende celler i multi-brønnplater, utgjør Bret-analysen er en enkel og skalerbar fremgangsmåte for validering av putative interaksjoner som er kostnads-og tidssparende.

I tillegg til å validere putative interactors identifisert i proteomic screening-undersøkelser, kan det Bret-systemet også anvendes til å teste kandidatinteractors som oppstår ved tidligere biokjemiske og strukturelle studier av proteinet av interesse. Når tilstedeværelsen av et protein-protein interaksjon har blitt etablert (enten ved å bruke Bret assay, eller ved andre teknikker), er det potensial for Bret assay for å være employed ytterligere å karakterisere samspillet. For eksempel kan de samvirkende områder kartlegges ved å generere avkortede versjoner av proteinene, og involvering av spesifikke rester i interaksjon kan bli demonstrert ved å skape punktmutasjoner. Videre kan den regulerende virkning av posttranslational modifikasjoner eller små molekyler (f.eks narkotika eller ligander) på protein-protein interaksjoner undersøkes ^8-10.

Den BRET analysen har også et stort potensial for å undersøke identifiserte mutasjoner i pasientens DNA. I tilfeller der en utløsende rolle for en mutasjon er etablert, å studere effekten av mutasjonen på protein-protein interaksjoner med BRET kan avsløre mer om den molekylære etiologi av fenotype ^11. Siden ankomsten av neste generasjons sekvensering metoder, er det stadig mer vanlig at flere potensielt skadelige mutasjoner å bli identifisert i løpet av et individ, i så fall er det uklart hvilke er relevante til fenotype ^12. I denne situasjonen BRET analysen kan være verdifulle i å vurdere effekten av mutasjoner på protein funksjon og dermed sin relevans til uorden.

Protocol

En. Opprettelse av plasmider

1. Subklon av cDNA for hver proteinet av interesse inn i både pLuc og pYFP vektorer, ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker (se figur 1). For detaljerte protokoller se Green et al ^13.
2. Sequence alle konstruerer å verifisere at proteiner av interesse er i ramme med Luc / YFP sekvens uten mellomliggende stoppkodoner.
3. Utfør funksjonelle analyser etter ønske for å få bekreftet at fusjonsproteiner beholde biologisk aktivitet. I tilfellet presentert her den subcellulære lokalisering av YFP fusjonsproteiner ble konstatert ved fluorescens mikroskopi.
4. Gjør ekspresjonsplasmider for egnede Luc og YFP kontroll proteiner ved å konstruere de relevante målretting signaler inn i pLuc og pYFP ekspresjonsvektorene. I tilfelle presenteres her, generere atom målrettet Luc og YFP konstruerer ved å sette inn et kjernefysiske lokalisering signal inn i pLuc og pYFP vektorer.
5. Gjøren positiv kontroll konstruksjon hvori Luc og YFP er smeltet inn i en enkelt polypeptid. I tilfellet presentert her, genererer en positiv kontroll, der YFP kodende sekvensen er satt inn i vektoren pLuc.
6. Velg et nøytralt fyllstoff plasmid som skal brukes for å utjevne massen av DNA i transfeksjon mikser. Bruk et plasmid som ikke har noen eukaryote promoter og vil derfor være transkripsjonelt inaktiv i pattedyrceller, slik som en bakteriell kloningsvektor.

2. Utarbeidelse av DNA-mikser

1. Estimer konsentrasjonen av alle plasmidene som er beskrevet i avsnitt 1 basert på absorbans ved 260 nm (1 absorbans-enhet er ekvivalent med 50 ug / ml DNA). Bestem den molekylære massen av hvert plasmid ved å multiplisere antall basepar ved 650 Da. Bruk konsentrasjon og molekylvekt for å beregne den molare konsentrasjon av hver plasmid-preparat. Fortynn plasmid DNA preparater i en konsentrasjon på 36 nM. Disse vil være de som arbeider aksjersom vil bli brukt for å fremstille DNA-blandinger for transfeksjon.
2. Tilbered en kontroll-DNA blanding inneholdende 1800 ng av plasmid fyllstoff i et sluttvolum på 20 ul vann.
3. Forbered en kontroll DNA blanding som inneholder 5 mL av pLuc-kontroll konstruere. Legg fyllstoff plasmid for å bringe det totale DNA masse til 1800 ng. Tilsett vann til å bringe det endelige volumet til 20 mL.
4. Forbered en kontroll DNA blanding som inneholder 5 mL av pLuc-kontroll konstruere og 5 mL av pYFP-kontroll konstruere. Legg fyllstoff plasmid for å bringe det totale DNA masse til 1800 ng. Tilsett vann til å bringe det endelige volumet til 20 mL.
5. Forbered en kontroll DNA blanding som inneholder 5 mL av positiv kontroll konstruere. Legg fyllstoff plasmid for å bringe det totale DNA masse til 1800 ng. Tilsett vann til å bringe det endelige volumet til 20 mL.
6. Forbered følgende DNA blander for å teste for homodimerization av et protein av interesse, X. For hvert DNA-blanding kombineres 5 pl av den aktuelle pLuc konstruere og 5 pl av pYFP konstruere. Legg fyllstoff plasmid for å bringe det totale DNA masse til 1800 ng. Tilsett vann til å bringe det endelige volumet til 20 mL.
   A) pLuc-kontroll og pYFP-X
   B) pLuc-X og pYFP-kontroll
   C) pLuc-X-og-X pYFP
7. Forbered følgende DNA blander for å teste for en interaksjon mellom et par av proteiner som er av interesse, X og Y. For hvert DNA-blanding kombineres 5 pl av den aktuelle pLuc konstruere og 5 pl av den pYFP konstruere. Legg fyllstoff plasmid for å bringe det totale DNA masse til 1800 ng. Tilsett vann til å bringe det endelige volumet til 20 mL.
   A) pLuc-kontroll og pYFP-X
   B) pLuc-X og pYFP-kontroll
   C) pLuc-kontroll og pYFP-Y
   D) pLuc-Y og pYFP-kontroll
   E) pLuc-X-og-Y pYFP
   F) pLuc-Y og pYFP-X

Tre. Transfection

1. Innhøstingen subconfluent HEK293 celler fra en 75 cm ² kolbe. Fortynn 10% av de totale celler i 13 ml av kulturmediet. Tilsett 130 ul cellesuspensjon til hver brønn av en hvitklart bunnet 96-brønners vevkulturplate. Kultur celler for 24 hr.
2. Beregn det antall brønner som skal transfekteres ved å multiplisere antall DNA-mikser ved 3.. Bringe serumfritt kulturmedium til romtemperatur. Forbered en mester blanding som inneholder 6,3 mL av serumfritt medium og 0,18 mL transfeksjon reagens per brønn. Bland ved virvling, og inkuber ved værelsetemperatur i 5 min.
3. Forbered transfeksjon blandinger ved å tilsette 2 pl av DNA-blandingen på 20 pl av serumfritt medium / transfeksjon reagens konsentrat-blanding. Ikke vortex. Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
4. Transfektere tre brønner med hver transfeksjon mix dispenserer 6,5 mL av transfeksjon mix per brønn. Kultur cellene for en ytterligere 36-48 hr.

4. Måling av BRET Signal

1. Oppløse live-cell luciferase substrat på 34 mg / ml i DMSO ved virvling.
2. Fortynne rekonstituert live-cell luciferase underlaget på 1:1.000 i underlaget fortynningsmediumet pre-varmet til 37 ° C. Tillat 50 pl substrat fortynning medium per brønn. Vortex å blande. Et bunnfall kan dannes, men vil ikke påvirke analysen.
3. Aspirer dyrkningsmediet fra 96-brønns plate. Tilsett 50 ul fortynnet levende celler luciferase substrat til hver brønn. Kultur-celler i minst 2 timer (inntil 24 timer).
4. Fjern lokket fra den 96-brønns plate og Inkuber platen i 10 minutter ved rom-temperatur i luminometeret.
5. Mål utslipp fra Luc og YFP ett godt om gangen. Mål utslipp fra Luc ved hjelp av en filterblokkerbølgelengder lengre enn 470 nm. Mål utslipp fra YFP bruke en 500-600 nm band-pass filter. Integrer utslipps signaler over 10 sek.

5. Data Analysis

1. Gjennomsnittlig de Luc utslippsmålinger fra de tre brønnene som mottok bare filler plasmid. Trekk denne verdien fra alle andre Luc utslippsmålinger for å produsere bakgrunnskorrigert Luc utslippsverdier.
2. Gjennomsnittlig YFP utslippsmålinger fra de tre brønnene som mottok bare filler plasmid. Trekk denne verdien fra alle andre YFP utslippsmålinger for å produsere bakgrunnskorrigert YFP utslippsverdier.
3. For hver brønn, dele bakgrunnen korrigert YFP emisjonsverdi av bakgrunnen korrigert Luc emisjonsverdi å gi ukorrigert BRET forholdet.
4. Gjennomsnittlig de ukorrigerte BRET prosenter fra de tre brønnene som ble transfektert med bare pLuc-kontroll plasmid. Trekk denne verdien fra alle de andre ikke-korrigerte BRET forholdstall for å gi de korrigerte BRET forholdstall.
5. For hver av de gjenværende sett av korrigerte BRET forholdstall, gjennomsnittet av verdiene fra de tre transfekterte brønner for å oppnå en endelig Bret-forhold.

Representative Results

Prinsippet for Bret-analysen er vist i figur 2.. Analysen oppsett brukes gjennom eksperimentene er presentert her, er vist i figur 3.. Påvisning av en sterk Bret signal fra celler transfektert med luciferase-YFP fusion protein bekreftet at energioverføring var observerbar i denne eksperimentelle oppsettet (figur 4).

Vår forskning fokuserer på rollen til FOXP familien av transkripsjons repressors i hjernens utvikling. Heterozygote mutasjoner som påvirker FOXP2 føre til en sjelden form for tale og språkvansker, hvorav den mest fremtredende trekk er utviklings verbal dyspraksi-vanskeligheter med å produsere komplekse sekvenser av orofocial muskelbevegelser som kreves for tale ^14-16. FOXP1 mutasjoner har blitt rapportert hos pasienter med autismespekterforstyrrelser og utviklingshemming ledsaget av alvorlig tale og språkproblemer ^17-20. Samspillet av FOXPs med andre proteiner blir etterforsket for å få innsikt i de molekylære mekanismene som er relevante for rollen av disse proteinene i hjernens utvikling.

FOXP2 er kjent for å danne homo-eller heterodimerer med andre FOXP familiemedlemmer ^21, derfor FOXP2 homodimerization ble brukt til å validere BRET analysen (figur 4). For å utelukke muligheten for at interaksjonen av FOXP2 fusjonsproteiner i denne analysen skyldtes bare å protein overekspresjon, ble spesifisiteten av interaksjonen påvises ved å innføre en mutasjon i den leucin-glidelås dimerisering domenet av FOXP2 (in-frame delesjon av residuet E400), hvor er kjent for å forstyrre homo-og heterodimerization ²¹ (figur 5A). Når Luc-FOXP2.DE400 og YFP-FOXP2 fusjonsproteiner var co-uttrykk, ble en reduksjon i BRET signal observert i forhold til når Luc-FOXP2 og YFP-FOXP2 var co-uttrykk (Figur 5B). Dette signal reduksjonen var ikke forårsaket av en forandring i den subcellulære lokalisering av det mutante protein (figur 5C), eller til en forskjell i ekspresjonsnivåene som vurdert ved Western blotting (data ikke vist). Signalet reduksjon ble også observert da Luc-FOXP2 ble uttrykt med YFP-FOXP2.DE400 (data ikke vist). Dermed BRET er effektive i å oppdage protein homodimerization, og samspillet mellom proteiner forblir bestemt når disse proteinene er overexpressed som luciferase-og YFP-lim. Videre har bruken av Bret i kombinasjon med målrettet mutasjon av proteinene mulighet for å identifisere individuelle rester som er involvert i protein-protein interaksjoner.

For å vurdere effektiviteten av BRET analysen i å oppdage heterotypic interaksjoner, var samspillet av FOXP2 med FOXP1 testet (figur 6). En Bret signal ble observert i begge mulige konfigurasjoner av analysen (dvs. med FOXP2 som donor eller som akseptor fusion protein). Derfor BRET analysen er i stand til å oppdage både homo-og heterotypic interaksjoner. I tillegg, ble egnetheten av Bret-analysen for å påvise interaksjon mellom FOXP2 med ikke-FOXP proteiner testet ved å undersøke interaksjonen med CtBP1, en ​​transkripsjonen co-repressor og kjent FOXP2 interaksjon partner ^21.. Samspillet mellom CtBP1 og FOXP2 ble opprinnelig foreslått av en gjær to-hybrid skjerm og ble deretter validert av co-immunoprecipitation eksperimenter ^21. Den FOXP2-CtBP1 interaksjonen ble påvist ved Bret assay når FOXP2 var donor-fusjonsprotein, og CtBP1 var akseptor, men ikke i motsatt konfigurasjon (figur 7A). Slike resultater kan forventes med BRET systemet (se diskusjon avsnitt). Interaksjonen mellom FOXP2 og CtBP1 ble observert, selv om bare en mindre andel av CtBP1 ble lokalisert til kjernen (figur 7B), fremhever følsomheten av denne analysen. Dermed BRETanalysen er nyttig for validering av antatte interaksjoner identifisert gjennom gjær to-hybrid screening.

Til slutt ble BRET analysen ansatt for å undersøke effekten av sykdomsfremkallende mutasjoner i FOXP2 på protein-protein interaksjoner. To punktmutasjoner i FOXP2 er blitt rapportert å forårsake en sjelden autosomal dominant lidelse som påvirker tale og språk (figur 8A). Den R553H missense mutasjon ble oppdaget gjennom en kobling studie i en stor familie der halvparten av medlemmene ble rammet av sykdommen ^14. Den R328X nonsense mutasjon ble oppdaget gjennom målrettet sekvensering av FOXP2 locus i probands med diagnosen utviklings verbal dyspraksi ^22. Muligheten av de muterte proteiner til dimerize med villtype FOXP2 ble vurdert ved hjelp av BRET analysen. Resultatene under anvendelse av villtype FOXP2 som giver-og mutant FOXP2 som akseptor er vist i figur 8B. De samme resultater ble observert ved bruk av mutant FOXP2 som donor-og vill-type som akseptor (data ikke vist). Den R553H mutasjon, som er innenfor den DNA-bindende domenet av FOXP2, ikke påvirker evnen av det mutante protein til dimerize med vill-type. Den patogene mekanismen for denne mutasjon kan derfor inkludere en dominant negativ virkning som følge av dimerisering av mutant med den normale proteinet ^23.. Den R328X mutasjonen innfører en for tidlig stoppkodon, med det resultat at det kodede protein mangler leucin-glidelås-domenet og dimerisering DNA-bindende domene, og viser noen cytoplasmiske mislocalization (figur 8C). I samsvar med fravær av dimerisering domenet og mislocalization til cytoplasma, viser den avkortede protein sterkt redusert interaksjon med villtype FOXP2. Denne mutasjonen er derfor sannsynlig å være sykdomsfremkallende på grunn av haploinsufficiency. Dermed BRET analysen kan gi innsikt i de biologiske effektene av mutasjoner oppdaget i pasienter.

Figur 1. Vektorer for uttrykk av YFP-og luciferase-fusjon proteiner. A) Circle kart over de pYFP og pLuc vektorer. Den pLuc vektor brukes for ekspresjon av luciferase fusjonsproteiner som BRET givere. Den pYFP vektor brukes for uttrykk av YFP fusjon proteiner som BRET akseptorer. Vektorer har en CMV promoter (P _CMV) for høynivå ekspresjon i pattedyrceller, et multippel-kloningssete (MCS) for innsetting av cDNA for proteinene av interesse, og et kanamycin-resistens-genet (Kan ^r) og bakteriell replikasjonsopprinnelses for forplantning av plasmidet i bakterier. B) Flere kloning stedet av pLuc og pYFP vektorer. Enden av YFP kodende sekvens er vist i blått. Valgte restriksjonsseter er annotert. Merk at Xbal nettstedet er blokkert av overlapping dam metylering i standard stammer av E. coli. cDNA som koder for proteiner av interesse skal klones i-ramme med den aminosyresekvens som er vist. I forsøkene som er beskrevet her, ble innsatser klonet inn i Bam HI og Xba I-restriksjonsseter (understreket). Stoppkodon er blitt fjernet fra enden av luciferase og YFP kodende sekvenser for å gi en åpen leseramme som omfatter luciferase / YFP og subklonet cDNA av interesse. Stoppkodon er til stede ved enden av det multiple kloningssete i alle tre leserammer (som er vist i rødt), og derfor er det ikke nødvendig å inkludere et stopp-kodon i den innførte cDNA.

Figur 2. Prinsipp for Bret-systemet. Proteiner av interesse, X og Y, er kondensert til en donor luciferase enzym (Luc, topp utslipp 475 nm) og et mottaker fluorescerende protein (YFP, topp utslipp 530 nm), henholdsvis. Fusjonsproteiner er uttrykt i dyrkede pattedyrceller, og etter tilsetning av en cellepermeabel luciferase substrat, emisjon fra Luc måles ved hjelp av et filter blokkerer bølgelengder lengre enn 470 nm og emisjon fra YFP måles ved hjelp av et 500-600 nm båndpassfilter. A) Ingen interaksjon mellom protein X og protein Y. energioverføring fra Luc til YFP forekommer ikke. B) Samvirke mellom protein X og protein Y. resonans energioverføring skjer fra Luc til YFP forårsaker en økning i forholdet mellom emisjons målt ved hjelp i 500-600 nm båndpassfilter i forhold til filterblokkeringsbølgelengder lengre enn 470 nm.

Figur 3. Analyse oppsett. Analysen oppsett for å teste foren interaksjon mellom to proteiner av interesse, X og Y. proteiner av interesse blir sammensmeltet til luciferase (Luc) som Bret donor og gule fluorescerende protein (YFP) som Bret akseptor. I kontrollproteiner, er Luc og YFP kondensert til et peptid inneholdende en målsøkende signal for den aktuelle subcellulære rommet (P), hvis hensiktsmessig. A) kontroller til å bli inkludert i hver plate. 1) Mock-transfeksjon kontroll for å etablere bakgrunnsverdier av luminescens og fluorescens som følge av luminometer støy og enzym-uavhengig nedbryting av underlaget; 2) pLuc-kontrollen kun transfeksjon for å fastslå andelen av luciferase-utslipp som er detektert i løpet av utslippsområdet av YFP i fravær av et Bret akseptor; 3) Transfeksjon av pLuc-kontroll og pYFP-kontroll for å etablere baseline BRET signal som følge av Luc-YFP samhandling; 4) Transfeksjon av Luc-YFP fusjon som en positiv kontroll for å sikre at en Bret signal kan måles. B) ligger i experimental betingelser for å teste for en interaksjon mellom to proteiner av interesse, X og Y. 1, 2, 4, 5) Styrer for ikke-spesifikk interaksjon mellom proteinene av interesse, og Luc / YFP; 3) Test tilstand med X som donor og Y som akseptor; 6) Test tilstand med Y som donor og X som akseptor.

Figur 4. Påvisning av FOXP2 homodimerization. A) For å validere Bret assay for påvisning av FOXP2 homodimers ble HEK293 celler transfektert med konstruksjoner for ekspresjonen av luciferase (donor) eller YFP (akseptor) fusjonert til enten FOXP2 (P2) eller en kjernelokaliseringssignal (-). Atom målrettede luciferase og YFP proteiner tjene som negative kontroller. Som en positiv kontroll for detektering av et signal Bret, ble cellene også transfektert med en konstruksjon for ekspresjon av et luciferase-YF. P-fusjonsprotein (+) B) fluorescens mikroskopi-bilder av celler transfektert med YFP smeltet til en kjernefysisk lokaliseringssignal (-) eller med YFP smeltet til FOXP2 (P2).

Figur 5. Bruk av dimerisasjon-mangel FOXP2 å demonstrere analysen spesifisitet. A) Skjematisk fremstilling av FOXP2 protein som viser posisjonen til DE400 mutasjon, som forstyrrer dimerisering. Den leucin glidelås dimerisering domenet er vist i grønt, og den DNA-bindende domene i gult. B) For å teste hvorvidt overekspresjon av proteinene kan føre til falsk-positive resultater i analysen Bret, ble spesifisiteten av analyse vurderes ved hjelp av FOXP2.DE400 variant. Celler ble transfektert med konstruksjoner for ekspresjonen av luciferase (donor) eller YFP (akseptor) smeltet til FOXP2 (P2), FOXP2.DE400 (DE) eller et kjernedannelr lokaliseringssignal (-). C) fluorescens mikroskopi-bilder av celler transfektert med YFP smeltet til FOXP2 (P2) eller til FOXP2.DE400 (DE).

Figur 6. Påvisning av FOXP1-FOXP2 heterodimerization. A) For å validere Bret assay for påvisning av heterodimerization mellom homologe proteiner FOXP2 og FOXP1, ble celler transfektert med konstruksjoner for ekspresjonen av luciferase (donor) eller YFP (akseptor) fusjonert til enten FOXP2 (P2), FOXP1 (P1) eller en atomlokaliseringssignal, (-). B) fluorescens mikroskopi-bilder av celler transfektert med YFP smeltet til FOXP1 (P1) eller til FOXP2 (P2).

B) fluorescensmikroskopi bilder av celler transfektert med YFP smeltet til CtBP1 (CtBP) eller til FOXP2 (P2).

Figur 8. Evaluering av virkningene av patogene FOXP2 mutasjoner på protein-protein interaksjoner. A) Skjematisk fremstilling av FOXP2 protein som viser posisjonene til R553H og R328X mutasjoner som forårsaker en sjelden form av tale og språkvansker. Den leucine glidelås dimeriserings domenet er vist i grønt og DNA-bindende domene i gult. B) For å vurdere nytten av BRET analysen for å vurdere effekten av patologiske mutasjoner på protein-protein interaksjoner, effektene av de R553H og R328X mutasjoner på evnen av de mutante proteiner til å FOXP2 dimerize med normal FOXP2 ble undersøkt. Celler ble transfektert med konstruksjoner for ekspresjonen av luciferase (donor) eller YFP (akseptor) fusjonert til enten normal FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), eller en kjernefysisk lokaliseringssignal (-). C ) Fluorescens mikroskopi bilder av celler transfektert med YFP smeltet til FOXP2.R553H (R553H) eller til FOXP2.R328X (R328X). I dette bilde FOXP2.R328X er overveiende atom, men i andre celler i populasjonen viser et mer cytoplasmisk fordeling.

Discussion

Utformingen av fusion protein ekspresjonskonstruksjoner er et avgjørende skritt i å sette opp BRET analysen. I forsøkene er presentert her, ble proteinene av interesse fusjonert til C-terminalen av luciferase eller YFP. Det er også mulig, og kan være nødvendig, å smelte proteiner til N-terminus av luciferase / YFP. For noen proteiner, kan fusions bare bli akseptert på enten den N-eller C-terminus for å unngå forstyrrelse av proteinstruktur og funksjon. Videre, for transmembrane proteiner hvor N-og C-termini bor i forskjellige subcellulære rom, luciferase / YFP protein må være smeltet til-terminus, som er i samme rom som samspillet partner. For eksempel, i studier av interaksjonen mellom transmembrane G-protein-koplede reseptorer og cytoplasmatisk β-arrestin, ble luciferase kondensert til den intracellulære carboxyl halen av transmembrane reseptor ^8.. I andre tilfeller kan geometrien av en protein-protein intden kan føre til energioverføring blir mer effektiv ved hjelp av en av de to mulige kombinasjoner av fusjonsproteiner. Av og til energioverføring oppdages kanskje ikke i det hele tatt hvis du bruker bare én kombinasjon, som fører til falske negative resultater.

Sekvensen av peptid-linkeren mellom luciferase / YFP og proteinet av interesse kan også påvirke effektiviteten av resonans energioverføring. Linkeren bør være lang nok til å tillate luciferase / YFP og proteinet av interesse å folde uten hindring. En lengre linker vil gi større fleksibilitet til polypeptidet ved overgangen mellom luciferase / YFP og proteinet av interesse, som kan øke effektiviteten Bret ved å lette innretting av donor-og akseptor dipoler. Imidlertid kan Bret effektivitet reduseres hvis det er for mye fleksibilitet i linkeren. I forsøkene her, kloning av de proteiner som er av interesse inn i BamH I-og Xba I-områder av uttrykket vectorer som resulterte i en 23-aminosyre-linker, som vist i figur 1.. Denne linkeren har vært vellykket for å påvise interaksjon mellom flere par av proteiner.

Før man å bret eksperimenter bør det påses at fusjonsproteiner beholder normal biologisk aktivitet. Den fungerende YFP kan vurderes ved direkte visualisering ved hjelp av en fluorescens mikroskop. Funksjon av luciferase kan undersøkes ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett. Effekten av blanding på den subcellulære lokalisering av proteiner av interesse kan vurderes ved farging, eller i tilfelle av YFP-lim, ved direkte visualisering. Effekten av blanding på funksjonen av proteinet av interesse kan bli undersøkt ved proteinspesifikke assays - for eksempel, for en transkripsjonsfaktor kan det være hensiktsmessig å bestemme DNA-bindende aktivitet. Merk at luminescens målinger gjort under forsøket gi praktisk i-analysen bekrefterasjon av luciferase aktivitet.

Det er viktig å vurdere hva de riktige kontroll konstruerer er for protein av interesse. YFP og luciferase er overveiende cytoplasma og er derfor passende kontrollerer når de proteiner av interesse er cytoplasma. Når imidlertid proteinene av interesse er lokalisert til andre subcellulære rom kan det være ønskelig å modifisere luciferase og YFP med peptid signaler for å dirigere deres handel til det aktuelle kammer. Her proteinene av interesse var transkripsjonsfaktorer som er lokalisert til kjernen, og derfor luciferase og YFP ble modifisert ved tilsetning av et kjernelokaliseringssignal. Nærmere bestemt ble et peptid med atomlokaliseringssignalet fra SV40 stort T antigen (CGYGPKKKRKVGGLDN) føyd til C-terminus av luciferase og YFP ved ligering av syntetiske dobbel-trådede oligonukleotider mellom BamHI og Xbal-setene av the pLuc og pYFP vektorer. Tilsetning av dette signalet forårsaket en vesentlig omfordeling av proteiner til kjernen (figur 4B).

Inkludert de aktuelle kontroller er avgjørende for tolkningen av BRET eksperimenter. En mock-kontroll ved hjelp av transfeksjon et inert fyllstoff plasmid er viktig å etablere bakgrunnsnivåer av luminescens og fluorescens som skyldes luminometer støy og enzym-uavhengig nedbrytning av substratet. Med moderne luminometers og luciferase underlag bakgrunns luminescens nivåene er vanligvis svært lav. Transfeksjon med den passende kontroll konstruere luciferase i fravær av et YFP konstruksjon er viktig for å fastslå andelen av luciferase-utslipp som er detektert i løpet av utslippsområdet av YFP i fravær av et Bret akseptor. Transfeksjon med kontroll luciferase og kontroll YFP konstruerer gir grunnlinjen BRET signal som følge av Luc-YFP samhandling. For every par av proteiner som er testet for interaksjon, er det viktig å transfektere hver enkelt alene ved passende kontrollkonstruksjon, som vist i figur 3B, for å kontrollere i hvilken som helst ikke-spesifikk interaksjon mellom de proteinene som blir testet og luciferase / YFP. Spesielt når du utfører en BRET eksperiment for første gang, er det viktig å inkludere en Luc-YFP fusjonsprotein som positiv kontroll for å sikre at en BRET signalet er observerbar i eksperimentelle oppsettet. Her den kodende sekvens av YFP ble klonet inn pLuc med BamHI og Xbal-setene for å generere et fusjonsprotein hvori YFP er fusjonert til C-terminalen av luciferase.

I protokollen beskrevet her, blander sammensetningen av DNA for transfeksjon ble beregnet med den forutsetning at den gjennomsnittlige størrelsen på Luc / YFP fusion protein uttrykk konstruerer er ikke større enn 7,5 kb. Hvis uttrykket byggets er betydelig større enn denne, og antallet mol av hvert uttrykk konstruere tilsatt til transfeksjon blanding kan måtte bli redusert, slik at den totale mengden av DNA i blandingen ikke overskrider den maksimalt tillatte av mengden av transfeksjon reagens. Alternativt kan mengden av transfeksjon reagens og mengden av DNA i alle transfeksjon blandinger kan økes i henhold til produsentens retningslinjer. Eksperimentell manipulering av 96-brønners plater blir fremskyndet ved hjelp av flerkanalspipetter og sugepumper. Det er ønskelig å minimalisere variasjon mellom prøvene i lengden av transfeksjon blanding inkubasjonstiden etter tilsetning av DNA til det serumfrie medium / transfeksjon reagens blanding, og derfor begynner å legge transfeksjon blander til cellene så snart den første blandingen er å inkubere i 10 min . Fordi BRET akseptor proteiner er YFP fusjoner, er det mulig å vurdere effektiviteten transfeksjon ved fluorescens mikroskopi eller ved å måle fluorescensen i en mikroplate-reAder. Suksessen til et Bret eksperiment, avhenger av en god grad av transfeksjon slik at det er tilrådelig å sørge for at transfeksjon er tilfredsstillende forløp før tilsetning av substrat og måling av Bret signal. YFP tag gjør det også mulig kvantifisering av akseptor protein uttrykk nivåer ved hjelp av en mikroplateleser. Kvantifisering av akseptor protein nivåer kan være nyttig for optimalisering og feilsøking av BRET eksperimenter.

Celler bør inkuberes i minst 2 timer med luciferase substrat før måling av Bret-signalet for å sikre at et stabilt signal er oppnådd. Det er også akseptabelt å inkubere cellene med substrat i opptil 24 timer. I dette tilfellet vil den totale luminescens tellinger vil bli lavere, men BRET forhold bør være uforandret. Lengre inkubasjoner med substratet kan være mer fordelaktig (for eksempel, natten over), og også tillate måling av BRET signaler før og etter en eksperimentell manipulasjon slikesom tilsetning av en farmasøytisk forbindelse. Ideelt sett, optimalisere celle seeding tetthet slik at cellene når confluency rundt tidspunktet for målingen. Hvis celletettheten er over optimal så kan det være fordelaktig å måle Bret-signalet på et tidligere tidspunkt for å unngå cellevekst. Hvis du bruker en celletype enn HEK293, sørg for å optimalisere cellekultur og transfeksjon forhold. BRET forsøk har også blitt utført i HeLa-celler ved å bruke den protokoll som er beskrevet her.

I forsøkene som er beskrevet her, ble luminescens tellinger målt ved værelsetemperatur, som er den optimale temperatur for Renilla-luciferase-aktivitet. Ved å utføre en tid-retters eksperiment i luminometeret foretrekkes det å angi temperaturen ved 37 ° C. Vi har utført de samme eksperimenter ved romtemperatur og ved 37 ° C, og ingen signifikant forskjell i resultatene ble observert. Ved å utføre forsøkene ved romtemperatur, the plate bør få lov til å ekvilibrere 10 min inne i luminometeret før måling for å tillate stabilisering av Renilla-luciferase-aktivitet. Her ble luminescens signaler integrert over 10 sek, noe som vanligvis gir høy følsomhet, spesielt for proteiner med lave nivåer. Imidlertid kan signalene bli integrert over kortere tidsrom hvis dette gir tilstrekkelig følsomhet. På grunn av stabiliteten av luminescens-signalet som produseres av levende celler luciferase substrat, er det akseptabelt å måle opp til 10 sekunder per brønn ved hver bølgelengde.

En interaksjon mellom to proteiner av interesse er bekreftet av den Bret assay når signalet fra testtilstand i betydelig grad overskrider de signaler fra de aktuelle styreforhold. Fraværet av en Bret-signalet ikke nødvendigvis er en bekreftelse på at en interaksjon forekommer ikke. I tilfelle av en uventet eller negativt resultat, er den totale luminescens og fluoresceNCE teller bør undersøkes for å sikre at alle brønnene ble trans riktig.

Den Bret signal påvirkes også av forholdet mellom protein ekspresjonsnivåer derfor er det nyttig å undersøke den relative ekspresjonsnivåer av de to proteinene som er av interesse ved sammenligning av fluorescens-tellinger fra brønner transfektert med YFP fusjoner av de to proteiner (eller luminescens fra tellinger brønner tilført med luciferase fusjoner). Når man uttrykker fusjonsproteinet sterkere enn den annen, bedre resultater sannsynligvis vil oppnås dersom proteinet med det laveste ekspresjonsnivået er kondensert til luciferase, noe som var tilfellet med FOXP2 og CtBP1 i eksperimentene er presentert her. Det er også mulig å manipulere proteinnivåer ved å justere det molare forholdet av ekspresjonsplasmider i transfeksjon blanding. Energioverføring mellom visse par av fusjonsproteiner kan være meget ineffektivt på grunn av geometrien av proteinkomplekset. I et slikttilfeller kan det være verdt å prøve fusing proteiner av interesse for alternativ termini av luciferase / YFP.

Det er nødvendig å få bekreftet at den Bret-signalet representerer et fysiologisk protein-protein interaksjon, og er ikke bare på grunn av protein overekspresjon. Av denne grunn er det viktig å unngå brutto overekspresjon av proteinene. Spesifisitet av et protein-protein interaksjon i Bret-systemet kan videre bekreftes ved å innføre mutasjoner inn i de proteiner som er kjent for å redusere affiniteten av interaksjon, som vist her ved hjelp av DE400 variant av FOXP2. De mutante proteinene kan videre bli brukt i konkurranse og metningsbinding BRET assays. I en konkurranseanalyse, blir konsentrasjonene av donor-og akseptor-fusjonsproteiner holdt konstant samtidig som det øker konsentrasjonen av et ukodet versjon av en av interaksjonspartnere som en konkurrent. Untagged villtype protein bør konkurrere med tagget version for binding til dets interaksjon partner, noe som resulterer i en reduksjon i den Bret-signal, mens det mutante proteinet skal fremvise en redusert evne til å konkurrere med interaksjonen. I et metningsbindingsanalyse, er konsentrasjonen av giver-fusjonsprotein holdes konstant, mens den øker konsentrasjonen av akseptoren. For en spesifikk interaksjons den BRET signalet skal etter hvert platå som alle donor molekyler blitt mettet med akseptor. For en ikke-spesifikk interaksjon vil Bret-signalet typisk vise en liten lineær økning på grunn av en økning i tilfeldige kollisjoner mellom donor-og akseptor-molekyler. I praksis, for interaksjoner med moderat affinitet mellom løselige proteiner, kan det være vanskelig å oppnå en høy nok akseptor: donor-forhold for å observere metning samtidig opprettholde tilstrekkelig nivå av donorprotein for signaldeteksjon.

Forsiktighet bør utvises i tolkningen av forskjelleres mellom BRET forholdstall. Den Bret assay ikke gir et kvantitativt mål for affiniteten av en protein-protein interaksjon fordi effektiviteten i energioverføringen er påvirket av andre faktorer enn styrken av protein-protein interaksjonen faktorer. Slike faktorer omfatter forholdet mellom nivåene av fusjonsproteiner i cellen, geometrien av interaksjonen, og utbredelsen av assosiasjon og dissosiasjon av komplekset. Forholdet fremstilt med to forskjellige par av proteiner kan derfor ikke nødvendigvis være i forhold, men sammenligninger kan være mulig mellom ulike varianter av det samme protein, for eksempel med vill-type-og ΔE400 varianter av FOXP2 vist her. Noen ganger kan litt negative BRET forholdstall holdes. Negative forhold kan skyldes feil i målingen av referanseforholdet i celler transfektert med bare pLuc-kontrollvektor. Meget høye forhold er ofte en indikasjon på protein aggregasjon, noe som kan bekreftes ved observasjon av transfekterte cells med en fluorescens mikroskop. Det bør fastsettes dersom aggregering er biologisk relevant eller en gjenstand av protein overuttrykk.

I konklusjonen, BRET analysen beskrevet her er en kraftig tilnærming for å undersøke protein-protein interaksjoner i levende celler. Anvendelsen av BRET er vist for det formål å godkjenne kandidatinteractors fra proteomikk screeningstudier, identifisere konkrete rester involvert i protein-protein interaksjoner, og evaluere effekten av mutasjoner funnet i pasientens DNA. Fordi interaksjoner påvises i sann tid uten behov for cellelysering, kan Bret-signalet måles før og etter en behandling som for eksempel tilsetning av en farmasøytisk forbindelse eller ligand ^7.. Den BRET analysen viser store løftet for bruk i funksjonell genomforskning for å vurdere den biologiske betydningen av genetiske varianter oppdaget gjennom neste generasjons sekvensering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.