التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة
Summary
التفاعلات بين البروتينات الأساسية لجميع العمليات الخلوية. باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة، والتفاعل بين زوج من البروتينات يمكن رصدها في الخلايا الحية وفي الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، فإن آثار الطفرات المحرضة يمكن تقييمها.
Abstract
فحوصات على أساس نقل الطاقة الرنين ضوء بارد (بريت) توفر وسيلة حساسة وموثوق بها لرصد تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا الحية. بريت هو نقل غير الإشعاعي للطاقة من 'المانحة' انزيم luciferase المراسل إلى "متقبل" بروتين فلوري. في التكوين الأكثر شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو بروتين فلوري أصفر (YFP). لأن كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، ومراقبة ظاهرة بريت يتطلب أن الجهات المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الأهمية في خلايا الثدييات مثقف، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع luciferase المراسل والثانية باعتبارها الانصهار مع YFP. التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل المانحين ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة تحدث. مقارنة مع تقنيات أخرى للتحقيق في البروتين البروتين فيteractions، مقايسة بريت حساس، يتطلب القليل التدريب العملي على الوقت وقليل من الكواشف، وغير قادرة على الكشف عن التفاعلات التي هي ضعيفة، عابرة، أو تعتمد على البيئة البيوكيميائية وجدت داخل الخلية الحية. ولذلك هو النهج المثالي لتأكيد التفاعلات المفترضة التي اقترحها الخميرة اثنين الهجين أو مطياف الكتلة البروتيوميات الدراسات، وبالإضافة إلى ذلك فمن مناسبة تماما لرسم الخرائط المناطق التفاعل، وتقييم تأثير التعديلات بعد متعدية على البروتين البروتين التفاعلات، و تقييم أثر الطفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض.
Introduction
كلا الربط الكلاسيكية والجيل المقبل من يحلل التسلسل من اضطرابات الإنسان والكشف عن أهميتها السريرية من البروتينات المشاركة في مجموعة من المسارات البيولوجية. غالبا ما يكون الحال أنه قبل التعرف عليهم في مثل هذه الدراسات، كان هناك تحقيق ضئيلة أو معدومة للدور البيولوجي لهذه البروتينات. واحد السبل المثمرة لبدء استكشاف الوظيفة البيولوجية للبروتين من الفائدة هو تحديد البروتينات الأخرى التي تتفاعل مع في سياقها الفسيولوجية. تميز الشبكات الجزيئية في هذا الشكل يوفر نظرة ثاقبة المسارات البيولوجية الكامنة وراء النمط الظاهري الإنسان.
النهج الأكثر استخداما فحص واسعة النطاق لتحديد الشركاء التفاعل مرشح للبروتينات ذات الاهتمام هي الخميرة فحص اثنين من الهجين 1 والبروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي 2. ويمكن لهذه الأساليب أن تكون ناجحة جدا في اقتراح البروتينات التفاعل المحتملة، ولكن عالبريد عرضة لنتائج إيجابية كاذبة. لذلك، تأكيدا لتفاعل حددها الخميرة اثنين الهجين أو فحص قياس الطيف الكتلي يتطلب المصادقة على التفاعل باستخدام تقنية الثانية. وعادة ما يتم استخدام مناعي المشترك أو المنسدلة فحص لهذا الغرض 3. عيب واحد من استخدام هذه التقنيات من أجل التحقق هو شرط لتحلل الخلية، التي تقضي على الظروف داخل الخلايا التي قد تكون ضرورية للحفاظ على بعض التفاعلات البروتين. والعيب الثاني هو أن ضعف أو عابرة تفاعلات البروتين يمكن أن تتعطل أثناء الغسيل الخطوات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المقايسات مطالبة التدريب العملي على هامة الزمن، محدودة في عدد العينات التي يمكن معالجتها في وقت واحد، وغالبا ما تتطلب وقتا طويلا الأمثل من الكواشف والبروتوكولات.
للتغلب على بعض المشاكل المرتبطة التجارب المشتركة مناعي، وقد وضعت عدة فحوصات على أساس الفلورسنت وbiolumالبروتينات inescent التي يمكن استخدامها في الخلايا الحية. استندت أول هذه المقايسات على الإسفار (أو فورستر) نقل الطاقة الرنين (الحنق)، ونقل غير الإشعاعي للطاقة بين اثنين من البروتينات الفلورية مع تداخل الانبعاثات والإثارة أطياف 4. كفاءة نقل الطاقة هو بقوة تعتمد على المسافة، وبالتالي رصد ظاهرة الحنق يتطلب أن fluorophores المانحة ومتقبل يكون على مقربة. لاختبار تفاعل بين اثنين من البروتينات من الفائدة، يتم التعبير عن بروتين واحد كما التحام مع fluorophore المانحة (بروتين فلوري سماوي عادة؛ CFP)، والثاني باعتباره الانصهار مع fluorophore متقبل (بروتين فلوري الصفراء عادة؛ YFP). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام قد جعل fluorophores المانحة ومتقبل قريبة بما فيه الكفاية لنقل الطاقة لتحدث، الأمر الذي سيؤدي إلى زيادة يمكن قياسها في انبعاث الضوء من YFP متقبل بالنسبة إلى الجهات المانحة CFP. FRوقد ET الناجحة في الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية 4. العيب الرئيسي من استخدام الحنق للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات هو شرط لإضاءة في الهواء الطلق لالإثارة من fluorophore المانحة. النتائج إضاءة في الهواء الطلق في خلفية عالية في إشارة الانبعاثات، الإثارة غير المرغوب فيها من متقبل، وphotobleaching من كل من الجهات المانحة وfluorophores المتقبلة. هذه الآثار تقلل من حساسية من فحص للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات.
وهناك تعديل للمقايسة الحنق الذي يتغلب على مشكلة خلفية عالية من الإضاءة الخارجية هو ضوء بارد نقل الطاقة الرنين (بريت) مقايسة 5،6. في النظام بريت يتم استبدال fluorophore المانحة بواسطة انزيم luciferase المراسل. وبالتالي يتم إنشاء الطاقة من أجل الإثارة من fluorophore متقبل داخل النظام عن طريق أكسدة الركيزة luciferase المراسل، مما يجعل إضاءة في الهواء الطلق لا لزوم لها. في معظمالتكوين شيوعا من هذا الاختبار، هو الجهة المانحة Renilla كلوية الشكل luciferase المراسل ومتقبل هو YFP (لمناقشة المانحة البديلة والبروتينات المتقبلة نرى Pfleger آخرون 5). وفقا لذلك، في هذا النظام، وتنصهر بروتين من الفائدة لو luciferase بروتين التفاعل المحتمل لYFP، أو العكس بالعكس. مقايسة بريت يتطلب إضافة coelenterazine باعتبارها الركيزة لluciferase المراسل. لأن coelenterazine هي خلايا قابلة للاختراق، فمن الممكن لتنفيذ المقايسات بريت في الخلايا الحية. ومع ذلك، coelenterazine الأم غير مستقرة في محلول مائي، وانهيار انزيم مستقلة عن coelenterazine على حد سواء يقلل من تركيز الركيزة المتاحة للفحص ويولد autoluminescence، مما يقلل من حساسية قياسات luciferase النشاط. وقد تيسر استخدام بريت في الخلايا الحية من خلال تطوير coelenterazines المحمية، التي هي مستقرة في محلول مائي ولكن المشقوق بواسطة استريز عصاري خلويو بعد نشرها عبر غشاء الخلية لتوليد coelenterazine نشطة داخل الخلية 7.
بعد إضافة الركيزة لالخلايا معربا عن luciferase المراسل والبروتينات YFP الانصهار، وكميا نقل الطاقة الناتجة عن التفاعلات البروتين البروتين من خلال مراقبة الانبعاثات من luciferase المراسل وYFP. بسبب تفاعلات البروتين يمكن رصدها مباشرة في الخلايا الحية في لوحات متعددة جيدا، وفحص بريت يشكل، طريقة بسيطة قابلة للتحقق من صحة التفاعلات المفترضة التي هي من حيث التكلفة والوقت فعالة.
بالإضافة إلى التحقق من صحة interactors المفترضة المحددة في دراسات فرز البروتين، يمكن للنظام بريت أن تستخدم أيضا لinteractors مرشح اختبار الناشئة عن الدراسات البيوكيميائية والهيكلية السابقة على البروتين من الفائدة. مرة واحدة وقد تم تثبت وجود تفاعل البروتين البروتين (سواء باستخدام مقايسة بريت أو عن طريق تقنيات أخرى)، فإن هناك إمكانية لفحص BRET أن تكون خطة الإدارة البيئيةloyed أخرى لتوصيف التفاعل. على سبيل المثال، المناطق التفاعل يمكن تعيينها عن طريق توليد إصدارات اقتطاع من البروتينات، وإشراك بقايا محددة في التفاعل يمكن البرهنة من خلال خلق الطفرات نقطة. وعلاوة على ذلك، وأثر تغييري من تعديلات ما بعد النقل أو الجزيئات الصغيرة (مثل المخدرات أو بروابط) على تفاعلات البروتين البروتين يمكن التحقيق 8-10.
لديه فحص بريت أيضا إمكانات كبيرة للتحقيق طفرات في الحمض النووي التي تم تحديدها المريض. في الحالات التي تم فيها إنشاء دور المسبب للطفرة، ودراسة تأثير الطفرة على البروتين البروتين التفاعلات باستخدام BRET قد تكشف المزيد عن المسببات الجزيئية من النمط الظاهري 11. منذ ظهور منهجيات تسلسل الجيل المقبل، فإنه من الشائع على نحو متزايد لعدة طفرات الإضرار يحتمل الكشف عن هويته داخل الفرد، وفي هذه الحالة فإنه من غير الواضح التي هي RELEVANT إلى النمط الظاهري 12. في هذه الحالة قد يكون الفحص بريت قيمة في تقييم أثر الطفرات على وظيفة البروتين، وبالتالي أهميتها لهذا الاضطراب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصميم بنيات التعبير البروتين الانصهار هو خطوة حاسمة في إعداد مقايسة بريت. في التجارب المعروضة هنا، وتنصهر البروتينات التي تهم C-محطة من luciferase المراسل أو YFP. ومن الممكن أيضا، وربما يكون من الضروري، لتلتحم البروتينات إلى N-محطة من luciferase المراسل / YFP. بالنسبة لبعض البروتي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96 microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
References
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
- Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
- Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
- Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
- Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
- Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
- Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
- Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
- O’Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
- Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
- Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
- Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
- Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
- MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
- Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
