Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

doi: 10.3791/51438 Published: May 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

Abstract

생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에 기초 분석법은 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링하는 민감하고 신뢰할 수있는 수단을 제공한다. 브레 트 '수용체'형광 단백질 '기증자'루시퍼 라제 효소의 에너지의 비 복사 전달합니다. 이 분석의 일반적인 구성에서, 도너는 레 닐라 레니 포르 미스 루시페라아제이고 셉터 옐로우 형광 단백질 (YFP)이다. 에너지 전달의 효율이 강하게 거리 종속적이므로, BRET 현상의 관찰은 도너 및 억 셉터가 가까이에있을 것을 요구한다. 배양 된 포유 동물 세포에 대한 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 루시퍼와 YFP와 융합으로 두 번째로 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 기증자 및 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까운 수용체를 가져올 수 있습니다. 단백질 - 단백질을 조사하는 다른 기술에 비해teractions는 브렛 분석이 민감하여, 작은 손에 시간과 몇 가지 시약을 필요로하고, 약한 일시적인, 또는 살아있는 세포 내에서 발견 생화학 적 환경에 따라 달라질 수 있습니다 상호 작용을 검출 할 수있다. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석계 프로테오믹스 연구에 의해 제안 된 추정 적 상호 작용을 확인하기위한 최적의 접근 방법이며, 또한 그것은 단백질 - 단백질 상호 작용에 번역 후 변형의 효과를 평가하는, 맵핑 상호 작용 영역에 적합하고, 환자에서 확인 된 DNA 돌연변이의 영향을 평가.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

서열은 인간 질환의 분석 고전 링키지 차세대 모두 생물학적 경로의 범위에 관련된 단백질의 임상 적 관련성을 공개한다. 그것은 이전에 이러한 연구에서의 식별에,이 단백질의 생물학적 역할을 거의 또는 전혀 조사가되어 있는지, 자주 경우입니다. 그 단백질의 생물학적 기능을 탐험 시작하는 한 유익한 수단은 생리 학적 맥락에서 상호 작용하는 다른 어떤 단백질을 식별하는 것입니다. 이 방식으로 분자 네트워크를 특성화하는 것은 인간의 표현형의 기초가되는 생물 학적 경로에 대한 통찰력을 제공합니다.

가장 자주 사용되는 대규모 스크리닝은 또한 단백질 후보 상호 작용 파트너를 식별하기위한 접근법 효모이 - 하이브리드 스크리닝 1 및 질량 분석 기반 단백질 체학이있다. 이러한 방법은 잠재적 인 상호 작용하는 단백질을 제안에 매우 성공적으로 될 수 있지만 아칸소 할 수 있습니다거짓 긍정적 인 결과에 취약 전자. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석법 스크리닝에 의해 식별 상호 작용의 확인은 제 기술을 사용하여 상호 작용의 확인을 요구한다. 일반적으로 공동 면역 또는 풀다운 분석은 이러한 목적으로 3에 사용됩니다. 검증에 대한 그러한 기술을 사용하는 한 가지 단점은 특정 단백질 상호 작용을 유지하기 위해 필수적 일 수있다 세포 내 조건을 파괴하는 세포 용해를위한 필요 조건이다. 두 번째 단점은 약하거나 과도 단백질 상호 작용은 세척 단계에서 중단 될 수 있다는 것이다. 또한, 이들 분석법은 중요한 실제적인 시간을 요구를 동시에 처리 할 수​​있는 샘플의 수에 한정되며, 종종 시약 및 프로토콜의 시간 소모적 인 최적화를 필요로한다.

공동 면역 침전 실험과 관련된 문제들을 극복하기 위해, 몇개의 형광 분석법과 biolum 기반으로 개발되어왔다생균에 사용될 수 inescent 단백질. 최초의 분석은 형광 (또는 포스터) 공명 에너지 전달 (FRET), 중복 방출 및 여기 스펙트럼 4 개의 형광 단백질 사이의 에너지의 비 복사 열전달에 근거했다. 에너지 전달의 효율성 따라서 FRET 현상의 관찰은 기증자와 수용체 형광이 가까이에 있어야 강하게 거리에 의존합니다. 및 수용체의 형광 (일반적으로 노란색 형광 단백질, YFP)과의 융합으로 두 번째, 그 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 기증자 형광 (CFP 일반적으로 시안 형광 단백질)를 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 CFP 기증자에 YFP 수용체의 상대에서 빛의 방출의 측정 증가시킬 것이다, 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까이 기증자와 수용체 형광을 가져올 수 있습니다. FRET는 살아있는 세포 4의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출에 성공했다. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 FRET 사용의 주된 단점은 도너 형광 물질의 여기를위한 외부 조명을위한 필요 조건이다. 발광 신호 수용체의 원치 않는 여자, 기증자와 수용체의 형광 모두의 광표백 높은 배경의 외부 조명 결과. 이러한 효과는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 분석의 민감도를 감소시킨다.

외부 조명에서 높은 배경의 문제를 극복 FRET 분석의 수정은 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 분석 5,6입니다. 브렛 시스템에서 기증자 형광은 루시 페라 제 효소에 의해 대체된다. 따라서 셉터 형광체의 여기를위한 에너지는 불필요한 외부 조명 렌더링 루시퍼 기판의 산화에 의해 시스템 내에서 생성된다. 대부분의이 분석의 일반적인 구성, 기증자는 레 닐라 루시 페라 제를 레니 포르 미스 및 수용체가 (다른 기증자와 수용체 단백질에 대한 설명 피플 등. 5 참조) YFP입니다. 따라서, 이러한 시스템에서는, 그 단백질은 루시퍼 라제 및 잠재적으로 상호 작용하는 단백질 YFP로, 또는 그 반대에 융합된다. 브렛 분석은 루시 페라 제에 대한 기질로 엘렌 테라를 추가해야합니다. 엘렌 테라 세포 투과성이므로, 생균에 BRET 분석법을 수행하는 것이 가능하다. 그러나, 네이티브 엘렌 테라는 수용액 중에 불안정하고, 엘렌 테라의 효소 독립적 고장 분석이 가능하고, 기판의 농도를 감소시키고, 루시퍼 라제 활성의 측정의 감도를 감소 autoluminescence를 생성 둘. 생균의 BRET의 사용은 수용액 중에서 안정하지만, 세포질 에스 테라 제에 의해 절단되어 보호 coelenterazines의 발달에 의해 촉진되었다세포 내에서 활성 7 엘렌 테라를 생성하는 세포의 막에 걸쳐 확산 이후의.

루시퍼 라제 및 YFP 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 기질을 첨가 한 다음, 단백질 - 단백질 상호 작용으로 인해 발생하는 에너지 전달은 루시퍼 라제 및 YFP로부터 방출 모니터링에 의해 정량화된다. 단백질 상호 작용은 멀티 웰 플레이트의 생균 직접 모니터링 할 수 있기 때문에, BRET 분석은 비용 및 시간 효율적인 추정 적 상호 작용을 검증하기위한 단순하고 확장 가능한 방법을 구성한다.

프로테오믹스 스크리닝 연구에서 확인 된 추정 인터랙 유효성 외에 BRET 시스템은 또한 단백질의 생화학 적 및 구조적 종래 연구에서 발생하는 테스트 후보 인터랙하는데 사용될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용의 존재는 (BRET 분석법을 사용하여 또는 다른 기술에 의해 어느) 설정되면 BRET 분석은 EMP 되려면 전위있어loyed 더욱 상호 작용을 특성화. 예를 들어, 상호 작용 영역은 단백질의 절단 된 버전을 생성하여 매핑 할 수 있고, 상호 작용의 특정 잔기의 참여는 점 돌연변이를 생성함으로써 입증 될 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 전사 후 수정하거나 (예 : 약물이나 리간드 등) 작은 분자의 조절 성 효과는 8-10를 조사 할 수 있습니다.

브렛 분석은 환자의 DNA에서 확인 된 변이를 조사하는 큰 잠재력이있다. 경우에 돌연변이의 원인이되는 역할은 브렛은 표현형 (11)의 분자 원인에 대해 더 보여줄 수 있습니다 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 돌연변이의 효과를 연구, 설립 된 곳. 몇몇 잠재적으로 파괴적인 돌연변이가 RELE가되는 불분명 한 경우에, 개별 내에서 식별 될 차세대 시퀀싱 방법의 출현 때문에, 점점 더 일반적인표현형 12 원하시오. 이 상황에서 브렛 분석은 단백질 기능에 돌연변이의 영향을 평가하는 가치와 장애에 따라서 자신의 관련성을 할 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

플라스미드의 1. 만들기

  1. (그림 1) 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 모두 pLuc 및 pYFP 벡터로 그 각각의 단백질의 cDNA를 서브 클론. 자세한 프로토콜의 경우 녹색 등의 알 (13)에게 참조하십시오.
  2. 순서는 모든 관심의 단백질이 중간에 정지 코돈을 가진 배낭 / YFP 시퀀스 프레임에 있는지 확인하기 위해 생성합니다.
  3. 융합 단백질은 생물학적 활성을 유지하는 것이 확인 원하는 기능 분석을 수행합니다. 여기에 제시된 경우 YFP 융합 단백질의 세포 내 국소화 형광 현미경에 의해 확인 하였다.
  4. pLuc 및 pYFP 발현 벡터에 관련 타겟팅 신호를 공학에 의해 적절한 루크와 YFP 제어 단백질 발현 플라스미드를 확인합니다. 여기에 제시된 경우, pLuc 및 pYFP 벡터로 핵 지방화 신호를 삽입하여 핵 대상 루크와 YFP 구조를 생성합니다.
  5. 확인배낭 및 YFP는 단일 폴리펩티드에 융합 된 양성 대조군 구조체. 여기에 제시된 경우, YFP 코딩 서열이 pLuc 벡터에 삽입 한 양성 대조군을 생성한다.
  6. 형질 감염 혼합물에 DNA의 질량을 등화하는 데 사용되는 중간 필러 플라스미드를 선택한다. 더 진핵 생물의 프로모터가없는 플라스미드를 사용하기 때문에 이러한 박테리아 클로닝 벡터와 같은 포유 동물 세포에서 전사적으로 비활성화됩니다.

DNA 믹스 2. 준비

  1. 260 nm에서의 흡광도에 기초하여 제 1 절에 설명 된 모든 플라스미드의 농도를 추정 (한 흡광도 유니트는 50 ㎍ / ml의 DNA에 상당). 650 Da 님 염기쌍의 개수를 곱하여 각 플라스미드의 분자량을 결정한다. 각 플라스미드 제제의 몰 농도를 계산하는 농도 및 분자량을 사용한다. 36 ㎚의 농도로 플라스미드 DNA 제제를 희석. 이러한 작업을 보유하고있을 것즉, 형질 감염을위한 DNA 혼합물을 제조하는데 사용될 것이다.
  2. 물 20 ㎕의 최종 부피 필러 플라스미드 1800 NG 함유 제어 DNA 혼합물을 준비한다.
  3. pLuc 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다.
  4. pLuc 제어 구조의 5 μL와 pYFP 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다.
  5. 긍정적 인 제어 구조의 5 μl를 포함하는 제어 DNA 믹스를 준비합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다.
  6. 다음 DNA는 관련 pLuc이 구성의 5 μL와 PY의 5 μl를 결합하여 각 DNA 믹스의 경우 관심, X의 단백질의 homodimerization에 대한 테스트를 혼합 준비FP는 구성. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다.
    A) pLuc 제어 및 pYFP-X
    B) pLuc-X 및 pYFP 제어
    C) pLuc-X 및 pYFP-X
  7. 다음 DNA가 관심의 단백질의 쌍 사이의 상호 작용에 대한 테스트를 믹스 준비, X와 Y는 각각의 DNA 믹스는 관련 pLuc이 구성의 5 μl를 결합하고 pYFP의 5 μL를 구성합니다. 1800 NG에 총 DNA의 질량을 가지고 필러 플라스미드를 추가합니다. 20 μL에 최종 볼륨을 가지고 물을 추가합니다.
    A) pLuc 제어 및 pYFP-X
    B) pLuc-X 및 pYFP 제어
    C) pLuc 제어 및 pYFP-Y
    D) pLuc-Y와 pYFP 제어
    E) pLuc-X 및 pYFP-Y
    F) pLuc-Y와 pYFP-X

3. 형질

  1. 수확 75cm 2 플라스크에서 HEK293 세포를 subconfluent. 문화 매체의 13 ML에 전체 세포의 10 %를 희석. 백색의 각 웰에 세포 현탁액 130 μl를 분배클리어는 96 - 웰 조직 배양 접시 바닥. 24 시간 동안 배양 세포.
  2. (3)에 의해 DNA 혼합물의 수를 곱함으로써 형질 감염 될 웰의​​ 수를 계산한다. 실온까지 무 혈청 배지를 가져온다. 무 혈청 배지의 6.3 μL 잘 당 0.18 μL 형질 전환 시약을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이로 교반하여 혼합하고 5 분 실온에서 알을 품다.
  3. 무 혈청 배지 / 형질 전환 시약 마스터 믹스 20 ㎕로 DNA 믹스의 2 μl를 추가하여 형질 믹스를 준비합니다. 없는 소용돌이를 수행합니다. 10 분 동안 실온에서 배양한다.
  4. 물론 당 형질 믹스의 6.5 μl를 분배 각 형질 믹스 세 우물을 형질. 추가로 36 ~ 48 시간 동안 배양 세포.

브레 신호 4. 측정

  1. 소용돌이로 교반하여 DMSO에 34 ㎎ / ㎖에서 살아있는 세포 루시 페라 제 기판을 녹입니다.
  2. 기판 희석 매체 (P)에 1:1,000로 재구성 살아있는 세포 루시페라아제 기판 희석37 ° C.에 다시 따뜻하게 50 기판 희석 매체 ㎕의 당을 잘 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이. 침전물을 형성 할 수 있지만, 분석을 방해하지 않을 것이다.
  3. 96 - 웰 플레이트에서 문화 매체를 대기음. 각 웰에 희석 살아있는 세포 루시 페라 제 기판의 50 μl를 분배. 적어도 2 시간 (최대 24 시간) 배양 세포.
  4. 96 - 웰 플레이트로부터 뚜껑을 제거하고 내부 조도계 실온에서 10 분 동안 플레이트를 배양한다.
  5. 물론 한 번에 루크와 YFP 하나에서 방출을 측정한다. 이상 470 nm의보다 파장을 차단하는 필터를 사용하여 루크에서 방출을 측정한다. 500-600 nm의 대역 통과 필터를 사용 YFP에서 발광을 측정한다. 10 초 동안 방출 신호를 통합 할 수 있습니다.

5. 데이터 분석

  1. 만 필러 플라스미드를받은 3 우물에서 루크 방출 수치를 평균. 배경 차감-Luc에서 방출 값을 생성하기 위해 다른 모든 배낭 방출 판독 현재 값을 뺀다.
  2. 만 필러 플라스미드를받은 3 우물에서 YFP 방출 수치를 평균. 배경 차감-YFP 방출 값을 생성하기 위해 다른 모든 YFP 방출 판독 현재 값을 뺀다.
  3. 각 웰의 경우, 나안 BRET 비율을 수득 배경 차감-Luc에서 방출 값 - 배경 차감 YFP 방출 값을 나눈다.
  4. 만 pLuc 제어 플라스미드로 형질 된 세 개의 우물에서 수정되지 않은 BRET 비율을 평균. 보정 BRET 비율을 제공하기 위해 모든 다른 나안 BRET 비율 현재 값을 뺀다.
  5. 보정 BRET 비율의 나머지 세트의 각각에 대해, 최종 BRET 비율을 구하는 세 형질 감염된 웰의 값을 평균.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BRET 분석의 원리는도 2에 도시되어있다. 여기에 제시된 실험 전반에 걸쳐 사용 된 분석 셋업은도 3에 도시된다. 루시퍼 라제-YFP 융합 단백질로 형질 감염된 세포에서 강한 BRET 신호의 검출이 에너지 전달이 관찰 것이 확인 이 실험 장치에서 (그림 4).

우리의 연구는 뇌의 발달에있는 전사 억제 자의 FOXP 가족의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. 가장 눈에 띄는 기능은 음성 14-16에 필요한 orofocial 근육 운동의 복잡한 시퀀스를 생산하는 개발 언어 dyspraxia-어려움으로있는 음성 및 언어 장애의 드문 형태로 FOXP2 리드에 영향을 미치는 이형 돌연변이. FOXP1 돌연변이 환자에서보고되었다 심한 말과 언어 문제 17-20 함께 자폐증 스펙트럼 장애와 지적 장애를 가진. 다른 단백질과 FOXPs의 상호 작용은 뇌의 발달에있는이 단백질의 역할에 관련된 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 조사 중입니다.

FOXP2 따라서 FOXP2의 homodimerization가 BRET 분석 (그림 4)의 유효성을 검사하는 데 사용 된 다른 FOXP 가족 부재 (21)와 호모 또는 이종를 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 이 분석에서 FO​​XP2 융합 단백질의 상호 작용은 단순 단백질의 과발현에 기인한다는 가능성을 배제하기 위해, 상호 작용의 특이성은 (잔기 E400있는 프레임 삭제) FOXP2의 류신 지퍼 이합체 화 도메인에 돌연변이를 도입에 의해 입증 된 호모와 heterodimerization 21 (그림 5A)을 방해하는 것으로 알려져 있습니다. 룩 - FOXP2.DE400 및 YFP-FOXP2 융합 단백질이 공동 발현되었을 때, BRET 신호의 감소는 배낭-FOXP2와 YFP-FOXP2는 (도 5b)의 공동 발현 있었을 때와 비교하여 관찰 하였다. 이시웨스턴 블롯 (데이터 미도시)에 의해 평가 gnal 감소 돌연변이 단백질 (도 5c)의 세포 내 지역화 또는 발현 수준의 차이에 변화에 기인하지 않았다. 룩 - FOXP2가 YFP-FOXP2.DE400 (데이터 미도시)로 표현 될 때 신호 환원도 관찰되었다. 따라서 BRET 단백질 homodimerization 검출에 효과적이며, 이러한 단백질은 루시페라아제 및 YFP-융합체로서 과발현되면 단백질의 상호 작용은 특정 남아있다. 또한, 단백질의 표적 돌연변이와 조합 BRET의 사용은 단백질 - 단백질 상호 작용에 관여 개별 잔기를 식별 할 가능성이있다.

이형 상호 작용 검출의 BRET 분석의 유효성을 평가하기 위해, FOXP1 함께 FOXP2의 상호 작용은 (도 6) 시험 하였다. 브레 신호, 즉 기증자로 FOXP2 또는 수용체 fusio로 (분석의 두 가지 구성에서 관찰되었다N 단백질). 따라서 브렛 분석은 호모 및 이형의 상호 작용을 모두 감지 할 수 있습니다. 또, 비 FOXP 단백질과 FOXP2의 상호 작용을 검출하기위한 BRET 분석의 적합성 CtBP1, 전사적 공동 억제하고 공지 FOXP2 상호 작용 파트너 (21)와 상호 작용을 조사함으로써 시험 하였다. CtBP1과 FOXP2 사이의 상호 작용은 원래 효모 두 하이브리드 화면에 의해 제안 된 이후에 공동 면역 침전 실험 (21)에 의해 확인되었다. FOXP2가 기증자의 융합 단백질이고 CtBP1이 아니라 역 구성 (그림 7A)에, 수용체 때 FOXP2-CtBP1 상호 작용은 브렛의 분석에 의해 발견되었습니다. 이러한 결과는 BRET 시스템 (토론 참조)로 예상되고있다. FOXP2와 CtBP1 간의 상호 작용은 CtBP1의 단지 작은 비율이 분석의 민감도를 강조 핵 (도 7B)에 국소 되었더라도 관찰되었다. 따라서 BRET분석은 효모 두 하이브리드 검사를 통해 확인 된 추정 상호 작용의 유효성 검사에 유용합니다.

마지막으로, BRET 분석법은 단백질 - 단백질 상호 작용에 FOXP2 병원성 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 사용 하였다. FOXP2 두 점 돌연변이는 음성 및 언어 (그림 8A)에 영향을 미치는 희귀 염색체 우성 질환을 일으키는 것으로보고되고있다. R553H 과오 돌연변이는 반 구성원이 장애 (14)에 의해 영향을 받았다고하는 대가족의 연계 연구를 통해 발견되었다. R328X 넌센스 돌연변이 발달 구두 dyspraxia (22)의 진단과 probands의 FOXP2 유전자 좌의 타겟 시퀀싱을 통해 발견되었다. 야생형 FOXP2와 이량 돌연변이 단백질의 기능은 BRET 분석을 사용하여 평가 하였다. 수용체와 같은 도너 및 돌연변이 FOXP2 같이 야생형 FOXP2를 이용한 결과를도 8b에 나타낸다. 동일한 결과가 m을 사용하여 관찰 하였다셉터 (데이터 미도시) 등의 도너와 야생형 같은 utant FOXP2. FOXP2의 DNA 결합 도메인 내 R553H 돌연변이는 야생형과 이량 돌연변이 단백질의 기능에 영향을 미치지 않았다. 이러한 돌연변이의 병원성 메카니즘 따라서 정상적인 단백질 (23)과 돌연변이의 이량 인한 지배적 부정적인 영향을 포함 할 수있다. R328X 돌연변이 부호화 단백질 류신 지퍼 이량 체화 도메인 및 DNA 결합 도메인이 결여, 일부 세포질 mislocalization (도 8c)을 보여준다 그 결과, 조기 종결 코돈을 도입. 세포질에 이합체 도메인과 mislocalization의 부재와 일치, 절단 된 단백질은 크게 야생형 FOXP2와의 상호 작용을 감소 보여줍니다. 이 돌연변이는 그러므로 인해 haploinsufficiency에 병원성 될 가능성이 높습니다. 따라서 브렛 분석은 환자에서 발견 된 돌연변이의 생물학적 효과에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.


그림 1. YFP과 루시 페라 제 융합 단백질의 발현 벡터. A) pYFP 및 pLuc 벡터의 서클지도. pLuc 벡터는 BRET 공여체로서 루시페라아제 융합 단백질의 발현에 사용된다. BRET는 수용체로서 pYFP 벡터는 YFP 융합 단백질의 발현에 사용된다. 벡터는 포유 동물 세포에서 높은 수준의 표현을위한 CMV 프로모터 (P CMV), 그 단백질에 대한 cDNA를 삽입하기위한 여러 복제 사이트 (MCS) 및 카나마이신 저항성 유전자 (칸 R)과의 전파에 대한 세균의 복제 기원이 세균의 플라스미드. B) pLuc 및 pYFP 벡터의 여러 복제 사이트. YFP 코딩 서열의 끝은 파란색으로 표시됩니다. 선택 제한 사이트는 주석이됩니다. XBA I 사이트가 비켜에 의해 차단되어 있습니다E.의 표준 균주에 댐 메틸화를 rlapping 대장균. 관심 단백질을 코딩하는 cDNA는 프레임에 나타낸 아미노산 서열을 가진 복제되어야한다. 여기에 설명 된 실험에서, 인서트 (밑줄)의 BamHIXBA I 제한 효소 부위에 클로닝 하였다. 정지 코돈은 루시퍼의 끝에서 제거하고 YFP는 루시퍼 라제 / YFP와 그 서브 클로닝 된 cDNA를 포괄하는 오픈 리딩 프레임을 제공하는 시퀀스를 코딩. 중지 코돈 따라서 그것이 삽입 된 cDNA에 정지 코돈을 포함하는 필수적인 것은 아니다 (적색 도시) 모두 세 개의 판독 프레임에서 다중 클로닝 부위의 말단에 존재한다.

그림 2
브렛 시스템의 그림 2. 원리는. 그 단백질은 X와 Y는, 기증자 루시 페라 제 효소 (루크, 발광 피크 475 n으로 융합m)와 수용체의 형광 단백질 (YFP, 발광 피크 530 nm의), 각각. 융합 단백질은 배양 된 포유 동물 세포에서 발현되며 루크에서 세포 투과성 루시퍼 기판, 발광 다음 첨가는 500-600 nm의 대역 통과 필터를 사용하여 측정된다 이상 YFP에서 430 ㎚, 발광 이상의 파장을 차단하는 필터를 사용하여 측정된다. 단백질 X와 단백질 사이의) 단백질 X와 YFP의 배낭에서 단백질 Y. 에너지 전송 사이의 상호 작용이 발생하지 않습니다. B) 상호 작용 Y. 공명 에너지 전달하여 측정 방출의 비율의 증가를 일으키는 원인이 YFP에 루크에서 발생 500-600 nm의 대역 통과 필터는 470 나노 미터보다 더 긴 파장을 차단하는 필터에 비교.

그림 3
그림 3. 분석 설정.을 테스트하는 분석 설정상호 작용은 그 두 단백질 사이에, X 및 관심 Y. 단백질은 BRET 수용체와 브렛 기증자과 노란색 형광 단백질 (YFP)로 루시 페라 제 (루크)에 융합된다. .)은 각 플레이트에 포함되도록 제어하는 경우 적절한 제어 단백질, 배낭 및 YFP은 중요한 세포 내 구획 (P)에 대한 타겟팅 된 신호를 포함하는 펩타이드에 융합된다. 발광 및 조도계 잡음 및 기판의 효소 독립적 고장으로 인해 발생하는 형광의 배경 수준을 확립하기 위해 1) 모의 형질 제어; 2) BRET 수용체의 부재하에 YFP의 발광 범위 내에서 검출되는 루시퍼 라제 발광의 비율을 설정하는 pLuc 제어만을 형질; 3) pLuc 제어 및 루크 - YFP의 상호 작용에서 발생하는 기준 BRET 신호를 설정하는 pYFP 제어의 형질; 4) 양성 대조군으로 뤽-YFP 융합의 형질은 BRET 신호를 측정 할 수 있는지 확인합니다. B) experim 세트그 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 ental 조건, X와 Y 1, 2, 4, 5)의 관심과 루크 / YFP의 단백질 사이의 비특이적 상호 작용을 제어; 수용체와 기증자와 Y로 X 3) 시험 조건; 수용체와 기증자와 X로 Y 6) 시험 조건.

그림 4
FOXP2의 homodimerization의 그림 4. 감지. A) FOXP2 동종이 량체의 검출을위한 BRET 분석의 유효성을 검사하려면, HEK293 세포 루시 페라 제 (기증자) 또는 FOXP2 (P2) 또는 핵 지방화 신호 중 하나에 융합 YFP (수용체)의 발현을위한 구조로 형질 전환 된 (-). 핵 대상 루시퍼와 YFP 단백질은 음의​​ 컨트롤을 제공합니다. 브레 신호의 검출을위한 양성 대조군으로, 세포는 루시퍼 라제-YF의 표현을위한 구조로 형질 전환 된) 또는 YFP는 FOXP2 (P2)에 융합로 -. 핵 지방화 신호 (융합 YFP로 형질 세포의 P 융합 단백질 (+) B) 형광 현미경 이미지.

그림 5
그림 5. 분석 특이성을 설명하는 이량 결핍 FOXP2의 사용합니다. 이량을 방해 DE400 돌연변이의 위치를 표시하는 FOXP2 단백질 A) 개략도. 류신 지퍼 이합체 도메인은 녹색으로 표시되고, 단백질의 과발현은 브렛 분석에서 위양성 결과가 발생할 수 있는지 여부를 테스트하려면 노란색. B)의 DNA 결합 도메인은 분석의 특이성은 FOXP2.DE400를 사용하여 평가 하였다 변형. 세포는 루시 페라 제 (기증자) 또는 FOXP2 (P2)에 융합 YFP (수용체), FOXP2.DE400 (DE) 또는 nuclea의 표현 구조와 형질 전환 된R 현지화 신호 (-). FOXP2 (P2) 또는 FOXP2.DE400 (DE)에 융합 YFP로 형질 세포의 C) 형광 현미경 이미지.

그림 6
FOXP1-FOXP2 heterodimerization의 그림 6. 감지. A) 상동 단백질 FOXP2와 FOXP1 사이 heterodimerization의 검출을위한 BRET 분석의 유효성을 검사하려면, 세포 루시 페라 제 (기증자) 또는 FOXP2 (P2 하나에 융합 YFP (수용체))의 표현을위한 구조로 형질했다, FOXP1 (P1) 또는 핵 지방화 신호 (-). FOXP1 (P1) 또는 FOXP2 (P2)에 융합 YFP로 형질 세포의 B) 형광 현미경 이미지.

그림 7
B) CtBP1 (CTBP) 또는 FOXP2 (P2)에 융합 YFP로 형질 세포의 형광 현미경 이미지.

그림 8
도 8. 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 병원성 FOXP2 변이의 효과를 평가한다. 레어 FO 발생할 R553H 및 R328X 돌연변이 위치를 나타내는 FOXP2 단백질 A) 개략도음성 및 언어 장애의 RM. 로이신 지퍼 이량 체화 도메인은 녹색 및 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 병리학 적 돌연변이의 영향을 평가하기위한 BRET 분석의 실용성을 평가하기 위해 옐로우. B의 DNA-결합 도메인)에 도시에 R553H 및 R328X 돌연변이 효과 통상 FOXP2와 이량 FOXP2 돌연변이 단백질의 능력을 조사 하였다. (-). C 세포는 루시 페라 제 (기증자) 또는 하나 정상 FOXP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), 또는 핵 지방화 신호에게 융합 YFP (수용체)의 발현을위한 구조로 형질했다 ) YFP로 형질 세포의 형광 현미경 이미지는 FOXP2.R553H (R553H) 또는 FOXP2.R328X (R328X)에 융합. 이 이미지에서 FO​​XP2.R328X는 주로 핵이지만, 인구 내에서 다른 세포보다 세포 내 분포를 보여줍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

융합 단백질 발현 구조물의 설계는 BRET 분석을 설정하는 중요한 단계이다. 여기에 제시된 실험에서, 관심의 단백질은 루시 페라 제 또는 YFP의 C-말단에 융합되었다. 또한 가능하고, 루시퍼 / YFP의 N-말단에 단백질을 융합하기 위해 필요할 수 있습니다. 일부 단백질의 경우, 융합체는 단백질 구조와 기능의 혼란을 피하기 위하여 N-또는 C-말단 중 하나에서 허용 될 수있다. 또한, 막 횡단 단백질있는 N과 C 말단은 루시퍼 라제 / YFP 단백질 상호 작용 파트너와 같은 구획에 말단에 융합되어야 상이한 세포 내 구획에 상주. 예를 들면, 막 관통 G-단백질 결합 수용체 세포질 β-arrestin는 간의 상호 작용의 연구에서, 루시퍼 라제는 막 횡단 수용체 (8)의 세포 내 카복실 꼬리에 융합시켰다. 다른 경우에는 단백질 - 단백질 interacti의 형상에 에너지 전달이 융합 단백질의 두 가지 조합 중 하나를 사용하여보다 효율적으로되는 발생할 수 있습니다. 때때로 에너지 전달은 거짓 부정적인 결과로 이어지는, 모든 하나의 조합을 사용하는 경우 검색되지 않을 수 있습니다.

루시퍼 라제 / YFP 및 관심 단백질 사이의 펩티드 링커 서열로는 공명 에너지 전달의 효율에 영향을 미칠 수있다. 링커는 루시퍼 라제 / YFP과 관심의 단백질을 방해하지 않고 접을 수 있도록 충분히 길어야한다. 이상 링커는 루시퍼 라제 / YFP하고 도너와 억 셉터 쌍극자의 정렬을 용이하게함으로써 BRET 효율을 증가시킬 수있다 또한 단백질의 접합부에서 폴리펩티드에 더 큰 유연성을 부여한다. 링커에 너무 유연성이있는 경우에는, BRET의 효율이 저하 될 우려가있다. 여기에 실험에서, 표현 VEC의를 BamHI I 및 XBA I 사이트에 관심의 단백질의 복제도 1에 도시 된 바와 같이 TORS는 23-아미노산 링커 결과.이 링커는 단백질의 여러 쌍 사이의 상호 작용을 검출하기 위해 성공적이었다.

실험을 진행하기 전에 브렛은 융합 단백질은 정상적인 생물학적 활성을 유지하는 것이 보장되어야한다. YFP의 기능은 형광 현미경을 사용하는 직접적인 시각화에 의해 평가 될 수있다. 루시퍼 라제의 작용은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 정량 할 수있다. 관심의 단백질의 세포 내 현지화에 융합의 효과는 직접 시각화하여, 면역 염색, 또는 YFP - 융합의 경우에 의해 평가 될 수있다. 또한 단백질의 기능에 융합의 효과가 단백질 고유 분석법에 의해 조사 될 수있다 - 예를 들면, 전사 인자 것이 DNA-결합 활성을 검정을 적절할 수있다. 실험 중에 그 발광 측정이 편리 인 분석 확인을 제공하는 참고루시퍼 라제 활성의 ATION.

그것은 적절한 제어 구조는 관심의 단백질이 무엇인지 고려하는 것이 중요합니다. YFP과 루시 페라 제는 주로 세포질하고 관심의 단백질이 세포질 때 따라서 적절한 컨트롤입니다. 또한 단백질이 다른 세포 내 구획으로 지역화 때 그러나 중요한 구획 그들의 거래를 지시하는 신호 펩타이드와 루시퍼 라제 및 YFP을 수정하는 것이 바람직 할 수있다. 여기에서 관심의 단백질 따라서 루시퍼 라제, 핵에 지역화 및 YFP은 핵 이행 시그널의 첨가에 의해 변성 된 전사 인자되었습니다. 특히, SV40 큰 T 항원 (CGYGPKKKRKVGGLDN)의 핵 지방화 신호를 포함하는 펩티드 HI와 일의 XBA I 사이트 사이의 합성 이중 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 결찰에 의해 루시퍼와 YFP의 C-말단에 추가 된전자 pLuc 및 pYFP 벡터. 이 신호의 추가 핵 (그림 4B)에 단백질의 중요한 재분배가 발생했습니다.

적절한 컨트롤을 포함하면 BRET 실험의 해석에 매우 중요합니다. 불활성 충전제 플라스미드를 이용한 모의 - 형질 감염 제어와 발광 조도계 잡음 및 기판의 효소 독립적 고장으로 인해 발생하는 형광의 배경 수준을 확립하는 것이 필수적이다. 현대 luminometers과 루시 페라 제 기판 배경 발광 수준은 일반적으로 매우 낮다. 적절한 제어 루시퍼 YFP 구조의 부재 구성으로 형질 BRET 수용체의 부재하에 YFP의 발광 범위 내에서 검출되는 루시퍼 라제 발광의 비율을 설정하는 것이 중요하다. YFP 구문을 제어 루시페라아제 및 제어와 형질 루크-YFP 상호 작용으로 인해 발생하는 기준선 BRET 신호를 제공한다. 이브상호 작용을 위해 시험된다 단백질 RY 쌍, 그것은 테스트중인 단백질 및 루시 페라 제 / YFP 사이의 비특이적 상호 작용을 제어하기 위해,도 3b에 도시 된 바와 같이, 적절한 제어 구조 홀로 각 형질하는 것이 중요하다. 처음 BRET 실험을 수행 할 때 특히, 그것은 BRET 신호가 실험 설정에서 관찰 할 수 있도록 양성 대조군으로서 뤽-YFP 융합 단백질을 포함하는 것이 중요하다. 여기 YFP의 코딩 서열 YFP는 루시퍼 라제의 C-말단에 융합 된 융합 단백질을 생성하는 HI 및 XBA I 사이트에서 pLuc로 클로닝 하였다.

여기에 설명 된 프로토콜에서 DNA의 조성물은 형질가 배낭 / YFP 융합 단백질 발현의 평균 크기가 7.5 KB 이하인 생성한다는 가정하에 계산 하였다 위해 믹스. 만약 식 construcTS는 이보다 훨씬 큰 후 형질 혼합 하였다 각 식 구조의 몰수가 혼합에서 DNA의 총량이 형질 전환 시약의 양에 의해 허용 된 최대 값을 초과하지 않도록 감소 될 필요가있다. 대안 적으로 모든 형질 전환 혼합물에 형질 감염 시약 및 DNA의 양의 양은 제조자의 지침에 따라 증가 될 수있다. 96 - 웰 플레이트의 실험 조작은 멀티 채널 피펫 및 흡인기의 사용에 의해 급송된다. 따라서 제 혼합을 10 분 동안 배양 한 내용으로 형질 즉시 세포 혼합물 첨가 시작 혈청 배지 / 형질 전환 시약 혼합물에 DNA의 첨가 후 형질 혼합 배양 시간의 길이는 샘플 사이의 편차를 최소화하는 것이 바람직하다 . BRET 수용체 단백질 YFP 융합체되어 있기 때문에, 형광 현미경에 의해 또는 마이크로 플레이트 재에서 형광을 측정하여 형질 전환 효율을 평가하는 것이 가능하다ADER. 그것은 그 형질이 BRET 신호의 기판과 측정의 추가로 진행하기 전에 충분한 지 확인하는 것이 좋습니다 있도록 BRET 실험의 성공은 형질의 좋은 수준에 따라 달라집니다. YFP 태그는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 수용체 단백질 발현 량의 정량을 가능하게한다. 수용체 단백질 수준의 정량화 최적화 및 BRET 실험의 문제 해결에 유용 할 수 있습니다.

세포를 안정적으로 신호가 달성되었는지 확인 BRET 신호를 측정하기 전에 루시페라아제 기판과 적어도 2 시간 동안 배양한다. 그것은 최대 24 시간 동안 기판과 세포를 배양하는 것도 허용됩니다. 이 경우 총 발광 횟수가 낮게되지만, BRET 비율은 변경되어야한다. 기판과 긴 인큐베이션 (밤새 예) 더 편리하고 또한 실험 조작 전후 BRET 신호를 측정 할 수있다 그러한제약 화합물의 첨가로. 세포가 측정시기에 포화 상태에 도달 할 수 있도록 이상적으로, 세포의 파종 밀도를 최적화 할 수 있습니다. 세포 밀도가 최적 이상이면 그 후에 세포 과증식을 피하기 위하여 이전 시점 BRET 신호를 측정하는 것이 유리할 수있다. HEK293 이외의 다른 세포 유형을 사용하는 경우, 세포 배양 및 형질 전환 조건을 최적화해야합니다. BRET 실험도 성공적 여기서 설명한 프로토콜을 이용하여 HeLa 세포에서 수행되었다.

여기에 설명 된 실험에서, 발광 횟수가 레 닐라 루시퍼 라제 활성을위한 최적 온도는 실온에서 측정 하였다. 루미의 시간 코스 실험을 수행하는 경우는 37 ℃의 온도를 설정하는 것이 바람직하다 우리는 실온에서 37 ° C에서 같은 실험을 수행 한 결과 유의 한 차이는 관찰되지 않았다. 실내 온도, 일에서 실험을 수행하는 경우E 플레이트 레 닐라 루시퍼 라제 활성의 안정화를 허용하기 위하여 측정 전에 내부 조도계 10 분간 평형화되어야한다. 여기, 발광 신호는 특히 낮은 표현 수준과 단백질, 일반적으로 높은 감도를 제공하는 10 초에 통합되었다. 이것은 충분한 민감도를 제공하는 경우에는, 신호가 짧은 시간주기에 걸쳐 통합 될 수있다. 인해 살아있는 세포 루시페라아제 기판에 의해 생성 발광 신호의 안정성, 각 파장에서 웰 당 최대 10 초 동안 측정 할 좋다.

시험 조건에서의 신호가 크게 관련 제어 조건에서 신호를 초과 할 때 그 두 단백질 사이의 상호 작용은 BRET 분석법에 의해 확인된다. BRET 신호의 부재는 상호 작용이 발생하지 않는 것을 확인 필요하지 않다. 예기치 또는 부정적인 결과의 경우, 전체의 발광 및 형광을 발한다후부의 수는 모든 우물이 올바르게 형질 전환되었는지 확인하기 위해 조사해야합니다.

BRET 신호는 또한 단백질 발현 수준의 비율에 의해 영향 거기서부터 두 단백질 (또는 발광 카운트 YFP 융합체로 형질 웰에서 형광 카운트를 비교하여 그 두 단백질의 상대적인 발현 수준을 조사하기 위해 유용 웰) 루시퍼 융합체로 형질. 한 융합 단백질이 더 강하게 이외 표현하면, 더 나은 결과가 낮은 발현 수준을 가진 단백질이 여기에 제시된 실험 FOXP2와 CtBP1의 경우와 루시 페라 제,에 융합되는 경우 얻어 질 가능성이있다. 이는 형질 믹스 발현 플라스미드의 몰비를 조절하여 단백질 수준을 조작하는 것도 가능하다. 융합 단백질의 특정 쌍 사이의 에너지 전달로 인해 단백질 복합체의 구조에 매우 비효율적 일 수있다. 등의케이스는 루시퍼 라제 / YFP의 다른 말단에 관심의 단백질을 융합하는 시도 가치가있을 수 있습니다.

그것은 BRET 신호가 생리적 인 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타내며 단순히 인해 단백질의 과발현에없는 것을 확인하는 것이 필요하다. 이러한 이유로 단백질의 총 과발현을 피하는 것이 중요하다. BRET 시스템에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 특이성을 더 FOXP2의 DE400 변이체를 사용하여 여기에 설명되는 것과 같이, 상호 작용의 친화력을 감소하는 것으로 알려진 단백질에 돌연변이를 도입함으로써 확인 될 수있다. 돌연변이 단백질은 또한 경쟁 및 BRET 세이를 포화 결합에 사용될 수있다. 경쟁자로서 상호 작용 파트너 중 하나의 태그가없는 버전의 농도를 증가시키면서 경쟁 분석에서, 공여체 및 수용체 융합 단백질의 농도는 일정하게 유지된다. 태그되지 않은 야생형 단백질 V 태그들과 경쟁해야돌연변이 단백질이 상호 작용을 경쟁 할 수 감소 능력을 발휘해야하는 반면, 브렛 신호의 감소의 결과로, 상호 작용 파트너에 바인딩 ersion. 수용체의 농도를 증가시키면서 포화 결합 분석에서, 도너 융합 단백질의 농도는 일정하게 유지된다. 특정 상호 작용에 대한 BRET 신호는 결국 수용체로 포화 될 모든 기증자 분자로 고원한다. 비 - 특이 적 상호 작용을 위해, BRET 신호는 전형적으로 공여체 및 수용체 분자들 사이의 임의의 충돌의 증가로 작은 선형 증가를 보여준다. 도너 비율 또한 신호 검출을위한 도너 단백질의 충분한 수준을 유지하면서 포화를 관찰 : 실제로, 수용성 단백질 사이의 상호 작용에 적당한 친화도, 그것은 충분히 높은 셉터를 달성하기 어려울 수있다.

주의 differenc의 해석에서 수행되어야한다브레 비 사이의 에스. 에너지 전달의 효율은 단백질 - 단백질 상호 작용의 강도 이외의 요인에 의해 좌우되기 때문에 BRET 분석법은 단백질 - 단백질 상호 작용의 친화력의 정량적 측정 값을 제공하지 않는다. 이러한 인자는 셀 내의 융합 단백질의 농도의 비율, 상호 작용의 구조, 및 결합 및 복합체의 해리 속도를 포함한다. 단백질의 서로 다른 두 쌍 수득 비율 따라서 반드시 비교 될 수 없지만, 비교 예 야생형 및 게재 FOXP2의 ΔE400 변이체와 ​​같은 단백질의 다른 변형 사이 가능할 수있다. 때때로 약간 부정적인 BRET 비율을 관찰 할 수있다. 음의 비율은 pLuc 제어 벡터로 형질 세포의 기준 비율의 측정에 오류를 발생할 수 있습니다. 매우 높은 비율은 형질 CE의 관찰에 의해 확인 될 수있다 단백질 응집, 종종 지표로형광 현미경 LLS. 집계는 생물학적으로 중요한 또는 단백질 과발현의 인공물인지가 결정되어야한다.

결론적으로 여기 기재된 BRET 분석법은 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. BRET의 애플리케이션은, 단백체 선별 연구로부터 후보 인터랙 유효성 단백질 - 단백질 상호 작용에 관련된 특정 잔기를 식별하고 환자의 DNA에서 발견 된 돌연변이의 효과를 평가할 목적으로 증명되었다. 상호 작용이 세포 용해를위한 필요없이 실시간으로 검출되므로, BRET 신호는 약학 화합물 또는 리간드 (7)의 추가로 치료 전후에 측정 될 수있다. 브렛 분석은 차세대 시퀀싱를 통해 발견 된 유전자 변종의 생물학적 관련성을 평가하는 기능 유전체학 연구에 사용하기 위해 큰 약속을 보여줍니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 8000 Nanodrop Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white Greiner Bio One 655098 White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software TECAN Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. 
pLuc, pYFP, positive control plasmid N/A N/A Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+) Promega P2271 Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells ECACC 85120602 Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red Gibco 41966 This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) Gibco 21063 This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM Gibco 31985 OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum Gibco 10270 For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent Novagen 70967 If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO Sigma D2650 Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. 
EnduRen live-cell substrate Promega E6481 Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
  3. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  4. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  5. Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
  6. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
  7. Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
  8. Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
  9. Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
  10. Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
  11. Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
  12. Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
  13. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  14. Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
  15. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
  16. Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
  17. O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
  18. Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
  19. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
  20. Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
  21. Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
  22. MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
  23. Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).More

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter