Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

doi: 10.3791/51438 Published: May 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Abstract

Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) dayalı tahliller, canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri izlemek için bir hassas ve güvenilir bir araç sağlar. BRET bir "alıcı" flüoresan protein için bir 'verici' lusiferaz enzim enerji radyatif olmayan transferidir. Bu deneyde en yaygın yapılandırmada, verici Renilla reniformis'e lusiferaz ve alıcı sarı floresan proteini (YFP) 'dir. Enerji transferi verimi güçlü mesafe bağımlı olduğu için, BRET olgusunun gözlem verici ve alıcı yakın olması gerekir. Kültürlenen memeli hücrelerde ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim için test etmek amacıyla, protein, bir lusiferaz ve YFP ile bir füzyon olarak, ikincisi ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim verici ve enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın akseptörü getirebilir. Protein-protein araştırmak için başka teknikler ile karşılaştırıldığındateractions, Bret tahlil duyarlı, küçük ellerini-zaman ve kaç reaktifler gerektirir, ve, zayıf geçici, ya da canlı bir hücrenin içinde bulunan biyokimyasal çevresine bağlıdır etkileşimleri tespit edebiliyor. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrofotometresi proteomik çalışmalar önerdiği varsayımsal etkileşimleri doğrulanması için ideal bir yaklaşımdır, ve ek olarak protein-protein etkileşimleri, çevirim sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek, eşleme etkileşim bölgeleri için çok uygundur, ve Hasta DNA tanımlanan mutasyonların etkisini değerlendirmek.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dizileme insan bozuklukları arasında bağlantı analizleri klasik ve yeni nesil Hem biyolojik yolların bir aralıkta yer alan proteinlerin klinik anlam açıklayıcıdır. Bu önce bu tür çalışmalarda kendi tanımlama, bu proteinlerin biyolojik rolünün çok az veya hiç soruşturma edildiğine, genellikle böyledir. Ilgi konusu bir proteinin biyolojik fonksiyonunu keşfetmek başlatmak için verimli bir yol onun fizyolojik bağlamında ile etkileşen diğer hangi proteinlerin tespit etmektir. Bu şekilde moleküler ağlar karakterize insan fenotip altında yatan biyolojik yollar içgörüler sağlar.

En sık kullanılan büyük ölçekli tarama ilgi konusu olan proteinlerin aday etkileşim ortakları belirlenmesi için yaklaşımlar maya iki-hibrid eleme 1 ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik 2 'dir. Bu yöntemler potansiyel etkileşim proteinler düşündüren çok başarılı olabilir, ancak ar olabilirYanlış pozitif sonuçlar savunmasız e. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrometrisi tarama ile belirlenen bir etkileşim onay ikinci bir teknik kullanılarak etkileşim doğrulaması gerektirmektedir. Tipik olarak, bir ko-immünopresipitasyon veya çekme-down deney bu amaçla 3 için kullanılır. Doğrulama için bu gibi teknikler kullanılarak bir dezavantajı, belirli bir protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi için gerekli olabilir, hücre içi koşullar yok hücre lisisi, için bir gerekliliktir. İkinci bir dezavantaj, zayıf ya da geçici protein etkileşimleri yıkama adımları sırasında bozulabilir olmasıdır. Ayrıca, bu deneyler, önemli eller zaman talep aynı anda işlenebilir numune sayısı sınırlıdır ve genellikle reaktiflerin ve protokoller zaman alıcı optimizasyon gerektirir.

Ko-immünopresipitasyon deneyleri ile ilişkili problemlerin bazılarının üstesinden gelebilmek için, çeşitli tahliller, floresan ve biolum göre geliştirilmiştircanlı hücreler olarak kullanılabilir inescent proteinleri. Bu alandaki ilk deneyler Floresans (veya Förster) rezonans enerji transferi (FRET), üst üste binen emisyon ve uyarım spektrumları 4, iki floresan protein arasındaki enerji radyatif olmayan transferi dayandırılmıştır. Enerji transferi etkinliği bu nedenle, FRET olgusunun gözlem verici ve alıcı floroforlar yakın olması gerekir, güçlü bir mesafe bağımlıdır. Ve akseptör-floroforu (yaygın sarı floresan proteini; YFP) ile bir füzyon olarak ikinci, ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim test etmek için, bir protein, donor-florofor (CFP genel olarak mavi floresan protein) ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim CFP donör YFP akseptör göreceli ışık emisyon ölçülebilir bir artışa neden olur ki, enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın bir verici ve alıcı florofor getirebilir. FRET canlı hücreler 4 protein-protein etkileşimlerini tespit başarılı olmuştur. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için FRET kullanılmasının başlıca dezavantajı, donor-florofor uyarma dış aydınlatma için bir gerekliliktir. Emisyon sinyali, alıcı istenmeyen uyarma ve verici ve alıcı florofor hem ışıkla ağartma yüksek arka dış aydınlatma sonuçlanır. Bu etkiler, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için, tahlilin hassasiyetini azaltır.

Dış aydınlatma yüksek bir arka plan sorununu ortadan FRET deneyinin bir modifikasyonu Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) tahlili 5,6 olan. BRET sisteminde donor-floroforu bir lusiferaz enzimi ile değiştirilir. Bu durumda, alıcı fluorofor uyarılması için enerji gereksiz dış aydınlatma ile, bir lusiferaz alt-tabakanın oksidasyonu ile, sistem içinde oluşturulur. ÇoğundaBu tahlilin ortak bir yapılandırma, verici Renilla lusiferaz reniformis ve akseptör (alternatif donör ve akseptör proteinlere ilişkin bir tartışma için Pfleger et al. bakınız: 5) YFP olmasıdır. Bu duruma göre, bu sistemde, ilgi konusu bir protein lusiferaz ve potansiyel olarak etkileşen protein YFP için, veya tam tersi kaynaşır. BRET deney lusiferaz için bir substrat olarak koelenterazin eklenmesini gerektirir. Coelenterazine hücre-geçirgen olduğu için, canlı hücrelerde BRET deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bununla birlikte, doğal coelenterazine sulu çözelti içinde kararsız olduğu ve koelenterazin enzim bağımsız arıza tahlil için alt-tabaka mevcut konsantrasyonunu azaltır ve lusiferaz aktivitesi ölçümlerinin hassasiyetini azaltır autoluminescence oluşturur, her ikisi de. Canlı hücrelerdeki BRET kullanılması, sulu çözelti içinde stabil olan, ancak sitosolik esteraz ile bölünen korunan coelenterazines, geliştirilmesi ile kolaylaştırılmıştırhücre 7 içindeki aktif coelenterazine oluşturmak için hücre zarından difüzyon sonra s.

Lusiferazı ve YFP-füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelere substrat ilave edildikten sonra, protein-protein etkileşimleri kaynaklanan enerji transferi lusiferaz ve YFP gelen emisyon izleyerek ölçülür. Protein etkileşimleri, çok oyuklu plakalar içerisinde canlı hücreler doğrudan izlenebilir için, BRET deney maliyet ve zaman tasarruflu, varsayılan etkileşimlerini doğrulamak için basit bir ölçeklenebilir bir yöntem içerir.

Proteomik tarama çalışmalarda tanımlanan varsayılan inter aktörlerin onaylamaya ek olarak, BRET sistem aynı zamanda, ilgi konusu bir protein üzerinde önceden biyokimyasal ve yapısal çalışmalarından gelen test aday uygulayıcı için kullanılabilir. , Bir protein-protein etkileşiminin varlığı (BRET yöntemi kullanılarak ya da diğer teknikler yoluyla) bir kez kurulduktan sonra BRET deney emp olması için potansiyel vardırloyed ayrıca etkileşimlerini karakterize etmek için. Örneğin, etkileşim bölgeleri proteinlerinin kesilmiş versiyonları üreterek eşlenebilir ve bu etkileşimde belirli tortuların katılımı nokta mutasyonlar oluşturarak kanıtlanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri ile ilgili çevrim sonrası modifikasyon veya (ilaç veya ligandlar gibi) küçük moleküller modüle edici etkisinin 8-10 araştırılabilir.

Tahlil, aynı zamanda, hasta BRET DNA tanımlanan mutasyonlar araştırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Durumda, bir mutasyon için nedensel rol BRET fenotip 11 moleküler etiyolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarabilir kullanılarak protein-protein etkileşimlerine mutasyonun etkisi araştırılarak kurulmuştur burada. Çeşitli potansiyel olarak zarar veren mutasyonların rele olduğu açık değildir, bu durumda, bir birey içinde tespit edilmesi için yeni nesil dizileme yöntemleri gelişiyle bu yana, giderek daha yaygın olduğufenotip 12 adjuvant. Bu durumda BRET deney protein işlevi üzerindeki mutasyonlar etkisini değerlendirmek için de değerlidir ve bozukluğa dolayısıyla alaka olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Plazmitlerin 1. Yaratılış

  1. (Şekil 1), standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, iki pLuc ve pYFP vektörlere ilgi her protein için cDNA'lar alt-klonlanmıştır. Detaylı protokollerin Yeşil ve arkadaşları 13 bkz.
  2. Sıra tüm ilgi duyulan proteinlerin herhangi bir araya giren durdurma kodonları ile Luc / YFP sekansı ile çerçeve içinde olduğunu doğrulamak için oluşturur.
  3. Füzyon proteinleri biyolojik etkinliğini korumak olduğunu teyit etmek için arzu edildiği gibi fonksiyonel deneylerde yapın. Burada yer alan durumunda YFP füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyonu floresan mikroskobu ile tespit edildi.
  4. PLuc ve pYFP ekspresyon vektörleri içine uygun hedefleme sinyalleri mühendislik tarafından uygun Luc ve YFP kontrol proteinleri için sentezleme plasmidleri olun. Burada yer alan durumunda, pLuc ve pYFP vektörlere bir nükleer lokalizasyon sinyali sokulmasıyla nükleer hedefli Luc ve YFP yapıları oluşturur.
  5. YapmakLuc ve YFP tek polipeptid halinde birleşmiş olduğu bir pozitif kontrol yapısı. Burada yer alan durumunda, YFP kodlama dizisi pLuc vektör içine sokulduğu bir pozitif kontrol üretir.
  6. Transfeksiyon karışımları DNA kütlesini eşitlemek için kullanılacak nötr dolgu plazmid seçin. Herhangi bir ökariyotik promoter içeren bir plazmid kullanarak ve bu nedenle, bir bakteri klonlama vektörü gibi memeli hücrelerinde transkripsiyonel olarak etkin olacaktır.

DNA karışımlar 2. Hazırlanması

  1. 260 nm'de absorbans göre Bölüm 1 'de tarif edilen tüm plasmidlerin konsantrasyonunu tahmin (1 absorbans birimi 50 ug / ml DNA eşdeğerdir). 650 Da ile baz çiftlerinin sayısı çarpılarak her plazmid moleküler kütlesi belirler. Her bir plazmid hazırlama molar konsantrasyonunu hesaplamak için, konsantrasyon ve moleküler kütlesi kullanın. 36 nM'lik bir konsantrasyonda plasmid DNA preparatları seyreltin. Bunlar çalışma stokları olacakBu transfeksiyon için DNA karışımları hazırlamak için kullanılacaktır.
  2. Su 20 ul'lik bir son hacim içinde dolgu plazmid 1800 ng DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın.
  3. PLuc kontrol konstruktunun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
  4. PLuc kontrol konstruktunun 5 ul pYFP ve kontrol yapısının 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
  5. Pozitif kontrol konstruktun 5 ul DNA içeren bir kontrol karışımı hazırlayın. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
  6. Aşağıdaki DNA, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul ve py 5 ul birleşerek DNA karışımı için ilgi, X bir proteinin homodimerizasyon test etmek için karışımları hazırlamakFP inşa. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
    A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X
    B) pLuc-X ve pYFP kontrol
    C) pLuc-X-X ve pYFP
  7. Aşağıdaki DNA ilgi konusu olan proteinlerin bir çifti arasında bir etkileşim için test etmek için karışımları hazırlamak, X ve Y, her bir DNA karışımı için, ilgili pLuc oluşturmak 5 ul birleştirmek ve pYFP 5 ul oluştururlar. 1,800 ng toplam DNA kütlesi getirmek için dolgu plazmid ekleyin. 20 ul nihai hacim getirmek için su ilave edilir.
    A) pLuc-kontrolü ve pYFP-X
    B) pLuc-X ve pYFP kontrol
    C) pLuc-kontrolü ve pYFP-Y
    D) pLuc-Y ve-kontrol pYFP
    E) pLuc-X-Y ve pYFP
    F) pLuc-Y ve-X pYFP

3. Transfeksiyon

  1. Hasat 75 cm 2 şişeden HEK293 hücreleri alt konfluent. Kültür ortamında 13 ml toplam hücrelerin% 10 seyreltin. Beyaz her oyuğuna hücre süspansiyonu 130 ul koyunnet 96 oyuklu doku kültürü plakası dipli. 24 saat boyunca kültür hücreleri.
  2. 3 ile DNA karışımları sayısını çarpılarak transfekte edilecek kuyu sayısını hesaplayın., Oda sıcaklığına kadar, serum içermeyen kültür ortamı getirin. Serum-barındırmayan ortam içinde 6.3 ul ve oyuk başına 0.18 ul transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ana karışımı hazırlayın. Vorteks ile karıştırılır ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Serum-barındırmayan ortam / transfeksiyon reaktifi ana karışımı 20 ul DNA karışımı 2 ul ekleyerek transfeksiyon karışımları hazırlayın. Vorteks. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Oyuk başına transfeksiyon karışımı 6.5 ul tevzi her transfeksiyon karışımı ile üç kuyu transfekte. Bir başka 36-48 saat için kültür hücreleri.

Bret Sinyal 4. Ölçümü

  1. Vorteks ile DMSO içinde 34 mg / ml 'de, canlı hücre lusiferaz alt-tabaka içinde çözündürülür.
  2. Alt-tabaka seyreltme ortamı p 1:1,000 ile yeniden canlı hücre lusiferaz alt-tabaka seyreltik37 ° C'ye yeniden ısıtıldı 50 alt-tabaka seyreltme ortamı ul başına de izin verir. Karıştırmak için Vortex. Bir çökelti meydana getirebilir, ancak testi ile engel olmaz.
  3. 96 oyuklu plaka kültür ortamı aspire. Her bir seyreltilmiş canlı hücre lusiferaz alt-tabaka 50 ul koyun. En az 2 saat (en fazla 24 saat) için Kültür hücreleri.
  4. 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve luminometre içinde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Ayrıca bir anda Luc ve YFP itibaren emisyonunu ölçün. Uzun ve 470 nm dalga boylarında daha engelleyen bir filtre kullanılarak Luc adlı emisyonunu ölçün. 500-600 nm bant geçişli filtre kullanılarak YFP salmaları ölçün. 10 sn emisyon sinyalleri entegre.

5. Veri Analizi

  1. Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan Luc emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır Luc emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm Luc emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.
  2. Sadece dolgu plazmid alınan 3 kuyulardan YFP emisyon ölçümleri ortalama. Arka plan çıkarılır YFP emisyon değerlerini üretmek için diğer tüm YFP emisyon okumalar bu Değ.Çıkar.
  3. Her bir kuyu için, düzeltilmemiş Bret oranını vermek arka plan çıkarılır Luc emisyon değeriyle arka plan çıkarılır YFP emisyon değeri bölmek.
  4. Yalnızca pLuc kontrol plasmidi ile transfekte edildi, üç kuyu düzeltilmemiş BRET oranlarını ortalama. Düzeltilmiş Bret oranlarını vermek için tüm diğer düzeltilmemiş Bret oranlarından bu Değ.Çıkar.
  5. Düzeltilmiş BRET oranlar kalan kümelerinin her biri için, bir son BRET oranını elde etmek için, üç transfekte kuyulardan değerlerinin ortalamasını alın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BRET Analizin ilkesi Şekil 2'de görüntülenmiştir. Burada yer alan deneyler boyunca kullanılan deney kurulumu, Şekil 3'te gösterilmiştir. Bir lusiferaz-YFP füzyon proteini ile transfekte edilmiş hücrelerin güçlü bir BRET sinyalin tespiti enerji transferi gözlemlenebilir olduğunu doğruladı Bu deney düzeneğinde (Şekil 4).

Bizim araştırma beyin gelişiminde transkripsiyonel baskılayıcıların FoxP ailenin rolü üzerinde duruluyor. En belirgin özelliği konuşma 14-16 için gerekli orofocial kas hareketlerinin karmaşık dizileri üreten gelişimsel sözel dispraksi-zorluk olduğu konuşma ve dil bozukluğu nadir görülen bir formu, için FoxP2 kurşun etkileyen heterozigot mutasyonları. FoxP1 mutasyonların hasta bildirilmiştir Ciddi konuşma ve dil sorunları 17-20 eşlik otizm spektrum bozukluğu ve zihinsel engeli olan. Diğer proteinler ile FOXPs etkileşimi beyin gelişiminde bu proteinlerin rolü ile ilgili moleküler mekanizmaları içgörü kazanmak için araştırılmaktadır.

FoxP2 nedenle FoxP2 homodimerizasyon BRET analizi (Şekil 4) doğrulamak için kullanıldı FoxP diğer aile üyeleri 21, ile homo-veya heterodimerlerinin oluşturulması için bilinmektedir. Bu tahlilde FoxP2 füzyon proteinlerinin protein etkileşimleri sadece aşırı ekspresyonuna bağlı olması ihtimalini daha da ortadan kaldırmak için, etkileşiminin özgünlüğü, (kalıntı E400 çerçeve içi silme) FoxP2 arasında lösin fermuar dimerizasyon alanı içine bir mutasyonu ile gösterilmiştir ki homo-ve heterodimerizasyon 21 (Şekil 5A) bozmak bilinmektedir. Luc-FOXP2.DE400 ve YFP FoxP2 füzyon proteinlerinin birlikte ifade edildiğinde, BRET sinyalindeki bir azalma Luc-FoxP2 ve YFP FoxP2 (Şekil 5B) birlikte ifade edildi durumuna kıyasla gözlenmiştir. Bu siwestern blot (veriler gösterilmemiştir) ile değerlendirildi gnal indirgeme mutant protein (Şekil 5C) en alt hücresel lokalizasyonu veya ekspresyon düzeylerinde bir fark bir değişiklik nedeniyle değildi. Luc-FoxP2 YFP FOXP2.DE400 (veriler gösterilmemiştir) ile ifade edilmiştir, sinyal azalma da gözlenmiştir. Bu nedenle protein BRET homodimerizasyonunu tespit etkili olduğunu ve bu proteinler ve lusiferaz-YFP füzyonlar olarak aşın zaman proteinlerin spesifik etkileşimi kalır. Ayrıca, proteinlerin hedef mutasyonu ile birlikte BRET kullanımının, protein-protein etkileşimleri ile ilgili bireysel tortularını tanımlamak için bir potansiyele sahiptir.

Heterotipik etkileşimlerini tespit BRET tayinin etkinliğini değerlendirmek için, FoxP1 ile FoxP2 arasındaki etkileşimin (Şekil 6) test edilmiştir. A BRET sinyali, yani verici olarak FoxP2 veya alıcı fusio olarak (Tahlil her iki muhtemel konfigürasyonunun gözlenmiştirn protein). Bu nedenle Bret tahlil homo-ve heterotipik etkileşimleri hem de tespit edebiliyor. Ek olarak, non-FoxP proteinlerle FoxP2 etkileşimini tespit etmek için BRET tahlilinin uygunluğu CtBP1, bir transkripsiyon ortak bastıncısı ve bilinen FoxP2 etkileşim ortak 21 ile etkileşim incelenerek test edilmiştir. CtBP1 ve FoxP2 arasındaki etkileşim, aslında, bir maya iki melez ekran tarafından önerildi ve daha sonra ko-immünopresipitasyon deneyler 21 ile doğrulandı. FoxP2 verici füzyon proteini ve CtBP1 değil, ters konfigürasyonda (Şekil 7A) olarak, alıcı iken FoxP2-CtBP1 etkileşim BRET deneyi ile tespit edilmiştir. Bu çıktılar Bret sistemi (Tartışma bölümüne bakınız) ile beklenemez. FoxP2 ve CtBP1 arasındaki etkileşim CtBP1 sadece küçük bir kısmı, bu tahlilin hassasiyetini vurgulayarak, çekirdeğe (Şekil 7B) lokalize edilmiş olsa bile gözlenmiştir. Böylece BRETDeney maya iki hibrid taraması ile belirlenmiştir farazi etkileşimlerin kabul edilmesi için yararlıdır.

Son olarak, Bret tahlil protein-protein etkileşimleri FoxP2 patojenik mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılmıştır. FoxP2 İki nokta mutasyonları konuşma ve dil (Şekil 8A) etkileyen nadir bir otozomal dominant hastalığa neden bildirilmiştir. R553H misens mutasyonu yarısı üyeleri bozukluğu 14 etkilenen edildiği bir büyük ailenin bir bağlantı çalışma ile tespit edilmiştir. R328X saçma mutasyon gelişimsel sözel dyspraxia 22 tanısı ile probandların olarak FoxP2 odağı hedeflenen sıralanması ile keşfedilmiştir. Vahşi tip FoxP2 ile dimerize mutant proteinlerin yeteneği BRET tahlili kullanılarak değerlendirildi. Alıcısı olarak bir verici ve mutant FoxP2 gibi, vahşi tip FoxP2 kullanan sonuçlar Şekil 8B'de gösterilmektedir. Aynı sonuçlar, m kullanılarak gözlenmiştiralıcı (veriler gösterilmemiştir) gibi bir verici ve vahşi tip gibi utant FoxP2. FoxP2 DNA-bağlayıcı etki alanı içinde olan R553H mutasyon, vahşi tip ile dimerize mutant proteinin yeteneğini etkilemedi. Bu mutasyonun patojenik mekanizma bu nedenden dolayı, normal protein 23 ile mutantının dimerizasyonu elde edilen bir baskın negatif bir etki içerebilir. R328X mutasyon kodlanmış protein lösin fermuar dimerizasyon alanı ve bir DNA bağlanma alanından yoksundur ve bir sitoplazmik mislocalization (Şekil 8C) gösteren ve bunun sonucunda, bir erken durdurma kodonu getirmektedir. Sitoplazmaya dimerizasyon alanı ve mislocalization yokluğunda uygun olarak, kesilmiş protein büyük ölçüde vahşi tip FoxP2 ile etkileşim azalır gösterir. Bu mutasyon bu yüzden nedeniyle haploinsufficiency patogenik olması muhtemeldir. Böylece Bret tahlil hastalarda keşfedilen mutasyonların biyolojik etkileri hakkında fikir verebilir.


Şekil 1. YFP ve lusiferaz füzyon proteinlerinin sentezlenmesi için vektörler. A) pYFP ve pLuc vektörlerin Çember haritalar. PLuc vektör BRET vericileri olarak lusiferaz füzyon proteinlerinin sentezlenmesi için kullanılmaktadır. BRET akseptörleri olarak pYFP vektör YFP füzyon proteinlerinin sentezlenmesi için kullanılmaktadır. Vektörler, memeli hücrelerinde yüksek düzeyde ekspresyon için bir CMV promoteri (P CMV), ilgi konusu proteinleri için cDNA'ların eklenmesi için bir çoklu klonlama sitesi (MCS) ve bir kanamisin direnç geni (Kan r) ve yayılması için bakteriyel replikasyon kökeni var bakterilerde plasmid. B) pLuc ve pYFP vektörlerin birden fazla klonlama bölgesi. YFP kodlama dizisinin sonunda mavi renkte gösterilir. Seçilen kısıtlama siteleri açıklamalı. Xba I bölgesi ove tarafından engellenmiş olduğunu notE. standart suşları baraj metillenmesini rlapping coli. ilgi konusu olan proteinlerin kodlayan cDNA'lar çerçeve içinde gösterilen amino asit sekansı ile klonlanır olmalıdır. Burada anlatılan deneylerde, insert (altı çizili) Bam HI ve Xba I kısıtlama sahaları içerisine klonlandı. Dur kodonu lusiferaz sonunda kaldırılmış ve YFP lusiferaz / YFP ve ilgi çekici alt klonlanmış cDNA'yı kapsayan bir açık okuma çerçevesi temin etmek üzere kodlama dizilerinin. Dur kodonu, bu nedenle bu, sokulan cDNA'nın bir durdurma kodonu eklemek için gerekli değildir, (kırmızı ile gösterilen) her üç okuma çerçevelerinde çoklu klonlama bölgesinin sonunda bulunmaktadır.

Şekil 2,
BRET sistemi Şekil 2.. Prensibi. Ilgi çekici proteinler, X ve Y, bir verici lusiferaz enzim (Luc, tepe emisyon 475 n kaynaştırılırm) ve bir alıcı floresan proteini (YFP, tepe emisyon 530 nm), sırasıyla. Füzyon proteinleri kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir ve Luc bir hücre-geçirgen lusiferaz alt-tabaka, emisyon aşağıdaki ek bir 500-600 nm bant-geçiş filtresi kullanılarak ölçülmüştür daha YFP 470 nm ve emisyon dalga boyu daha engelleyen bir filtre kullanılarak ölçülür. protein X ve protein arasındaki A) protein X ve YFP için Luc protein Y. enerji transferi arasında herhangi bir etkileşim meydana gelmez. B) etkileşim Y. rezonans enerji transferi kullanılarak ölçülen emisyon oranında bir artışa neden YFP için Luc meydana gelir 500-600 nm bant-geçiş filtresi 470 nm'den daha uzun dalga boylarında bloke filtreye göre.

Şekil 3,
Şekil 3.. Testi kurulum. Sınamak için deney kurulumBir etkileşim ilgi iki protein arasında, X ve ilgi Y. proteinler BRET alıcısı olarak BRET verici ve sarı floresan proteini (YFP) halinde lusiferaz (Luc) kaynaşır. . A) her bir plaka içerisinde dahil edilmesi için kontrol eder uygun olduğu takdirde, kontrol proteinlerinde, Luc ve YFP, ilgili alt-hücre bölmesine (P) için bir hedefleme sinyalini içeren bir peptit için eritilerek birleştirilir. Parlaklık ve luminometre gürültü ve substratın enzim bağımsız yıkıma uğramasından kaynaklanan floresan arka plan seviyelerinin tutturulması için 1) Mock-transfeksiyon kontrolü; 2) bir alıcı BRET yokluğunda YFP emisyon mertebesinde tespit edilir lusiferaz emisyon oranını tespit etmek pLuc-transfeksiyon kontrolü sadece; 3) pLuc-kontrol ve Luc-YFP etkileşiminden ortaya çıkan temel BRET bir sinyalin oluşturulması için pYFP kontrol transfeksiyonu; 4) Pozitif kontrol olarak Luc-YFP füzyon transfeksivonu bir BRET sinyali ölçülebilir sağlamak. B) experim Setilgi iki protein arasında bir etkileşim için test etmek için ental koşulları, X ve Y 1, 2, 4, 5) ilgi ve Luc / YFP proteinleri arasındaki non-spesifik etkileşim için kontrol eder; Alıcısı olarak verici ve Y gibi X 3) Test durumu; Alıcısı olarak verici ve X olarak Y ile 6) Test durumu.

Şekil 4,
FoxP2 homodimerizasyonu Şekil 4.. Algılama. A) FoxP2 homodimerlerinin tespiti için BRET analizi doğrulamak için, HEK293 hücreleri, lusiferaz (verici) veya FoxP2 (P2) ya da bir nükleer lokalizasyon sinyali ya da kaynaşmış YFP (akseptör) ekspresyonu için yapılar ile transfekte edilmiştir (-). Nükleer hedefli lusiferaz ve YFP proteinler negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Bir BRET sinyalin tespiti için bir pozitif kontrol olarak hücreler, aynı zamanda, bir lusiferaz YF-ekspresyonu için bir yapı ile transfekte edilmiştir) Veya YFP FoxP2 (P2) kaynaşmış olan -. Nükleer lokalizasyon sinyali (kaynaşmış YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin P füzyon proteini (+) B) floresan mikroskobu görüntüler.

Şekil 5,
Şekil 5,. Deney özgüllük göstermek için dimerizasyon eksikliği FoxP2 içinde kullanın. Dimerizasyonunu bozar DE400 mutasyon konumunu gösteren FoxP2 protein A) şematik diyagramı. Lösin zipper dimerizasyon alanı, yeşil gösterilir ve proteinlerin aşırı ekspresyonu BRET tahlilinde yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir olup olmadığını test etmek için, san. B) 'de DNA-bağlama alanı, tahlilinin özgüllüğü FOXP2.DE400 kullanılarak değerlendirildi varyant. Hücreler, lusiferaz (verici) veya FoxP2 (P2) kaynaşmış YFP (alıcı), FOXP2.DE400 (DE) ya da bir nuclea ekspresyonu için yapılar ile transfekte edilmiştirr lokalizasyon sinyali (-). FoxP2 (P2) veya FOXP2.DE400 (DE) kaynaşmış YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin C) floresans mikroskobu görüntüler.

Şekil 6,
FoxP1-FoxP2 heterodimerizasyonun Şekil 6.. Algılama. A) homolog proteinler ve FoxP2 FoxP1 arasında hetero saptanması için tahlil BRET doğrulamak için, hücreler, lusiferaz (verici) veya FoxP2 (P2 ya da kaynaşmış YFP (akseptör)) ekspresyonu için yapılar ile transfekte edildi, FoxP1 (P1) veya nükleer lokalizasyon sinyali (-). FoxP1 (P1) veya FoxP2 (P2) kaynaşmış YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin B) floresan mikroskobu görüntüler.

Şekil 7
B) CtBP1 (CtBP) ya da FoxP2 (P2) kaynaşmış YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans mikroskobu görüntüler.

Şekil 8,
Şekil 8. Protein-protein etkileşimleri üzerinde patojenik FoxP2 mutasyonların etkilerinin değerlendirilmesi. Nadir fo neden R553H ve R328X mutasyonların konumlarını gösteren FoxP2 protein A) şematik diyagramıdil ve konuşma bozukluğu rm. Lösin zipper dimerizasyon alanı, yeşil ve protein-protein etkileşimleri ile ilgili patolojik mutasyonların etkisini değerlendirmek için BRET tahlilinin programı değerlendirmek san. B'de DNA-bağlama alanı) 'de gösterilmiş olan, üzerinde R553H ve R328X mutasyonların etkisi Normal FoxP2 ile dimerize FoxP2 mutant proteinlerin yeteneği incelenmiştir. (-). C Hücreler lusiferaz (donor) ya da ya da, normal FoxP2 (P2), FOXP2.R553H (553), FOXP2.R328X (328), ya da bir nükleer lokalizasyon sinyali ile kaynaşmış YFP (akseptör) ekspresyonu için yapılar ile transfekte edilmiştir ) YFP ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans mikroskobu görüntüleri FOXP2.R553H (R553H) ya da FOXP2.R328X (R328X) kaynaşmış. Bu görüntüde FOXP2.R328X ağırlıklı nükleer olmakla nüfus içindeki diğer hücrelerde daha sitoplazmik dağılımını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Füzyon protein ekspresyon yapılarının tasarımı Bret tahlil kurma önemli bir adımdır. Burada yer alan deneylerde, ilgi duyulan proteinlerin veya lusiferaz YFP C-terminine kaynaştırılmıştır. De mümkündür, ve lusiferaz / YFP N-terminine proteinleri sigorta, gerekli olabilir. Bazı proteinler için, füzyonları, sadece protein yapısı ve işlevinin bozulmasını önlemek için N-veya C-terminalinde ya da kabul edilebilir. Ayrıca, zar proteinleri olarak N ve C termini lusiferaz / YFP protein etkileşim ortak olarak aynı yerde olan ucuna bağlı olması gerekir, farklı hücre içi bölümlerinde bulunur. Örneğin, transmembran G-protein bağlı reseptörler ve sitoplazmik β-arrestin arasındaki etkileşimlerin çalışmalarda, lusiferaz transmembran reseptör 8'in hücre içi karboksil kuyruk ile kaynaştırılır. Diğer durumlarda, bir protein-protein etkileflimlere geometrisienerji transferi füzyon proteinlerinin iki olası kombinasyonları biri kullanılarak daha verimli olmak yol açabilir. Bazen enerji transferi yanlış negatif sonuçlara yol açan, tüm tek bir kombinasyonu kullanılarak algılanabilir olmayabilir.

Lusiferaz / YFP ve ilgilenilen protein arasındaki peptit bağlayıcı sekansı, aynı zamanda rezonans enerji transferi verimini etkileyebilir. Bağlayıcı lusiferaz / YFP ve ilgi protein engel olmadan kat izin verecek kadar uzun olmalıdır. Daha uzun bir bağlayıcı, lusiferaz / YFP ve verici ve alıcı dipollerin hizalamasını kolaylaştırarak BRET verimliliğini artırabilir ilgilenilen protein arasındaki kavşakta polipeptide daha fazla esneklik vermek olacaktır. Linker çok fazla esneklik varsa Ancak, Bret verimliliği azaltabilir. Burada deneylerde, sentezleme VEC BamH I ve Xba I bölgeleri içine, ilgi konusu proteinlerin klonlanmasıŞekil 1 'de gösterildiği gibi ları, bir 23-amino asit bağlayıcı ile sonuçlanmıştır. bu bağlayıcı proteinlerin çeşitli çiftleri arasındaki etkileşimi belirlemek için başarılı olmuştur.

Deneyleri Bret geçmeden önce, füzyon proteinleri normal biyolojik aktiviteyi muhafaza sağlanmalıdır. YFP işleyen bir floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan görselleme yoluyla değerlendirilebilir. Lusiferazın işleyişi ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak analiz edilebilir. Ilgi konusu olan proteinlerin hücre altı lokalizasyonu Füzyonun etkisi doğrudan görselleme yoluyla, immün ya da YFP-füzyonlarının durumunda ile değerlendirilebilir. Ilgilenilen proteinin fonksiyonu üzerindeki etkisi, füzyon proteinine özel tahlilleri ile araştırılabilir - örneğin, bir transkripsiyon faktörü için DNA-bağlama aktivitesini analiz etmek için uygun olabilir. Deney sırasında yapılan parlaklık ölçümleri uygun olarak-tahlil onaylamak sağlamak NotLusiferaz aktivitesi ation.

Bu uygun kontrol yapıları ilgi protein için ne dikkate almak önemlidir. YFP ve lusiferaz ağırlıklı sitoplazmik ve ilgi proteinleri sitoplazmik olduğunda, bu nedenle uygun kontroller bulunmaktadır. Ilgi konusu proteinlerin diğer alt-hücresel kompartımanlara lokalize Ancak, bu, ilgili bölme için kendi kaçakçılığı doğrudan peptid sinyalleri lusiferaz ve YFP değiştirmek için arzu edilebilir. Burada ilgilenilen proteinler, bu nedenle, lusiferaz, çekirdekte lokalize ve YFP bir nükleer lokalizasyon sinyalinin eklenmesiyle tadil edilmiştir transkripsiyon faktörleri edildi. Özel olarak, SV40 büyük T antijeni (CGYGPKKKRKVGGLDN) 'in nükleer lokalizasyon sinyali gibi bir peptit Bam HI ve Xba I th siteleri arasında sentetik çift sicimli oligonükleotidlerin bağlanması ile lusiferaz ve YFP C-terminal ucuna eklenmiştir edildie pLuc ve pYFP vektörler. Bu sinyalin eklenmesi çekirdeğine (Şekil 4B), proteinin önemli bir yeniden dağıtım neden oldu.

Uygun kontrolleri de dahil olmak üzere Bret deneylerin yorumlanması için çok önemlidir. Bir inert doldurucu madde plasmidi kullanılarak bir sahte-transfeksiyon kontrolü parlaklık ve luminometre gürültü ve substratın enzim bağımsız yıkıma uğramasından kaynaklanan floresan arka plan seviyesini belirlemek için gereklidir. Modern Luminometreler ve lusiferaz yüzeylerde ile arka plan aydınlığı düzeyleri genellikle çok düşüktür. Uygun kontrol lusiferaz bir YFP yapının yokluğunda yapısı ile transfekte bir BRET alıcı yokluğunda YFP emisyon mertebesinde tespit edilir lusiferaz emisyon oranını tespit etmek önemlidir. YFP yapıları kontrol lusiferaz ve kontrol ile transfeksiyonu Luc-YFP etkileşiminden ortaya çıkan temel BRET sinyali sağlar. Arifesindeetkileşim için test edilir proteinlerin ry çifti, bu test edilen proteinleri ve lusiferaz / YFP arasında bir spesifik olmayan bir etkileşime kontrol etmek için, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, uygun kontrol yapısı ile tek başına her biri transfekte etmek için önemlidir. İlk kez bir BRET deneyi gerçekleştirirken, özellikle bir BRET sinyali deney düzeneği gözlemlenebilir olmasını sağlamak için pozitif kontrol olarak bir Luc-YFP füzyon proteini dahil etmek önemlidir. Burada YFP kodlama sekansı YFP lusiferazın C-terminaline bağlı olduğu bir füzyon proteini oluşturmak için Bam HI ve Xba I bölgeleri de pLuc klonlanmıştır.

Burada anlatılan protokolde, DNA'nın bileşim transfeksiyon Luc / YFP füzyon protein ifade ortalama boyutu 7.5 kb 'den büyük değildir oluşturur varsayımıyla hesaplanmıştır karışımları. Eğer ifade inşaatts Bu önemli ölçüde daha büyük olan, daha sonra transfeksiyon karışımı eklenir, her sentezleme konstruktunun mollerinin sayısı karışımı DNA'nın toplam miktarı transfeksiyon tepkin maddesi miktarına göre izin verilen en aşmaması kadar azaltılabilir gerekebilir. Alternatif olarak, tüm transfeksiyon karışımları içinde, transfeksiyon tepkin maddesi ve DNA miktarı miktarı, üreticinin talimatları takip arttırılabilir. 96 oyuklu plakalar Deneysel düzenleme çok kanallı pipet ve aspiratörde kullanımıyla hızlandırılmış edilir. Bu nedenle, ilk karışımı, 10 dakika boyunca inkübe edilmiştir gibi transfeksiyon kısa sürede hücrelere karışımları ekleme başlar, serum içermeyen ortam / transfeksiyon ayıracı karışımı DNA'nın eklenmesinden sonra transfeksiyon karışımı inkübasyon süresi uzunluğu olarak örnekler arasında varyasyonu en aza indirmek için arzu edilir . BRET alıcı proteinler YFP füzyonları olduğu için, flüoresan mikroskobu ile ya da bir mikro-re floresan ölçümü ile transfeksiyon etkinliğini değerlendirmek mümkündürader. Bu transfeksiyon BRET sinyalin alt-tabaka ve bir ölçü ilave geçmeden önce tatmin edici olmasını sağlamak için tavsiye edilir böylece bir BRET deney başarı transfeksiyon iyi düzeyine bağlıdır. YFP etiketi de bir mikro levha okuyucusu kullanarak alıcı protein ifade seviyelerinin ölçümü sağlar. Alıcı protein seviyelerinin miktarının optimizasyonu ve BRET deneyler sorun gidermek için yararlı olabilir.

Hücreler, sabit bir sinyal elde edilmiştir sağlamak için BRET sinyal ölçülmesinden önce, lusiferaz alt-tabaka ile en az 2 saat boyunca inkübe edilmelidir. Bu, en fazla 24 saat için alt-tabaka ile hücrelerin kuluçkalanması da kabul edilebilir. Bu durumda, toplam ışıldama sayımı düşük olacaktır, ancak BRET oranlarının değişmeden olmalıdır. Alt-tabaka ile daha uzun inkubasyon (gece boyunca, örneğin) daha uygun olabilir ve aynı zamanda bir deney manipülasyon önce ve sonra BRET sinyallerinin ölçülmesine izin bu türbir farmasötik bileşik ilave olarak. Hücreler ölçüm zamanında yaklaşık konfluent ulaşması, böylece İdeal olarak, hücre ekim yoğunluğunu optimize eder. Hücre yoğunluğu optimum üzerinde ise, o zaman, hücre aşırı gelişimini önlemek için önceki bir zaman noktasında BRET sinyalinin ölçülmesi avantajlı olabilir. HEK293 başka bir hücre türü kullanıyorsanız, hücre kültürü ve transfeksiyon koşulları optimize etmek için emin olun. BRET deneyleri de başarıyla burada açıklanan protokol kullanılarak HeLa hücrelerinde gerçekleştirilmiştir.

Burada anlatılan deneylerde, ışıldama sayımı Renilla lusiferaz aktivitesi için optimum sıcaklık olan oda sıcaklığında ölçüldü. Luminometrede bir zaman akışı deneyi gerçekleştirmek ise 37 ° C 'de sıcaklığını ayarlamak için tercih edilir, Bu, oda sıcaklığında ve 37 ° C'de aynı deneyler icra edilmiştir ve sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Oda sıcaklığında, inci de deneyler varsae plaka Renilla lusiferaz aktivitesi stabilizasyonunu sağlamak için ölçümden önce luminometre içinde 10 dakika dengelenmeye bırakıldı olmalıdır. Burada, ışık yayılması sinyaller özellikle düşük sentezleme seviyelerine sahip proteinler için, genellikle yüksek hassasiyet sağlayan 10 saniye, üzerinde entegre edilmiştir. Bu yeterli hassasiyet sağlayan, ancak, sinyaller daha kısa zaman dönemleri içinde entegre edilebilir. Nedeniyle canlı hücre lusiferaz alt-tabaka tarafından üretilen parlaklık sinyalinin stabilitesine, her dalga boyunda oyuk başına en fazla 10 saniye için ölçmek için kabul edilebilir.

Test durum sinyal önemli ölçüde ilgili kontrol koşullarından sinyalleri aştığında ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim BRET deneyi ile teyit edilir. Bir BRET sinyalin bir etkileşim olmaması oluşmaz bu mutlaka onay değildir. Beklenmedik bir ya da negatif sonuç durumunda, toplam ışık yayılımı ve floresannce sayar bütün kuyuları doğru transfekte edildi emin olmak için muayene edilmelidir.

BRET sinyali aynı zamanda protein ekspresyon seviyelerinin oranı tarafından etkilenmektedir, bu nedenle ikinci iki proteinin (ya da lüminesans sayımların YFP füzyonları ile transfekte kuyulardan floresan sayımları karşılaştırarak ilgilenilen iki proteinin nispi ifade seviyelerini incelemek için yararlıdır kuyu), lusiferaz füzyonları ile transfekte edildi. Bir füzyon proteini, daha güçlü bir diğer daha eksprese olduğunda, daha iyi sonuçlar düşük ekspresyon düzeyi ile protein Burada yer alan deneylerde FoxP2 ve CtBP1 ile olduğu lusiferaz, kaynaştığı halinde elde edilmesi olasıdır. Bu transfeksiyon karışımı ekspresyon plazmidleri molar oranının ayarlanmasıyla protein seviyeleri işlemek de mümkündür. Füzyon proteinlerinin bazı çiftleri arasındaki enerji transferi nedeniyle protein kompleksinin geometrisine çok verimsiz olabilir. Böyle bir durumdaolgularının lusiferaz / YFP alternatif termini ilgi proteinleri eritme denemek faydalı olabilir.

Bu BRET sinyalinin bir fizyolojik protein-protein etkileşimi temsil eder ve sadece protein nedeniyle aşırı ekspresyonuna bağlı olarak olmadığını teyit etmek için gereklidir. Bu nedenle proteinlerin brüt aşırı ifadesinin önlemek için önemlidir. BRET sisteminde, bir protein-protein etkileşiminin özgüllüğü, bundan başka FoxP2 en DE400 varyantı ile burada gösterildiği gibi, etkileşim afinitesini azaltmak için bilinen proteinlere mutasyonlann sokulması yolu ile teyit edilebilir. Mütasyon oluşturan proteinler, ayrıca, rekabet ve BRET doyma bağlanma deneylerinde de kullanılabilir. Bir rakip olarak etkileşim ortaklarından biri bir etiketlenmemiş formunun konsantrasyonunu arttırırken bir yarışma deneyde, verici ve alıcı füzyon proteinlerinin konsantrasyonları sabit tutulur. Etiketlenmemiş vahşi tip protein ile rekabet etiketli v olmalıdırMutant protein etkileşimi rekabet azaltılmış bir yetenek sergiledikleri oysa, BRET sinyalinde bir azalmaya neden olacak şekilde etkileşim ortak bağlanma için ersion. Alıcı konsantrasyonunu arttırırken bir doyma bağlanma tahlilinde, verici füzyon proteininin konsantrasyonu, sabit tutulur. Belirli bir etkileşim için BRET sinyal sonunda kabul eden madde ile doymuş hale tüm verici moleküller olarak plato gerekir. Spesifik olmayan bir etkileşim sağlamak için, tipik olarak BRET sinyal verici ve alıcı moleküller arasındaki çarpışmalar rasgele bir artışa küçük doğrusal bir artış gösterecektir. Donör oranı da sinyal tespiti için donör protein yeterli seviyelerini muhafaza ederken, doygunluk gözlemlemek Uygulamada, çözünür proteinler arasındaki orta afinite etkileşimler için, o kadar yüksek akseptörü elde etmek zor olabilir.

Dikkat differenc yorumlanması olunmalıdırBret oranları arasında es. Enerji transferi verimi protein-protein etkileşiminin kuvvetinden daha başka faktörler tarafından etkilenir, çünkü BRET tahlil, bir protein-protein etkileşiminin afinitesi nicel ölçü sağlamaz. Bu faktörler hücre içindeki füzyon proteinlerinin seviyelerinin oranı, etkileşim geometrisini ve ana ve kompleksin ayrışma oranlarını içerir. Proteinlerin iki farklı çift elde oranları bu nedenle mutlaka karşılaştırılamaz, ancak karşılaştırma gibi yabani-tip ve burada gösterilen FoxP2 arasında ΔE400 türevleri ile olduğu gibi, aynı proteinin farklı çeşitleri arasında mümkün olabilir. Bazen, biraz negatif Bret oranları görülebilir. Negatif oranları, sadece pLuc-kontrol vektörü ile transfekte edilmiş hücrelerde bazal oranı ölçümünde hata kaynaklanabilir. Çok yüksek oranlar transfekte ce gözlemlenerek teyit edilebilir protein agregasyonu, genellikle göstergesidirflöresanlı bir mikroskop ile LLS. Toplama biyolojik ilgili veya protein aşırı bir eserdir ise tespit edilmelidir.

Sonuç olarak, burada tarif edilen deney BRET canlı hücrelerde protein-protein etkileşimi araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır. BRET uygulanması, proteomik tarama çalışmalarından aday inter aktörlerin doğrulama protein-protein etkileşimleri ile ilgili belirli kalıntıların belirlenmesi ve hasta DNA bulunan mutasyonların etkilerini değerlendirmek amacıyla gösterilmiştir. Etkileşimleri hücre liziz için gerek kalmadan gerçek zamanlı olarak tespit edilir, çünkü BRET sinyali bir bileşik veya farmasötik bir ligand 7 eklenmesi gibi bir işlemden önce ve sonra ölçülebilir. Bret tahlil nesil dizileme sonucunda keşfedilen genetik varyantları biyolojik ilgisini değerlendirmek için fonksiyonel genomik araştırma kullanılmak için büyük umut gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nanodrop 8000 Nanodrop Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96-microwell plates, flat bottom, white Greiner Bio One 655098 White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software TECAN Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. 
pLuc, pYFP, positive control plasmid N/A N/A Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+) Promega P2271 Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells ECACC 85120602 Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red Gibco 41966 This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) Gibco 21063 This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM Gibco 31985 OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum Gibco 10270 For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent Novagen 70967 If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO Sigma D2650 Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. 
EnduRen live-cell substrate Promega E6481 Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
  3. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  4. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  5. Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
  6. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
  7. Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
  8. Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
  9. Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
  10. Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
  11. Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
  12. Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
  13. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  14. Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
  15. Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
  16. Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
  17. O'Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
  18. Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
  19. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
  20. Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
  21. Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
  22. MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
  23. Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).More

Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (87), e51438, doi:10.3791/51438 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter