Abstract
脳内出血（ICH）は、脳血管疾患の一般的な形態であり、かなりの罹患率と死亡率と関連している。止血および血栓除去を目的とした大規模臨床試験の効果的な治療や故障の欠如は、ICHの更なるメカニズム駆動の調査の必要性を示しています。この研究は、前臨床モデルによって提供されるフレームワークを介して行われてもよい。一般的な使用での二つのマウスモデルは、自己全血またはクロストリジウムコラゲナーゼいずれかの線条体内（基底核）注射が挙げられる。各モデルは、ICHに関連した明らかに異なる病態生理学的特徴を表すので、特定のモデルの使用が検討されるべき疾患のどんな態様に基づいて選択することができる。例えば、自己血注入が最も正確に実質内血液の存在に対する脳の反応を示しており、最も密接に脳葉内出血を複製することができる。クロストリジウムコラゲナーゼ注射は、最も正確に秒を表すモールの血管破裂と深い出血の血腫の進化特性。このように、異なる血腫形成、神経炎症応答、脳浮腫の発達、および神経行動の結果、各モデルの結果。主張された治療的介入の堅牢性は、最高の両方のモデルを用いて評価することができる。このプロトコルでは、両方のモデル、損傷の即時の術後のデモ、および早期術後ケア技術を使用して、ICHの誘導が実証される。どちらのモデルも、再現性の損傷、血腫ボリューム、および神経行動赤字になる。しかし、人間のICHの不均一性、複数の前臨床モデルを徹底的に病態生理学的なメカニズムを探求し、潜在的な治療戦略をテストするために必要とされている。
Introduction
脳内出血（ICH）は30日1以内に死亡罹患患者の約40から50パーセントと脳血管疾患の比較的一般的な形式です。残念ながら、ほとんど改善は、過去20年間にわたり2死亡率で行われている。米国心臓協会4から国民健康3の研究所やガイドラインからのレポートは、病態生理の理解を拡張し、新たな治療アプローチのための目標を開発するために、ICHの臨床的に関連するモデルを開発することの重要性を強調した。
いくつかのモデルは、人間のICH 5を模倣するために存在する。 ICHの病態生理学の理解の成熟するように、様々なモデルは、疾患の異なる局面を調べるために使用され得ることが明らかとなった。以前に使用したモデルは、マウスアミロイド血管症6、実質内マイクロバルーンの挿入およびインフレーション7、および直接動脈血を含む浸潤8,9。アミロイド血管から脳葉内出血は、トランスジェニックマウスの使用でモデル化した別個のICHサブタイプを表してきた。マイクロバルーンモデルは、血腫形成から急性質量効果を模倣するが、血液の存在に対する脳の細胞応答をキャプチャすることができない。最後に、直接動脈血液浸潤は大腿動脈から動脈圧に脳を施す。このように、このモデルを模倣動脈圧及び血液の存在が、は小さな血管の破裂から微小血管損傷を脳に与えないではない。また、このモデルは、本質的に高い変動性を有する。彼らの年齢として興味深いことに、自然発症高血圧ラット10は、自発的なICHを開発しています。 ICH現像後、これらの動物の研究は、ICHにヒト素因主要な併存疾患のうちの1つの存在下において疾患を模倣することができる。クロストリジウムコラゲナーゼ11またはinstrastiatal注入のこれらの他のモデルが存在するが、線条体内注射utologous全血12日現在、前臨床のICHの研究に使用される2つの最も一般的なモデルです。
ICHモデル選択は、種選択及び血腫の形成を誘導する方法を含む実験的な質問の目的に基づいてなされるべきである。例えば、ブタはマウスと比較して、比較的大きな白質脳容積を持つ大規模な動物である。このように、ブタモデルは、ICH以下の白質病態生理を研究するのに適している。これとは対照的に、げっ歯類の脳は、主に灰白質ですが、トランスジェニックのシステムは、ICH後に負傷し、回復の分子メカニズムを評価するためにげっ歯類を有用にする。各モデルには、慎重に実験前に考慮されるべきであるその固有の長所と短所（ 表1）を有する。
次のプロトコルは、マウスでの自己血およびコラゲナーゼ注入モデルを示しています。これらのモデルは、もともとラットで開発されたモデルから、各翻訳されている13,14およびICH後の細胞死に関連する分子メカニズムを探索するのに広く利用可能なトランスジェニック技術を使用することができます。両方は、ヒトICH明らかに異なる損傷メカニズムを示し、両方は、行動的および組織学的尺度の点で明らかに異なる予想される結果を有する。従って、特定の仮説は、他の上で一つのモデルに自分自身を貸すことが、多くのアイデアが両方のモデルでの検証が必要な場合があります。
コラゲナーゼおよび自己血注入脳内出血モデルの特性を表1の比較。
| コラゲナーゼ注入 | 血液インジェクション | |
| 使いやすさ | + + + + | + + | + + | + + |
| 出血径の制御 | + + | + + + + |
| 血液逆流 | + | + + |
| ヒト疾患をシミュレート | + | - |
| 簡潔 | + + | + + |
| 複数の種で使用 | + + | + + |
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Protocol
倫理声明：このプロトコルは、デューク大学機関動物実験委員会によって承認され、動物の倫理的な使用のためのすべてのガイドラインに従ってきた。
機器の1。準備
- 手術前に手術器具をオートクレーブ。
- 70％エタノールで定位装置を消毒。
- 水浴の電源を入れ、42℃の水の温度を保つ
- 0.4μLあたり0.075 Uの濃度で生理食塩水をタイプIV-Sのクロストリジウムコラゲナーゼを溶かす。
2。コラゲナーゼ注入モデル
- マウスを秤量する。
- 30％O 2/70％N 2中の5％イソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。十分な麻酔は、マウスの呼吸が毎秒1に減速している約2分後に通知されます。
- 30ミリメートル20のG静脈内カテーテルで気管挿管。
- カテーテルを接続げっ歯類ベンチレータと機械的に30％に1.6％イソフルランで肺を換気する O 70分の2 0.75ミリリットルの配信回換気量と毎分105回の呼吸の割合で％のN 2 ..
- 電子シェーバーで頭皮を剃る。マウスを麻酔し、挿管された後、シェービングのための別のワークステーションに移動してから、手術台に戻った。
- 定位フレームに頭部を固定し、基準点として冠状および矢状縫合の両方でヘッドを水平に。
- 目に眼軟膏を適用します。
- 直腸温度プローブを挿入します。ウォーターベッドの循環アンダーボディを使用して37.0±0.2℃の直腸温度を維持する。
- ワイプベタジンで手術部位を70％エタノールで、続いて3回繰り返す。
- 1cmの正中頭皮の切開を行い、ブレグマを露出するために、滅菌綿棒で左右に骨膜を拭く。
- 緯度左ドリル1ミリメートルの直径のバーホール2.2ミリメートル水冷式ドリルでブレグマERAL。
- コラゲナーゼバイアルを5回回転させ、その後、0.5μlのコラゲナーゼ溶液（定位フレームに取り付けられている）25 G針で5回（最後の洗浄の後に注射器内にコラゲナーゼ溶液を0.5μLのまま）0.5μLシリンジを洗う。
- バーホールで針の先端の位置を合わせた後、注射器から0.1μLを追放し、破棄するようにかみそりで針のベベルを拭く。
- マイクロマニピュレーターを用いて、大脳皮質への深い針3ミリメートルを進め、30秒間静止したままにします。
- 90秒かけて0.4μLを注入。
- 1％イソフルランを減少させ、5分間針動かままにしておきます。
- ゆっくりと針を撤回。
- 0.25％ブピバカインを皮下2滴と皮膚を縫合 - 1を適用します。
- イソフルラン気化器の電源をオフにして、定位フレームからマウスを外します。
- マウスはその後の気管抜管との自発的な換気を回復することができます。
- 清潔なケージにマウスを返し、への無料アクセスを許可する食料と水。
3。自己血注入モデル
- コラゲナーゼ注入モデルの2.11 - 手順2.1を実行します。
- 30 Gの50μLシリンジに無菌生理食塩水を50μlを描画します。
- 70センチメートルのPE10チューブをマイクロシリンジを接続します。
- 完全に脱エアチューブにPE10チューブにマイクロシリンジからすべての生理食塩水を排出する。
- 後の手順の間に生理食塩水と血液との混合を避けるために、PE10チューブマイクロリットル注射器装置の先端開口部に気泡を作るために1ミリメートルのマイクロシリンジのピストンを引き出します。
- 70％エタノールでマウスの先端中央尾動脈域拭き尾の先端に0.5〜1センチメートルにかみそりで動脈を切った。
- PE10チューブマイクロシリンジ装置にカットし、尾からの血液の40μLを収集します。注：ヘパリンは、針、チューブ、またはマウスで使用されていないこと。
- 麟蹄上にマイクロシリンジを取り付けctionポンプ。
- PE10チューブの端に27 G針の金属カニューレ部分を接続し、定位フレーム上のマイクロマニピュレータに針を固定します。
- 27 Gの針から血液を2μLを追放し、破棄するようにかみそりで針のベベルを拭く。
- バーホールで針の先端の位置を合わせ、皮質への深い針3ミリメートルを挿入します。
- 毎分2μLの割合で自己血35μlのを注入する。
- 1％イソフルランを減少させ、10分間針動かままにしておきます。
- 30秒以上の針を撤回。
- 0.25％ブピバカインを皮下2滴と皮膚を縫合 - 1を適用します。
- イソフルラン気化器の電源をオフにして、定位フレームからマウスを外します。
- マウスはその後の抜管に自発換気を回復することができます。
- 清潔なケージにマウスを返し、食物と水を自由にアクセスすることができます。
4。仮手術
- コラゲナーゼと同じ手順に従ってください充血針挿入後の注入がないことを除いて、Nモデル。
5。術後ケア
- 動物の首の後ろで、外科的処置の夕方に生理食塩水を皮下の0.5ミリリットルを注入。
- ケージの床に置かれ、小さなプラスチック製のコップに水とゲル食品で軟化した料理を提供する。 7日間毎日食べ物を交換してください。
- 7日間毎日、体重減少、創傷治癒、および不快感の兆候を確認してください。
- より大きい7日間の回復間隔が必要な場合は、必要に応じて、縫合糸の除去は、（30％O 2/70％N 2中で約1％イソフルラン）光吸入麻酔下で実施してもよい。
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Representative Results
血腫の拡大が（ 図2）が発生したとして、コラゲナーゼ注射後4時間-により血腫形成します（ 図1）の違いにより、同側回転はすぐに自己血を注射したマウスのためのウェイクアップ後に2内に示されている。同側の回転がないことは、重大な損傷の欠如に対する懸念を発生させる必要があります。最初の損傷後の日に、両モデルのマウスはかなりの神経学的欠損（ 図3）を示すべきである。注入後24時間で、同側半球には、安定した血腫量（ 図4）を示し;さらに、注射後24時間で、脳の水分含量は、自己血注入マウスにおけるコラゲナーゼ注射したマウスにおいて79.8 + 0.34％と79.3 + 0.23％であることが期待されるべきである。コラゲナーゼ注射したマウスの25％および自己血を注射したマウスの10％未満 - 死亡率は10との間に生じることが予想されるべきである。血腫量、脳浮腫、およびincreaにやむを得ない死線条体内注入後48時間 - SED頭蓋内圧は通常、最初の24の中に発生します。 72時間後に発生する死は、多くの場合（ 例えば 、軟化された食品や水に容易にアクセス）適切な損傷後のケアを回避することができる。機能回復は、一般的に自己血を注射したマウスは、コラゲナーゼ注射したマウスよりも有意に速い回復を傷害後2日目で開始されます。
図1。脳内出血の自己血およびコラゲナーゼ注入モデルを比較するマウスの脳のシリアル磁気共鳴画像。35μlの自己血（A）の左線条体内注射を介して脳内出血誘導後または0.075 UタイプIV-Sのクロストリジウムコラゲナーゼ（B）中の10から12週齢のC57/BL6雄マウス、シリアル磁気共鳴IM高齢化は自己血を注射したマウスでの安定した血腫形成に比べ、コラゲナーゼを注射したマウスにおける血腫の拡大を示しています。血腫ボリュームは、それぞれ1で10.1、23.1、29.9ミリメートル3、6、およびコラゲナーゼ注射後12時間、それぞれ、および7.0、5.8、3.2ミリメートル3 1で、6、および全血注入後24時間、である。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図2脳内出血後のマウスの24時間内のコーナーのターンテスト左大脳基底核、10の期待される同側ターニング応答の存在にすぐに線条体内コラゲナーゼ注入後に撮影した- 。12週齢のC57/BL6雄マウスは、十分な傷害を意味する。このターニングコラゲナーゼを注射したマウスでの4時間 - 自己血を注射したマウスにおいて有意な損傷後2以内、すぐに発生する必要があります。両モデルのマウスには、より左側示した無傷のマウスと比較して損傷後になります（** P <0.01、事後Scheffeの検定と一元配置の分散分析であり、n =群10匹）。
図3マウスでの脳内出血後のロータロッドのパフォーマンスベースラインと10の傷害回転棒レイテンシー投稿-左線条体内35μlの自己血- 、0.075 UタイプIV-Sクロストリジウムコラゲナーゼ注入後1週間の12週齢のC57/BL6雄マウス、または偽手術（* P = 0.022;事後Scheffeの検定と反復測定ANOVAを、F値= 12.726であり、n =群10匹）。マウスはかなりの訓練の偏りを避けるために、損傷後一日おきに検査する回転棒を介して評価されています。</ pの>
図4脳内出血後のヘマトキシリンおよびマウス脳のエオシン汚れ 10の顕微鏡写真- 。35μlの自己血（右）または0.075 UタイプIV-Sのクロストリジウムの左線条体内注入後24時間で12週齢のC57/BL6雄マウスの脳コラゲナーゼ（左）。血腫ボリュームは、コラゲナーゼの注入と、全血注射後6.4ミリメートル3の後に20.2ミリメートル3である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
新興前臨床研究と治療の15〜18有望ため生じた大規模臨床試験にもかかわらず、そこにICHにおいて結果を改善することが実証全く薬理学的介入はなく、お手入れは、主に支持したまま。可能な治療のリストは、このようなトランスクリプトームおよびプロテオミクスワークなどの高スループット技術によって生成することができる。これらの技術は、前方、潜在的な治療標的の知識を進めるために継続し、有望なターゲットの後方翻訳が最善の臨床的に関連する前臨床モデル19〜22を使用することで調べることができる一方で。彼らが選択した候補者の迅速な処理能力、 生体内でのメカニズムの検討、投与、治療濃度域、および臨床試験を23〜25の開発に密接に他のパラメータの安価な調査を可能にするので、このようなモデルは便利です。明らかな利点は、前臨床モデルを使用して存在するが、モデリングは、最も臨床的に関連するBで発生したUTロジスティック実現可能なシステムを利用できる。モデルは、霊長類などの「高い」ために動物のために存在するが、ヒトの疾患をモデル化するためのマウスの使用は、病理学的メカニズムと治療効果を調べるに安価で、高スループット、および強力な技術を提供しています。トランスジェニックシステムを組み込むことに関与機構経路および細胞集団の、より堅牢な評価を可能にする。
現在、2つのマウスモデルは、一般的に使用されている：線条自己血やコラゲナーゼ注入。両モデルとも、他のストロークモデルと比較して、汎用性と使いやすい。両モデルとも、地域の応答を評価することができるように、様々な脳領域26にICHを誘導することができる。血腫量が制御され、軽度、中等度、重度損傷の評価を可能に変更することができます。そして臨床的に関連する生理機能（ 例えば 、血圧、体温など ） を制御することができる。最後に、各モデルは、当初に開発している間ラットは、どちらも以来ジェニックシステム21,24,25,27の使用を可能にするために、マウスに翻訳されています。それぞれが、ICHの明確に異なるコンポーネントを表ししかし、各モデルは、ICHのさまざまな側面の研究に適しています。自己血注入は、実質内血液曝露に対する脳の反応を再作成することができる。従って、初期質量に影響および剪断力、軽度の炎症性変化、アポトーシス、及び血液吸収がすべて10,28を研究してもよい。また、このモデルへの最近の改変は、血腫の拡大29,30を模倣する能力をもたらした。しかし、このモデルは、ヒト疾患で見られる血管損傷および/または血腫拡大のコンポーネントを起動しません。これとは対照的に、コラゲナーゼ注射は、血管破裂、早期の血腫の拡大、強化された神経炎症効果の要素が追加されます。明白な懸念は、この炎症作用へのコラゲナーゼの人為的な貢献については存在するが、ハードEが不足しているこの31 vidence、そして私たち自身の（未発表）のデータは、単独でのコラゲナーゼは、細胞培養における顕著な炎症反応を誘導しないことを示唆している。
手続き的な観点から、両モデルは、マイクロサージェリーを有する限られた技能を必要とし、再現性のある効果を得るために、このようにして、容易に学習される。避けるべき落とし穴は、1）硬膜の侵入や穴あけ、2）または針の挿入と脳室系の浸透熱脳損傷を作成する。硬膜損傷は注入剤の逆流を可能にし、無実質内血腫形成に少し中の脳室内注入の結果。さらに、ケアは、新たに形成された/成形血腫を混乱しないように、針の撤退の際に注意する必要があります。死亡したマウスは、一定の割合で予想されるず、直接血腫の大きさと所望の損傷の程度に関連している;従って、この結果は、注入剤の体積/濃度によって滴定することができる。
すべてのモデルと同様に、プロトコールは、特定の事業者による使用のために最適化される。降り続くインビボ系での固有の変動のために、成功のための重要な要因として、特定のモデルの経験を誇張することはできません。可能な限り最高の実験モデルを選択する際に、モデルの特色、指定されたモデルで、オペレータの経験、関心のあるアウトカム指標、および物流の要因がすべて考慮されなければならない。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | 51603 | |
| Probe holder with corner clamp | Stoelting Co. | 51631 | |
| Mini grinder | Power Glide | Model 60100002 | |
| 0.5 μl syringe | Microliter | 86259 | 25 G needle |
| 5 μl syringe | Microliter | 7637-01 | |
| 30 G microliter syringe | Microliter | 7762-03 | |
| Syringe pump | KD Scientific | Model 100 | |
| Heat therapy water pump | Gaymar Industries, Inc. | Model# TP650 | |
| Circulating waterbed | CMS Tool & Die, Inc. | ||
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Isoflurane vaporizer | Drager | Vapor 19.1 | |
| Air flowmeter | Cole Parmer | Model PMR1-010295 | |
| Induction chamber | Self made | ||
| Otoscope | Welch Allyn | 22820 | |
| Intravenous catheter | Becton-Dickinson | 381534 | 20 G, 1.16 inch Insyte-W |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC10019-360-69 | |
| Collagenase Type IV-S | Sigma | C1889 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton-Dickinson | 427401 | |
| 27 G 1 1/4 inch needle | Becton-Dickinson | 305136 | |
| Surgical scissors | Miltex | 21-539 | |
| Forceps | Miltex | 17-307 | |
| Needle holder | Boboz | RS-7840 | |
| Monofilament suture | Ethicon | 8698 | Size 5-0 |
| Indicating controller | YSI | 73ATD |
References
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