Summary
キイロショウジョウバエでは、自発運動などの行動に影響を与える遺伝的または環境的操作を研究するのに有用である。ここでは、赤外線ビームと自発運動を定量化するためのデータ解析ソフトウェアのモニターを利用したプロトコルを記述します。
Abstract
キイロショウジョウバエは、動作に影響を与える環境的遺伝子操作を研究するための優れたモデル生物として用いられてきた。一つのこのような挙動は、自発運動である。ここでは、 ショウジョウバエの人口を監視し、一度に数日間ハエの自発運動の継続的な監視を可能にする追跡システムを利用して我々のプロトコルを記述します。この方法は、単純で信頼性が高く、客観的であり、加齢、性別、食物のカロリー含有量の変化、薬剤の添加、又はヒト疾患を模倣する遺伝子操作の効果を調べるために使用することができる。
Introduction
ショウジョウバエは、 キイロショウジョウバエは 、学習と記憶、社会的相互作用、攻撃性、薬物乱用、睡眠、感覚機能、求愛、1,2を交配などの複雑な動作を、基礎となるメカニズムを研究するための貴重なモデル生物として用いられてきた。複数のプロトコルを介して研究されてきた一つの動作では、自発運動である。負走地はショウジョウバエの活性を測定するために開発された最初の方法のいずれかで、このプロトコルは、ハエが容器1,3の底に振とうした後にバイアルの一定の高さに到達するハエの割合を測定することを含む。この方法は、簡単な、安価であるという利点を有しており、それは、任意の実験室で行うことができる特別な装置を必要としないからである。なお、ハエの移動度3上の異なる遺伝子操作の影響を研究するための有用なスクリーニングツールとして使用されている。しかし、それは、時間と労力aはNDは、バイアルと人間の録音の変数振盪バイアスの可能性を持っています。
負走地法は底にハエの揺れ次フライバイアルの写真を取る急速反復マイナス走地（リング）法4,5、の開発によって大幅に改善した。このプロトコルの利点は、その感度と同時に、フライバイアルを多数試験する可能性である。しかし、このプロトコルはまだ、人的ミスの可能性を持っており、唯一のマイナス走地を測定します。他の研究室には、自発運動6を決定するために、培養バイアル中で、単純な観察 を使用している。
最近フライ自発運動活性を測定するためのいくつかのビデオ記録システムが開発されている。 Oneビデオモニタリングプロトコルが7を記録する前に調整するための時間を提供する。スロースンらによって記載された方法はまたmovemenを停止するために空気パルスを使用して可能性のある動物7にストレスかもしれない記録開始まで、T。この方法では、平均速度、最高速度、移動中の時間過ごすなど別の3次元追跡システムは、フリーフライトの離陸8の〜0.2秒の間に、個々のハエの最大速度を計測についての情報を提供しています。三次元映像監視プロトコルは、GFPを発現しているハエおよびハエの移動度を決定するための9の蛍光の検出を可能にするフィルタを備えた複数のカメラを使用する。このプロトコルでは、ハエショウジョウバエ培養バイアル10の形状に潜在的に円筒飛行パターンを示す傾向がある。この方法は、2つのハエ11の自発運動を測定することができ、ドームを使用することによって改善された。自動的にショウジョウバエの個人と社会的行動を監視し、定量するためにカメラを使用するハイスループット方法はまた、12に記載されている。ゾウら他は、飲んで、食べて、飛んで、移動、寿命の挙動や、休憩などの動きを記録するために2コンピュータ支援のカメラを使用して、または個々のtephritid果実の死亡は13飛ぶ行動モニターシステム（BMS）を開発しました。いくつかの他のビデオシステムは、ハエの行動活性14,15をモニターするために開発されてきた。
ここでは、人口のモニタを利用するショウジョウバエの活性を定量するための方法を記載している。これらのモニタは、12時間の昼夜光サイクルで25℃の温度と湿度が管理インキュベーターに収容されています。各集団モニタは、3つの異なる高さに位置するリング状に配置された赤外線ビームを有している。リング全体のハエが動くたびに、それは独立して記録し、バイアル内のハエの活性をカウントしたマイクロプロセッサによって記録された赤外線を、中断します。マイクロプロセッサは、ユーザー定義のintervaのコンピュータに、バイアル内の全活性をアップロード60分、1秒ごとに異なる可能性があり、LS。ここで説明する方法は、ハエが新しい環境に適応するための十分な時間を提供し、ハエのような多くの120として集団の自発運動活性を同時に測定することを可能にする。加えて、我々は、モビリティ集団温度制御されたインキュベーター中でモニターし、結果に影響を及ぼし得る潜在的な要因の設定、メンテナンス、フライ食品の調製を記載する。この方法は、異なる環境的または遺伝的改変は、ハエの自発運動活性にどのように影響するかを研究するために使用することができる。
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Protocol
注：カントン-S株は、ブルーミントンストックセンターから入手した標準的な野生型バックグラウンド線である。
1。食品の調製および食品の千ミリリットルのためのレシピ
注：このセクションでは、食事の準備のためのプロトコルについて説明します。大きな金属製ポットを一度食品の約18 Lを調製するために使用される。ここで説明するプロトコルは、小型化、千ミリリットルのH 2 Oを使用しています食品は二回オートクレーブされている。
- 643ミリリットルの水に113グラムのショ糖と28グラムのビール酵母を混ぜる。 15分間を通して混合する撹拌棒を25℃のホットプレートセット上の成分を残す。
- 20分間オートクレーブ食品ソリューション。
- 268ミリリットルの水に49グラムのコーンミールと8.1グラムの寒天を混合し、ステップ1.2で説明したオートクレーブ処理食品混合物に追加します。大スプーンや泡立て器でよく混ぜる。
- さらに20分間オートクレーブ食品混合物。
- プレートの上に食べ物を置き、攪拌棒を一定に混合してクールダウンしましょう。私Fの追加ソリューションは、ミフェプリストン（RU486）として、食品に添加されるべきであり、60℃に設定したホットプレートの上に食べ物を維持し、食べ物が必要な温度に達したときにソリューションを追加。
- 10.7ミリリットルの100％EtOH中2.4グラムのtegoseptを溶解し、完全に溶解し、約15分間混合する撹拌機をコールドプレート続ける。
- 食品の温度が60℃のときに食品にtegosept液を加え、よく混ぜる。
- 広いバイアルに、食品の約10ミリリットルを注ぐためにポンプやフードディスペンサーを使用してください。食料ディスペンサを用いて1時間で100幅のプラスチックバイアル（1トレイ）に同時に食品を注ぐことができる。
- キムワイプとチーズ布でバイアルをカバーし、冷却する12から24時間室温で食べ物を残す。 4℃で食品を維持し、3〜4週間以内に使用しています。フライ作業のため、使用前に室温に食べ物を温める。
ガラス製の2。準備
- ステップ1にリストされているプロトコルに従って食べ物を準備します。 人口モニタの正しいサイズで各狭、ガラスバイアル中への食品の分量5ミリリットル。食品の量は、人口モニターの最低のリングの下にあることが十分に低くなければならない。
- 食品は室温に冷却した後のスポンジプラグが付いているバイアルをカバーし、最大で2週間、4℃で保管してください。バイアル内の食品の量がかなり低いので、どんな乾燥を防ぐために1〜2週間の食品を使用することをお勧めします。
- 使用前に室温にバイアルを暖める。
親のハエの3。メンテナンス
- 標準的な実験室の食品の広いプラスチックバイアルにハエを成長させ、12時間の明/暗サイクルで25℃で加湿し、温度制御された環境室でバイアルを保持します。日照時間は、この研究室で午前6時から始まります。
- 午前中に明確な大人が親のハエが収集されるバイアルから飛ぶ。
- 新たに孵化flieを収集女性のハエが処女であることを確認するために羽化した後8時間以内のCO 2パッドの上の性別で区切るSと。ハエは羽化後の8時間後に結合するように開始します。
- 処女オスとメスのハエは、年齢の5〜10日の間である場合には、標準的な食品や上部のアクティブな酵母のいくつかの粒をバイアル中に10人の男性と10女性のハエを置く。
注：ハエの同じ数を用いて二日間バイアル中でそれらを維持して幼虫の密度を制御する。活性酵母の添加は、卵の産生を促進する。 - 交尾と2日間、12時間の明/暗サイクルで25℃に温度制御された環境室に卵を産むためにハエを保つ。親のハエの5〜10バイアルを設定します。
- 一日おきに新しいプラスチックバイアルにハエをパスし、25℃のインキュベーターに卵バイアルを保つ
実験ハエの4。コレクション
- 9日後のハエはparentaバイアルから孵化するために開始されますLのハエは（ステップ3.6で説明した。）の卵を置いた。明確で初日に孵化ハエを破棄して、インキュベーターにバイアルを返す。 1日目に孵化ハエのほとんどは女性である。ハエのより同期化された人口は2日目に孵化するでしょう。
- CO 2のパッド上の24時間の場所に、新たに孵化ハエ内および絵筆や金属スプーンで25の男性とバイアル当たり25女性のハエを集める。 CO 2のいずれかの影響を最小限に抑えるため、短時間でのCO 2のパッド上のハエを保つ。バイアルに羽化の日を書き留めます。実験用および対照群について、少なくとも5複製バイアルを組み立てます。
- 12時間の明/暗サイクルで25℃に温度制御された環境チャンバ内でバイアルを保管してください。
- 漏斗を使用して一日おきに新しいプラスチックバイアルにハエを渡す。
- 実験のために必要な、年齢に達するまで、ハエを熟成。
5。モビリティ·モニターのセットアップ
- 置く人口は温度制御されたインキュベーター内で監視します。
- PSIU中1開口部に5個々のモニタを接続できます5ウェイスプリッタ（マルチライン） を介して電源インタフェースユニット（PSIU）への4線式の電話ケーブルで、各モニターを接続します。 図1Aおよび図2Bを参照してください。
- ライン電源コンセント（100〜240V）にPSIUを接続します。 2嵌合PSIUジャックの一つに電源出力コネクタを差し込みます。正しく接続されている場合、隣接する緑色のライトが緑色に点灯します。
- ユニバーサルシリアルバス（USB）のハードウェアにPSIUを接続します。データ記録用のMacintoshまたはWindows PCとのUSBハードウェア間のUSBケーブルで接続します。コレクションは一度日間実行されるためには、データ収集のために、専用のコンピュータを持っているのがベストでしょう。
- USBソフトウェア（PSIUdrivers.zip）をダウンロードします。 USBドライバソフトウェアは一度だけダウンロードされる電源インターフェイスとニーズによって使用される。これは、合成コンピュータプログラム及びPSIU /活動モニタ間のデータリンク。 PCはCOMポートを使用するためのMacintosh用の単純なシリアルポートを使用しています。
- メーカーノート308.pdfの指示に従って、マッキントッシュOSX（インテル）またはWindows PC（XP/Vista/7用）プログラムのためのコンピュータプログラムをダウンロードしてください。
- コンピュータプログラムを起動し、環境設定、照明やモニターをクリックして、プログラムを設定。ユーザーがプログラムを停止するには、「終了」を選択するまでプログラムが実行されます。コンピュータプログラムまたはコンピュータの電源が切れている場合はモニターは、ビームの中断をカウントしていきますが、プログラムが再起動されるまで、カウントは記録されません。その場合、最初の読み取りはPSIUがコンピュータにデータを送信した最後にすべてのカウントが含まれます。
- [初期設定]タブを選択し、シリアルポート、PC用のMacintoshと、COMのためPSIUを選択します。
- 読書秒〜間隔、分、または時間を選択します。 <李>のモニターを選択します。各モニターには、製造業者によって与えられ、その固有の番号を持っています。メーカーによってモニターに与えられた番号に対応しているモニタの範囲を選択します。
- ライト·ボックス：すべてのモニタが正しく接続されていることを確認し、ソフトウェア上のモニタ番号の横にある緑色の光によってマークされています。赤い光は、接続が失われたことを示し、ブラックボックスは、システムがオフか、正しく設定されていることを示しています。
6。テストの設定
- 4℃から食品を含有するガラスバイアルを取り外し、室温にそれらを暖かくしてみましょう。
- CO 2パッドの上に、同じ年齢の男女別のハエ。老化研究のためには、早ければ生後3日間などの移動性の研究を開始することができる。
- 食品を含む各ガラス瓶に10男性または女性の10ハエを置く。ハエの各実験およびコントロールラインのために、それぞれの性別について少なくとも3バイアルを使用してください。
- VIを保つハエがハエを確保するために、CO 2から回復するまで、彼らの側にALSは、食品にはまりません。別々のハエ約8:00 AMにとCO 2から回復するために、室温で約2時間のためにそれらを残す。
- インキュベーター内に収容された人口のモニターの中にバイアルを置きます。
- ハエは彼らが新しい環境に適応させるために、インキュベーターに入れられた後の最初の24時間以内に収集されたデータを破棄します。
- 食品の乾燥を避けるために、新しいバイアルに3〜4日後にハエを渡します。ハエが死亡する傾向があるか、年齢40日以上経過した場合は、2日後にハエを渡し、2日目のために収集されたデータを使用しています。また、適切な複製物を確実にするために、グループごとに複数の3バイアルを使用しています。死んだハエにバイアルからのデータは無視され、分析には含まれていない必要があります。
7。活動モニターを実行し、合計自発活動の計算
- 設定を選択 - データ収集の間隔を<。BR />注意：コンピュータプログラムは1秒から60分の範囲の間隔でデータの収集を可能にする。 10と30分の期間が時間点の圧倒的な数を有することなく、移動性に関する十分な情報を提供することが見出されている。選択した期間で、プログラムは、コンピュータに、各モニタの現在の合計数を送信し、ゼロから再びカウントを開始します。コンピュータプログラムは、コンピュータデータシステムによって作成された新しいフォルダ内のデータを格納する。各モニタで収集したデータを別々に格納され、個々のテキスト文書は、各バイアルのために作成されています。データが連続している限り、プログラムが動作するように収集されます。
- 実験の最後に、Windowsパソコン（のXP/Vista/7）プログラムのためのMacintosh OSX用FileScan110X（インテル）またはSystemMB108を使用してデータをスキャンします。
注記：スキャンプログラムは、重複測定値を排除し、録音が完了していることを確認します。 - 特定の時間およびPの中に収集したデータを保存する日のeriod。実験名を選択し、分析のためのコンピュータ·データ·フォルダからファイルをコピーします。
注：この時点で、活性間隔を変更することができ、別のものに変換される。元のデータは、コンピュータデータのフォルダに保存されたままになり、限りが削除されないように取り出すことができます。
8。データ解析
- データ分析のためのExcelスプレッドシートの列にテキストファイルに収集されたデータをコピーします。このソフトウェアによって収集されたデータは、研究者によって選択された時間にわたって単一のモニタで全活性を表す数値を含む列である。
注：各モニターに収集されたデータは、別のテキストファイルである。各モニタの32列があります。最初の6列は、空であり、唯一の0が含まれている。次の3つが中央で底部リングで収集されたデータを含んで、トップリングた。彼らは、任意のデータを含んでいないので、残りのチャンネルを削除することができる。各リングaを出力する時間ごとに単一の値。 図2の生データのスクリーンショットを参照してください。 - 赤外線ビームの3の異なる高さで収集活動の和を表し、各モニタのための所望の時間内の総活性を算出。
注：時間は、数時間、24時間又は数日の範囲であり得る。 - 平均運動活性および3生物学的複製を表す3モニターの間の標準偏差を決定。
注：データは多数の試験を用いて統計的有意性について分析することができる。二スチューデントのt検定、一元配置分散分析（ANOVA）およびテューキーHSDポストホックテストは、自発運動量16から24時間にいくつかの環境又は遺伝子操作の効果を決定するために使用することができる。使用することができ、予め17を公表されている他の多くのプログラムが存在する。
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Representative Results
ショウジョウバエの自発運動は、フライ性別（ 図3A）、食品（ 図3B）および明/暗サイクルのカロリー量に依存します。光がオフにされると、その場での活動は劇的に減少する。 図3（a）は、オスとメスのハエの自発運動記録の24時間を示している。 x軸上のアスタリスクは、光スイッチが切られた時刻をマークし、明暗サイクルへの移行は。 図3Bは、トウモロコシの食品に3日齢のハエ男のための3つの人口のモニタに収集された平均的な自発運動の間の標準偏差を示している。 24時間の間に自発的な身体活動のために収集されたデータはまた、24時間の期間、 図3C中にその場あたりの総活性として表現することができる。
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図1：2、人口のハエの自発運動活性のモニタリングのための人口のモニターの設定A）は、いくつかの人口モニターは5ウェイスプリッタに4線式の電話ケーブルで接続し、温度制御されたインキュベーター内に配置され、B）より高倍率3異なる高さに位置赤外線ビームで人口モニターと3つのリング内のバイアルの配置を示して監視し、。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2：そうで生成された生データのスクリーンショットftware日付、時刻、およびリング1で収集したデータ、2、および3を示す。Rはリングの略です。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3：オス（ブラック）と女性のA）の平均自発運動（マゼンタ）は、標準的な実験食で24時間の間に飛ぶ。データは10分のビンに収集され、3バイアル10ハエを含む各間の平均活動として計算フライあたりの平均活動を表しています。B標準的な実験食で24時間の間にオスのハエの）平均自発運動。データは10分のビンに収集され、目の間の平均活動として計算フライあたりの平均活動を表しているREEバイアル。標準偏差緑色でマークされています。歳の男性が24時間にわたって低カロリー（0.5X）（緑）、高カロリー（1.5X）（ブラウン）食品に飛ぶ20日のC）の合計の活動は。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ハエの自発運動は、年齢、遺伝的背景、性別2,13,18,19などの多くの要因に影響されます。また、このような食品、環境の温度、異なる薬物の付加、および昼間/夜間光周期のカロリー量などの環境要因は、フライ活性に影響を与えることができる。例えば、同年齢の男性のハエは、女性（ 図1）に比べて高い自発的な身体活動を持っている。したがって、同じ年齢および性別のハエは、互いに比較されるべきである。このような過剰発現または特定の遺伝子の機能喪失などの場での活動に遺伝子操作の効果を調べるときに、実験および対照ハエは異なる遺伝的背景や第二のサイト修飾の潜在的な影響を除去するために、同じ遺伝的背景になければなりません。これは実験的な女性は、10代のための1118またはYW男性ワットへ飛行戻し交配することによって達成することができる。 10の後に1118またはYWハエW戻し交配の世代は、遺伝的コントロールとして使用することができる。遺伝的背景をコントロールするもうひとつの方法は、ハエの時間と組織特異的に目的の遺伝子の過剰発現またはダウンレギュレーション（RNAi）を可能にする誘導性GAL4 GeneSwitch（GAL4-GS）-UASバイナリシステムを使用することですミフェプリストン（RU486）20,21を追加して食糧を供給した。 GAL4は二量体化とUAS配列に結合するRU486が必要です。遺伝的コントロールは、ハエ兄弟しているエタノール（RU486の希釈剤）を添加した食品続けた。
様々な方法がショウジョウバエの移動度を記録するために使用されてきた。ここで説明する方法は、単純な信頼できる、より有益であり、そのような負の走地性ショウジョウバエの移動度を決定するために使用される他の方法と比較して、バイアスの少ない可能性がある。それは時間の長い期間のためのハエの複数の集団の目的を同時に記録できるという利点がある標準培養条件。人口のモニターを使用して自発運動を測定することは、食品の異なるカロリー内容がアクティビティを飛ぶまたはCR 16上のハエの活性の増加の根底にある遺伝的メカニズムを研究するためにどのように影響するかを研究するのに役立ちます。同様に、本システムは、異なる遺伝的変異が、加齢、又はフライ自発身体活動に異なる薬物の付加の影響を研究するために使用されている。個々のチューブの代わりに人口モニタの使用は、睡眠行動を分析し、他17,22-24、インビボでの概日リズムを研究し、ハエの異なる遺伝子型にH 2 O 2の抵抗を測定することができる。
任意の方法と同様に、この監視システムには限界がある。長時間のハエを監視する場合、フライ死亡の原因となる可能性は、特に高齢者のハエを使用している場合がある。唯一の健全なハエを使用することで、これを防ぐことができます。またごとに複数の3生物学的複製を使用するようにしてくださいグループハエが古いか、死んする傾向がある場合には。一つの解決策は、ハエが環境に調整した後、一日2の間に収集された移動性を監視し、使用データ内の2日間、ハエを維持することです。死が発生した場合、我々は計算にバイアルのために収集されたデータを使用しないでください。我々はTrikinetics活動モニターにのみ垂直に配置バイアルを使用してきたが、水平方向にバイアルを配置する可能性がございます。私たちは食べ物を標準インキュベータ培養条件に似ているバイアルの下部にあるため、垂直方向にバイアルを配置するように選択する。これはハエが起動して、バイアル歩いてより多くのスペースを持つことができ、それが負の走地実験と類似している。食品の乾燥が問題24になった場合に、インキュベーターの湿度も監視する必要があります。このシステムは、平均的な活性の点でデータを提供し、活動の性質についての具体的な詳細情報を提供していません。 2ハエが同時にビームを横切る場合に加えて、それは、WiLLのみ1中断として記録される。ここで説明するプロトコルは、全活性を定量化するのに便利ですが、そのような飛行軌道や速度など、より正確な情報が12,14,25を希望している場合は、他のプロトコルには、有用なデータを提供することができます。
この実験に続いて、遺伝的または環境的操作による自発運動量の差が知られているであろう。このプロトコルの将来の変更は、トップ、ミドル、人口モニターの下部リングのハエの異なるレベルの活性を分析することである可能性があります。これはハエの集団は、食品に近いバイアルの底に、または上部のほとんどの時間を費やすかどうかを決定するであろう。現在の形でのプロトコルは、 ショウジョウバエ実験および対照集団の自発運動活性を正確に、同時定量が可能になります。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（BRへAG023088）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25 x 95 mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
References
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