Summary
Drosophila melanogaster gibi spontan lokomotor aktivite gibi davranışları etkileyen genetik veya çevresel manipülasyonlar okuyan yararlıdır. Burada kızılötesi ışınları ve spontan lokomotor aktivitesini ölçmek için veri analiz yazılımı ile monitör kullanan bir protokol açıklar.
Abstract
Drosophila melanogaster davranışını etkileyen çevresel ve genetik manipülasyonlar incelemek için mükemmel bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Böyle bir davranış, spontan lokomotor faaliyettir. Burada Drosophila nüfus monitör ve bir anda birkaç gün sineklerin spontan lokomotor aktivitesinin sürekli izlenmesini sağlayan bir izleme sistemi kullanır bizim protokol açıklar. Bu yöntem, basit, güvenilir ve objektif ve yaşlanma, cinsiyet, gıda kalori içeriği değişim, ilaç eklenmesi, ya da insan hastalıkları taklit genetik manipülasyonlar etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Meyve sinekleri, Drosophila melanogaster, bu tür öğrenme ve bellek, sosyal etkileşim, saldırganlık, uyuşturucu, uyku, duyusal fonksiyon, kur, ve 1,2 çiftleşme gibi karmaşık davranışlar, altında yatan mekanizmaları incelemek için değerli bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Birden protokoller aracılığıyla çalışılmıştır tek davranış spontan lokomotor faaliyettir. Negatif geotaxis Drosophila aktivitesini ölçmek için geliştirilen ilk yöntemlerden biri, ve bu protokol sinekler kap 1,3 dibine çalkalanmıştır sonra şişe belli bir yüksekliğe ulaşmak sinekler yüzdesini ölçmek içerir. Bu yöntem, basit ucuz olma avantajları vardır, ve o herhangi bir laboratuvarda yapılabilir herhangi bir özel ekipman gerektirmez beri. Bu sinek hareketlilik 3 farklı genetik manipülasyonlar etkilerini incelemek için değerli bir tarama aracı olarak kullanılmıştır. Ancak, zaman ve emek yoğun bir olduğunund nedeniyle şişelere ve insan kayıtların değişken sarsılmaya önyargı imkanına sahiptir.
Negatif geotaxis yöntem altına sineklerin sallayarak izleyen sinek şişeleri fotoğraflarını alır Rapid Iterative Negatif Geotaxis (HALKA) yönteminin 4,5, gelişimi ile üzerine geliştirildi. Bu protokolün avantajı duyarlılık ve aynı zamanda uçucu şişelerin, çok sayıda test olasılığıdır. Ancak, bu protokol hala insan hatası için potansiyele sahip ve sadece negatif Geotaxis ölçer. Diğer laboratuarlar lokomotor aktivitesini 6 belirlemek için kültür şişeleri basit gözlem kullandık.
En son sinek lokomotor etkinliği ölçmek için birçok video kayıt sistemleri geliştirilmiştir. Bir video izleme protokol 7 kaydetmeden önce ayarlama için zaman sağlar. Slawson ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir yöntem. Da movemen durdurmak için bir hava sinyali kullanırpotansiyel olarak hayvanlara 7'ye stres olabilir kaydın başlamasından kadar t. Bu yöntem, ortalama hız, maksimum hız, hareket zamanı harcama, vb başka bir üç boyutlu izleme sistemi ücretsiz bir uçuş kalkış 8 ~ 0,2 saniye süresince bireysel sineklerin maksimal hızını ölçen hakkında bilgi sağlar. Üç boyutlu bir video izleme protokol GFP ve uçucu hareket 9 belirlemek için flüoresans saptanması için izin filtreler ile donatılmış birden fazla kamera ifade sinekler kullanır. Bu protokolde sinekler bağlı Drosophila kültür şekline potansiyel olarak silindirik bir uçuş desenler, sergileme eğilimindedirler 10 şişeler. Bu yöntem iki sinek 11 spontan hareketinin ölçülmesi sağlayan bir kubbe ile geliştirildi. Otomatik olarak izlemek ve Drosophila bireysel ve toplumsal davranışlarını ölçmek için bir kamera kullanır yüksek verimli yöntem de 12 tarif olmuştur. Zou etark. içme, yeme, uçan, hareketli, ömür boyu davranışını ve dinlenme gibi hareketleri kaydetmek için iki bilgisayar destekli kameralar kullanır, ya da bireysel tephritid meyve ölümleri 13 uçar bir davranış monitör sistemi (BMS) geliştirdi. Birkaç diğer video sistemleri sinek davranış etkinliğini 14,15 izlemek için geliştirilmiştir.
Burada nüfus monitörleri kullanan Drosophila aktivitesinin saptanmasına yönelik bir metodu tarif etmektedir. Bu monitörler 12 saatlik bir gündüz-gece ışık döngüsü 25 ° C sıcaklık ve nem kontrollü kuluçka yerleştirilmiştir. Her nüfus monitör üç farklı kademeye yüzük yerleştirilen kızılötesi ışınlar vardır. Bir sinek halkaları üzerinde hareket eder, her zaman bağımsız kayıtları bir mikroişlemci tarafından kaydedilen ve şişenin içindeki sineklerin aktivitesini sayar kızılötesi ışınını keser. Bir işlemci, kullanıcı tanımlı interva de bilgisayara şişe içinde toplam aktivitesi yüklermı bu 1 saniye ile 60 dakika değişebilir. Burada anlatılan yöntemi, sinekler yeni ortama uyum için yeterli zaman sağlar ve sinekler 120 kadar nüfus spontan lokomotor aktivitenin aynı anda ölçülmesini sağlar. Buna ek olarak, biz, gıda hazırlanmasını tarif bakım sinek, hareketlilik nüfus sıcaklık kontrollü kuluçka monitör ve sonuçlarını etkileyebilecek potansiyel faktörler kurma. Bu yöntem, farklı çevresel veya genetik değişiklikler sineklerin spontan lokomotor aktivitesini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Canton-S suşu Bloomington Stok Merkezinden elde standart vahşi-tip arka hattıdır.
1.. Yiyecek Hazırlama ve Gıda 1.000 ml tarifi
Not: Bu bölüm, gıda hazırlanması için bir protokol açıklamaktadır. Büyük metal kaplar aynı anda gıda yaklaşık 18 L hazırlamak için kullanılır. Burada açıklanan protokol küçültüldü ve 1,000 ml H 2 O. kullanır Gıda iki kez otoklav edildi.
- 643 ml su içinde 113 g sükroz ve 28 g bira mayası karıştırın. 15 dakika boyunca karıştırmak için bir karıştırma çubuğuna sahip olan 25 ° C'de bir sıcak plaka dizi maddeler bırakın.
- 20 dakika için otoklav gıda çözüm.
- 268 ml su içinde 49 g mısır unu ve 8.1 g agar karıştırılır ve aşama 1.2 'de tarif edilen otoklava gıda karışıma ekleyin. Büyük bir kaşıkla veya bir çırpma teli ile iyice karıştırın.
- 20 dakika için otoklav gıda karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
- Bir tabakta yiyecek koyun ve bir karıştırma çubuğu ile sabit karıştırma ile soğumaya bırakın. Benf ilave çözümleri 60 ° C'de kurmak sıcak bir plaka üzerinde gıda tutmak ve gıda gerekli sıcaklığa ulaştığında çözümü eklemek, böyle mifepristonu (RU486) olarak, gıda ilave edilmelidir.
- 10.7 ml% 100 EtOH içerisinde 2.4 g tegosept çözülür ve tamamen çözülür ve yaklaşık 15 dakika boyunca karıştırmak için bir karıştırıcı ile soğuk plaka üzerinde tutun.
- Gıda sıcaklığı 60 ° C olduğunda, gıda tegosept solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın.
- Geniş bir şişe içine gıda yaklaşık 10 ml dökmek için bir pompa ya da bir gıda maddesi dağıtıcısında kullanın. Bir seferde 100 geniş, plastik şişeler (1 tepsi) içine aynı anda yemek dökmek bir yiyecek otomatı kullanarak.
- Kimwipes ve peynir bezle şişeleri örtün ve soğumasını 12-24 saat oda sıcaklığında yiyecek bırakın. 4 ° C'de tutun gıda ve 3-4 hafta içinde kullanın. Sinek iş için kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar yiyecek kadar ısıtın.
Cam Şişeler 2. Hazırlanması
- Adım 1 'de belirtilen protokole göre yemek hazırlama. Nüfus monitörler için doğru boyutu her bir dar, cam şişenin içine gıda kısım 5 ml. Gıda Bu miktar nüfus monitörün en halka altında olduğu kadar düşük olmalıdır.
- Gıda, oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra sünger fişleri ile şişeleri kapak ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın. Bir şişede gıda miktarı oldukça düşük olduğu için, herhangi bir kurumasını önlemek için bir ya da iki hafta içinde gıda kullanmak en iyisidir.
- Kullanmadan önce oda sıcaklığına şişeleri ısıtın.
Ebeveyn Sineklerin 3. Bakım
- Standart laboratuvar gıda ile geniş plastik şişelere sinekler büyümek ve 12 saat ışık / karanlık döngüsünde 25 ° C'de, nemlendirilmiş, sıcaklık kontrollü bir çevre odasında şişeleri tutun. Gündüz süresi bu laboratuvarda 06:00 başlar.
- Sabah açık yetişkin ebeveyn sinekler tahsil edilecektir hangi flakon uçar.
- Yeni eclosed Flie toplayıns ve eclosion dişi sinekler bakireler olduğundan emin olmak için sonra 8 saat içinde bir CO 2 pad üzerinde cinsiyete göre ayırın. Sinekler eclosion sonra 8 saat çiftleşmeye başlar.
- Bakire erkek ve dişi sinekler yaş 5 ile 10 gün arasında olduğu zaman, standart gıda ve üstte aktif maya taneler ile bir şişe içinde 10 erkek ve 10 dişi sinekler koydu.
Not: sinekler aynı sayıda kullanan ve iki gün boyunca bir şişe içerisinde tutarak larvaların yoğunluğunu kontrol edin. Aktif maya ilavesi yumurta üretimini teşvik. - Eş ve 2 gün boyunca, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile 25 ° C'de sıcaklık kontrollü bir çevre odasında yumurta bırakmaya sinekler tutun. Ebeveyn sinekler 5-10 şişeleri kurmak.
- Her gün yeni bir plastik şişeye sinekler geçmek ve 25 ° C'de bir inkübatör içinde yumurta şişeler tutmak
Deneysel Sineklerin 4. Koleksiyonu
- 9 gün sonra sinekler flakonlarından eclose başlayacak nerede Ebeveyl sinekler (adım 3.6 açıklanmıştır.) yumurta koydu. Açık ve ilk gün boyunca eclosed sinekler atmak ve inkübatör şişeleri dönün. 1. günde eclosed sinekler çoğu kadın vardır. Sinekler bir daha senkronize nüfus günde 2 eclose olacaktır.
- CO 2 balataları 24 saat yerde yeni eclosed sinekler içinde ve bir fırça veya metal kaşık ile 25 erkek ve flakon başına 25 dişi sinekler toplamak. CO 2 herhangi bir etkisini en aza indirmek için kısa bir süre için CO 2 yastıkları üzerinde sinekler tutun. Şişenin üzerine eclosion gününü yazın. Deney ve kontrol grupları için en az 5 suret şişeleri birleştirin.
- , 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile 25 ° C'de sıcaklığı kontrol edilen çevre odalarına şişeleri tutun.
- Bir huni kullanarak her gün yeni bir plastik şişeye sinekler geçmek.
- Deney için istenen yaşına kadar sinekler yaş.
5.. Hareketlilik Monitörler Kurma
- Yerleştirinnüfus sıcaklık kontrollü bir inkübatör izler.
- PSIU bir açılış için 5 ayrı monitöre bağlayabilirsiniz 5-yönlü bölücülerin (multi-line) aracılığıyla Güç Kaynağı Interface Birimi (PSIU) için 4-telli telefon kablosu ile her monitör bağlayın. Şekiller 1A ve 2B bakınız.
- Bir hat elektrik prizine (100-240 V) PSIU bağlayın. 2 çiftleşme PSIU krikolar birine güç kaynağı çıkış konektörü takın. Düzgün bir şekilde bağlı olduğunda bitişik yeşil ışık yeşil yanar.
- Universal Serial Bus (USB) donanım için PSIU bağlayın. Veri kayıt için bir Macintosh ya da bir Windows PC ile USB donanım arasındaki USB kablosunu bağlayın. Bu koleksiyon bir anda gün çalışır beri sadece veri toplama için adanmış bir bilgisayar olması iyi olurdu.
- USB yazılımı (PSIUdrivers.zip) indirin. USB sürücü yazılımı Güç Kaynağı arayüzü tarafından kullanılan ve sadece bir kez indirilebilir gerekiyor. Bu sentezlerbilgisayar programı ve PSIU / etkinlik monitörler arasındaki veri bağlantısı. PC kullanımı bir COM portu ve Macintosh için basit bir seri bağlantı noktası kullanın.
- Üreticiler Notlar 308.pdf tarafından verilen talimatları izleyerek Macintosh OSX (Intel) için veya Windows PC (XP/Vista/7) programları için bilgisayar programı indirin.
- Bilgisayar programı başlatın ve Tercihler, Işıklar veya Monitörler tıklayarak programı kurmak. Kullanıcı programını durdurmak için "çıkın" seçer kadar programı çalışacaktır. Bilgisayar programı ya da bilgisayar kapatıldığında ise monitörler kiriş kesintileri saymaya devam edecektir, ancak program yeniden başlattı kadar sayıları kayıt olmayacaktır. Bu durumda ilk okuma PSIU bilgisayara veri gönderilen son kez bu yana tüm sayımları içerecektir.
- Tercihler sekmesini seçin ve Seri Port, PC için Macintosh ve COM için PSIU seçin.
- Okuma saniye aralıkları aralığı, dakika veya bir saat seçin. <li> monitörleri seçin: Her monitör üreticisi tarafından verilen eşsiz bir numarası vardır. Üretici tarafından monitörlere verilen numaralara karşılık Monitör Aralığı seçin.
- Işıklar kutusu: yazılım monitör numaraya yanındaki yeşil ışık tarafından işaretlenmiş olduğu, tüm monitörler düzgün bağlandığından emin olun. Bir kırmızı ışık bağlantısı kesilirse olduğunu gösterir, ve bir kara kutu sistemi kapalı veya yanlış kurulmuş olduğunu gösterir.
6.. Deneme Oluşturma
- 4 ° C gıda içeren cam şişeler çıkarın ve oda sıcaklığına kadar ısınmaya bırakıldı.
- CO 2 pad üzerinde aynı yaştaki ayrı erkek ve dişi sinekler. Yaşlanma çalışmaları için o kadar erken yaşta 3 gün gibi hareketlilik çalışmalarına başlamak mümkündür.
- Gıda içeren her bir cam şişenin içine 10 erkek veya 10 dişi sinekler koydu. Sinek oluşturduğu her bir deney ve kontrol hattı ve her bir cinsiyet için en az üç şişe kullanın.
- Vi tutunsinekler sinekler sağlamak için CO 2 kurtarmak kadar kendi tarafında als gıda sıkışmış alamadım. Yaklaşık 08:00 de ve CO 2 kurtarmak için oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat boyunca onları terk ayrı sinekler.
- Kuluçka muhafaza nüfus monitörler içindeki şişeleri yerleştirin.
- Sinekler onları yeni ortama uyum sağlamak için kuvöz içine koymak sonra ilk 24 saat içerisinde toplanan verileri atın.
- Gıda kurumasını önlemek için yeni şişelere 3 ya da 4 gün sonra sinekler geçirin. Sinekleri ölüme eğilimli ya da yaş 40 gün veya daha yaşlı iseniz, 2 gün boyunca toplanan 2 gün ve kullanımı verilerinin sonra sinekler geçer. Ayrıca, yeterli çoğaltır sağlamak için grup başına en fazla üç şişe kullanın. Ölü sinekler ile şişelere Veri gözardı ve analize dahil edilmelidir.
7. Faaliyet Ölçerler ve Toplam Spontan Aktivitesi Hesaplanması
- Tercihlerini seçmek - veri toplama aralığı <.br /> Not: bilgisayar programı sayesinde 1 saniye ile 60 dakika arasında değişen aralıklarla verilerin toplanması. 10 ve 30 dakikalık zaman noktalarında süreleri ezici sayıda kalmadan hareket hakkında yeterli bilgi temin ettiği bulunmuştur. Seçilen süre, program bilgisayara her monitör için mevcut toplam sayısını göndermek ve sıfırdan tekrar saymaya başlayacak. Bilgisayar programı bilgisayar veri sistemi tarafından oluşturulan yeni bir klasöre depolar. Her monitör toplanan veriler ayrı ayrı saklanır ve bireysel metin belgeleri, her flakon için oluşturulur. Verileri sürekli olarak uzun program çalışır olarak toplanır.
- Deneyin sonunda, Windows PC (XP/Vista/7) program için Macintosh OS X için FileScan110X (Intel) veya SystemMB108 kullanarak veri tarama.
Not: Tarama programı yinelenen okumaları ortadan kaldırır ve kayıtları tam olduğundan emin kılar. - Belirli bir zaman ve p içinde toplanan verileri kaydetmekgün yatış süresi. Deneysel bir isim seçin ve analizi için bilgisayar veri klasöründen dosyaları kopyalayın.
Not: Bu zamanda, etkinlik aralıkları değiştirilebilir ve farklı olanlar dönüştürülür. Orijinal veriler bilgisayar veri klasöründe saklanır kalacak ve sürece onlar silinmez olarak alınabilir.
8. Veri Analizi
- Veri analizi için Excel tabloları sütun içine metin dosyaları toplanan verileri kopyalayın. Bu yazılım tarafından toplanan veriler araştırmacı tarafından seçilen bir süre boyunca tek bir monitörde bulunan toplam faaliyeti temsil eden sayılar içeren sütunlar, vardır.
Not: Her bir monitör için toplanan veriler ayrı metin dosyaları bulunmaktadır. Her monitör için 32 sütun vardır. İlk altı sütunlar boş ve sadece 0 içerirler; Sonraki üç ortasında alt halka toplanan verileri içeren ve üst halkada. Herhangi bir veri içermeyen bu yana kanallarının kalanı silinebilir. Her halka bir çıktılarzaman başına tek bir değer. Şekil 2'de ham verilerin ekran görüntüsünü bakın. - Kızıl ötesi ışınları üç farklı yüksekliklerde toplanan aktivitesinin toplamını temsil eder, her monitör için istenen bir zaman süresi içinde, toplam aktivitesi hesaplayın.
Not: süre birkaç saat, 24 saat ya da birkaç gün arasında değişir. - Ortalama lokomotor aktivite ve 3 biyolojik çoğaltır temsil 3. monitörler arasındaki standart sapmayı belirleyin.
Not: Veri bir dizi test kullanılarak istatistiksel anlamlılık için analiz edilebilir. İki kuyruklu Öğrenci t-testi, varyans bir tek-yönlü analizi (ANOVA) ve Tukey HSD post-hoc testi spontan lokomotor aktivite 16 24 saat çeşitli çevresel veya genetik manipülasyon etkilerini belirlemek için kullanılan olabilir. Kullanılabilir ve daha önce 17 yayınlanmış diğer programlar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila spontan lokomotor aktivite sinek cinsiyet (Şekil 3A), gıda (Şekil 3B) kalori içeriği ve aydınlık / karanlık döngüsü bağlıdır. Işık kapatıldıktan sonra sinek aktivite önemli ölçüde azalır. Şekil 3A erkek ve dişi sinek lokomotor aktivite kayıtları 24 saat göstermektedir. X-ekseni üzerindeki yıldız ışığı kapatıldığı zaman işaretleri ve karanlık döngüsüne geçiş. Şekil 3B mısır gıda üzerine 3 gün yaş uçar Erkek için üç nüfus monitör toplanan ortalama spontan lokomotor aktivitesi arasındaki standart sapmayı göstermektedir. 24 saat boyunca spontan fiziksel aktivite için elde edilen veriler, aynı zamanda, bir 24 saatlik bir süre, Şekil 3C'de sırasında sinek başına toplam etkinliği olarak ifade edilebilir.
_upload/51449/51449fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51449/51449fig1.jpg "/>
Şekil 1:.. İki nüfus sinekler spontan lokomotor aktivitesinin izlenmesi için Nüfus monitör kurulumu A) Çeşitli nüfus monitörler 5-yönlü bölücülerin bir 4 telli telefon kablosu ile bağlı ve sıcaklık kontrollü inkübatör yerleştirilir B) Yüksek büyütme nüfus monitörler ve üç farklı yüksekliklerde yerleştirilmiş kızılötesi ışınları ile üç çalışta şişeleri yerleşim gösterir izler. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: öylesine tarafından üretilen ham veri ekran görüntüsüftware Tarih gösteren, Saat ve Yüzük 1, 2 toplanan verileri, ve 3. R Ring duruyor. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: erkek (Siyah) ve dişi A) Ortalama spontan lokomotor aktivite (Eflatun), standart laboratuvar diyeti 24 saat boyunca uçar. Verileri 10 dakika kutularına toplanmış ve her biri) erkek, standart laboratuvar diyeti 24 saat boyunca uçar Ortalama spontan lokomotor aktiviteyi 10 sinekleri. B içeren üç şişelere arasındaki ortalama aktivitesi olarak hesaplanır sinek başına ortalama aktivitesini temsil edilir. Verileri 10 dakika kutularına toplanır ve inci arasındaki ortalama aktivitesi olarak hesaplanır sinek başına ortalama aktivitesini temsil ederree gözlerdir. 20 gün eski erkek standart sapmaları yeşil işaretlenir. C) Toplam aktivitesi düşük kalorili uçar (0.5x) (Yeşil) ve yüksek kalorili (1.5x) (24 saatte Brown) yemek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sineklerin spontan lokomotor aktivite, yaş, genetik arka plan, cinsiyet ve 2,13,18,19 gibi pek çok faktör tarafından etkilenir. Buna ek olarak, gıda, ortamın sıcaklığı, farklı ilaçların eklenmesi ve gece / gündüz, ışık çevriminin kalori içeriği gibi çevresel faktörler sinek aktivitesini etkileyebilir. Örneğin, aynı yaştaki kadınlarda erkek sinekler (Şekil 1) ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir kendiliğinden fiziksel aktiviteye sahiptir. Bu nedenle, aynı yaş ve cinsiyet sinekler birbirine göre olmalıdır. Böyle aşırı ifadesinin veya belirli bir genin fonksiyon kaybı gibi sinek aktivite, genetik manipülasyon, etkisini incelerken, deney ve kontrol sinekler farklı genetik arka plan ya da ikinci sitesi nitelemeler olası etkilerini kaldırmak için aynı genetik arka planda olmalıdır. Bu, 1118 ya da 10 nesil için yw erkeklerde w deneysel dişi sinekler geri çaprazlanması ile elde edilebilir. 10 sonra,backcrossing nesiller, 1118 veya yw sinekler w genetik bir kontrol olarak kullanılabilir. Genetik özellikleri kontrol etmek için başka bir yol sağlar, indüklenebilir GAL4 GeneSwitch (GAL4-GS)-UAS ikili sistemi kullanmaktır fazla sentezlenmesi ya da sinekler bir zaman ve dokuya özel bir şekilde ilgi konusu genin aşağı doğru düzenlenmesi (RNAi) mifepriston ilavesi (RU486) 20,21 gıda ile beslenebilir. GAL4 dimerize ve UAS dizisine bağlamak için RU486 gereklidir. Genetik kontrol edilir kardeş sinekler EtOH ilave (RU486 seyreltici) ile gıda devam etti.
Çeşitli yöntemler Drosophila hareket kaydetmek için kullanılmıştır. Burada tarif edilen yöntem, basit, güvenilir, daha bilgilendirici ve bu gibi olumsuz geotaxis Drosophila hareket belirlemek için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla daha az önyargı potansiyeline sahiptir. Bu zaman içinde uzun bir süre için sinekler birden popülasyonlarının amacı, aynı anda kayıt avantajına sahiptirstandart kültür koşulları. Nüfus monitör kullanarak lokomotor aktivitesini ölçmek farklı yemek kalori içeriği sinek aktivitesini etkilemez veya CR 16 sinekler artmış aktivitesi altında yatan genetik mekanizmaları incelemek için nasıl eğitim için yararlı olabilir. Benzer şekilde, bu sistem, farklı genetik mutasyonlar, yaşlanma ya da sinek spontan fiziksel aktivite ile ilgili farklı ilaçların ilavesinin etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bireysel tüplerin yerine nüfus monitör kullanımı uyku davranışlarını analiz, ve diğerleri 17,22-24, in vivo sirkadiyen ritimleri okuyan, sineklerin farklı genotipleri H 2 O 2 direnç ölçüm sağlar.
Herhangi bir yöntem gibi, bu izleme sistemine sınırlamalar vardır. Uzun bir süre boyunca sinek izlerken, sinek ölüm için bir potansiyel, özellikle yaşlı sinekleri kullanarak, eğer var. Sadece sağlıklı sinekleri kullanarak bu önlemeye yardımcı olacaktır. Biz de başına en fazla 3 biyolojik çoğaltır kullanmayı deneyingrup sinekler eski ya ölüyor eğilimli iseniz. Bir çözüm sinekler ortama alıştıktan sonra sadece hareketlilik monitörler ve, 2. gün toplanan kullanımı verilerinin 2 gün sinekleri tutmaktır. Ölüm meydana gelirse biz hesaplamalarda flakon için toplanan verileri kullanmayın. Biz Trikinetics aktivite monitörleri sadece dikey konuma sahip olan küçük şişeler kullanılarak olsa da, yatay olarak şişe yerleştirmek için bir olasılık vardır. Biz gıda standart kuluçka kültür koşulları benzer şişenin alt kısmında, çünkü dikey şişe yerleştirmek için seçin. Bu sinekler yukarı ve şişelere aşağı yürümek için daha fazla alan sağlar ve negatif geotaxis deneyler daha benzer. Gıda kuruma bir sorun 24 olursa kuluçka nem de takip edilmelidir. Bu sistem, ortalama etkinlik açısından verileri sağlar ve etkinliğin doğası hakkında özel bilgi sağlamaz. İki sinekler, aynı zamanda kiriş arası Buna ek olarak, bu will sadece bir kesinti olarak kaydedilir. Burada açıklanan protokol toplam aktivitesinin ölçülmesi için yararlıdır, ancak uçuş yörüngesini veya hızı gibi daha kesin bilgi 12,14,25 isteniyorsa diğer protokolleri yararlı veriler sağlayabilir.
Bu deneyde takiben, genetik ya da çevresel manipülasyonlara spontan lokomotor aktiviteye farklılıklar bilinecektir. Bu protokolün bir gelecek modifikasyonu üst, orta ve nüfus monitörlerin alt halkalarından sineklerin aktivite farklı düzeylerde analiz olabilir. Bu sinek popülasyonları yakın gıda flakonun altına veya üst onların çoğu zaman harcamak belirleyecek. Mevcut haliyle protokol Drosophila deney ve kontrol popülasyonlarının spontan lokomotor aktivitesinin doğru, aynı anda ölçülmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (BR AG023088) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25 x 95 mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
References
- Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
- Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p, Cook-Wiends, E.
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
- Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
- Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
- Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
- Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
- Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
- Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
- Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
- Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
- Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
- Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, Cold Spring Harbor. (2010).
- Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
