Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحديد العفوي الحركي آخر في Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51449
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

Summary

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هي مفيدة في دراسة التلاعب الجيني أو البيئية التي تؤثر على السلوكيات مثل النشاط الحركي العفوي. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يستخدم شاشات الأشعة تحت الحمراء مع الحزم والبرامج وتحليل البيانات لقياس النشاط الحركي العفوي.

Abstract

وقد استخدمت ذبابة الفاكهة السوداء البطن كما كائن نموذجا ممتازا لدراسة التلاعب البيئية والوراثية التي تؤثر على السلوك. هو واحد مثل هذا السلوك النشاط الحركي العفوي. نحن هنا وصف بروتوكول لدينا التي تستخدم شاشات السكان ذبابة الفاكهة ونظام تعقب يسمح الرصد المستمر من النشاط الحركي العفوي من الذباب لعدة أيام في المرة الواحدة. هذه طريقة بسيطة وموثوق بها، وموضوعية، ويمكن استخدامها لدراسة آثار الشيخوخة، والجنس، والتغييرات في محتوى السعرات الحرارية من المواد الغذائية، بالإضافة المخدرات، أو التلاعب الجيني التي تحاكي الأمراض البشرية.

Introduction

ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد استخدمت بوصفها كائن نموذجا قيما لدراسة الآليات الكامنة وراء السلوكيات المعقدة مثل التعلم والذاكرة، والتفاعل الاجتماعي، والعدوان، وتعاطي المخدرات، والنوم، وظيفة حسية، والتودد، والتزاوج 1،2. واحدة السلوك التي تم دراستها من خلال بروتوكولات متعددة هو النشاط الحركي العفوي. كان انجذاب بالجاذبية السلبية إحدى الطرق الأولى وضعت لقياس النشاط ذبابة الفاكهة، ويتضمن هذا البروتوكول قياس نسبة الذباب التي تصل إلى ارتفاع معين من القارورة بعد أن اهتزت الذباب إلى الجزء السفلي من 1،3 الحاوية. هذا الأسلوب له مزايا كونها واضحة، وغير مكلفة، ونظرا لأنه لا يتطلب أي معدات خاصة أنه لا يمكن أن يؤديها في أي مختبر. وقد تم استخدامه كأداة فحص قيمة لدراسة آثار التلاعب الجيني مختلفة على ذبابة التنقل 3. ومع ذلك، فقد حان الوقت والعمل المكثف لالثاني لديه إمكانية التحيز بسبب اهتزاز متغير من قارورة والتسجيلات الإنسان.

تم تحسين طريقة انجذاب بالجاذبية السلبية عليها تطور سلبي انجذاب بالجاذبية (RING) طريقة تكرارية 4،5 السريع، والتي تأخذ صورا للقارورة ذبابة التالية تهتز من الذباب إلى أسفل. والاستفادة من هذا البروتوكول هو حساسيتها وإمكانية اختبار عدد كبير من قوارير ذبابة في نفس الوقت. ومع ذلك، لا يزال هذا البروتوكول لديه القدرة على الخطأ البشري، ويقيس فقط انجذاب بالجاذبية السلبية. وقد استخدمت غيرها من المختبرات ملاحظة بسيطة في قارورة الثقافة لتحديد النشاط الحركي 6.

في الآونة الأخيرة تم تطوير عدة أنظمة تسجيل الفيديو لقياس النشاط الحركي ذبابة. يوفر واحدة بروتوكول رصد الفيديو الوقت للتكيف قبل ان يسجل 7. الطريقة الموصوفة من قبل Slawson وآخرون. يستخدم أيضا نبض الهواء لوقف movemenر حتى بداية التسجيل، والتي من المحتمل أن تكون الضغوطات للحيوانات 7. وهذه الطريقة توفر معلومات عن معدل السرعة، السرعة القصوى، قضاء بعض الوقت في الحركة، الخ يقيس نظام تتبع ثلاثي الأبعاد آخر سرعة القصوى من الذباب الفردية خلال 0.2 ثانية ~ حرية اقلاعها طيران 8. يستخدم بروتوكول رصد الفيديو ثلاثي الأبعاد الذباب معربا عن GFP وعدة كاميرات مزودة مرشحات يسمح للكشف عن مضان لتحديد ذبابة التنقل 9. الذباب في هذا البروتوكول تميل الى عرض لأنماط طيران أسطواني، والتي من المحتمل أن يرجع ذلك إلى شكل قارورة الثقافة ذبابة الفاكهة 10. تم تحسين هذه الطريقة باستخدام القبة التي تسمح بقياس حركة عفوية من اثنين من الذباب 11. وثمة أسلوب الإنتاجية العالية الذي يستخدم الكاميرا لرصد تلقائيا وتحديد السلوك الفردي والاجتماعي من ذبابة الفاكهة كما وصفت 12. زو آخرونآل. وضعت نظام مراقبة السلوكية (BMS) الذي يستخدم اثنين من الكاميرات بمساعدة الحاسوب لتسجيل السلوك والحركات مثل عمر يستريح، والانتقال، وحلقت، والأكل والشرب، أو وفاة شخص والفاكهة tephritid يطير 13. وقد تم تطوير العديد من أنظمة الفيديو الأخرى لرصد نشاط ذبابة السلوكية 14،15.

نحن هنا تصف طريقة لقياس النشاط ذبابة الفاكهة التي تستخدم شاشات السكان. ويعيش هؤلاء المراقبين في درجة الحرارة والرطوبة الحاضنات التي تسيطر على 25 درجة مئوية في دورة 12 ساعة ضوء الليل والنهار. كل جهاز أشعة تحت الحمراء السكان وضعت في حلقات المتمركزة على ثلاثة ارتفاعات مختلفة. في كل مرة ذبابة تتحرك عبر حلقات أنه يقطع شعاع الأشعة تحت الحمراء، والتي يتم تسجيلها من قبل المعالج أن السجلات بشكل مستقل وبحساب النشاط من الذباب داخل القارورة. A المعالج بتحميل النشاط الكلي ضمن القارورة إلى الكمبيوتر في interva المعرفة من قبل المستخدمليرة سورية والتي قد تختلف من 1 في الثانية إلى 60 دقيقة. الطريقة الموصوفة هنا يوفر وقتا كافيا لذباب على التكيف مع البيئة الجديدة، ويسمح لقياس وقت واحد من النشاط الحركي العفوي ما يصل الى 120 من السكان الذباب. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف إعداد الطعام، ويطير الصيانة، ووضع المراقبين السكان التنقل في درجة الحرارة التي تسيطر عليها الحاضنات، والعوامل المحتملة التي قد تؤثر على النتائج. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة كيفية تأثير التغييرات البيئية أو الوراثية المختلفة النشاط الحركي العفوي من الذباب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: سلالة كانتون-S هو من النوع البري خط الخلفية القياسية التي تم الحصول عليها من مركز بلومينغتون الأسهم.

1. إعداد الطعام وصفة ل1،000 مل من الغذاء

ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكول لإعداد الطعام. وتستخدم الأواني المعدنية الكبيرة لإعداد حوالي 18 L من الطعام في وقت واحد. يتم تقليص بروتوكول الموصوفة هنا، ويستخدم 1،000 مل H 2 O. يتم تعقيمها الغذاء مرتين.

  1. مزج 113 غرام السكروز و 28 ز مخمرات الخميرة في 643 مل من الماء. ترك المكونات على لوحة مجموعة الساخن عند 25 درجة مئوية مع التحريك لمزج جميع أنحاء لمدة 15 دقيقة.
  2. الحل الغذاء الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة.
  3. مزيج دقيق الذرة 49 غرام و 8.1 غرام في 268 مل أجار الماء وإضافة إلى خليط الغذاء تعقيمها هو موضح في الخطوة 1.2. تخلط جيدا مع ملعقة كبيرة أو خفقت.
  4. الأوتوكلاف الخليط الطعام لمدة 20 دقيقة أخرى.
  5. وضع المواد الغذائية على لوحة والسماح يبرد مع الخلط المستمر مع بقضيب. أناو ينبغي أن يضاف حلول إضافية في الغذاء، مثل الميفيبريستون (RU486)، والحفاظ على الطعام على طبق ساخن التي أقيمت في 60 درجة مئوية وإضافة الحل عندما يكون الطعام تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة.
  6. حل 2.4 غرام tegosept في 10.7 مل 100٪ ETOH والحفاظ على طبق بارد مع النمام لتذوب تماما وتخلط لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة الحل tegosept في الغذاء عندما تكون درجة الحرارة من المواد الغذائية هو 60 درجة مئوية، وتخلط جيدا.
  8. استخدام مضخة أو موزع المواد الغذائية في صب حوالي 10 مل من المواد الغذائية إلى قارورة واسعة. باستخدام موزع الغذاء يمكن لأحد أن يصب الطعام في وقت واحد إلى 100، قارورة بلاستيكية واسعة (1 علبة) في وقت واحد.
  9. تغطية قارورة مع Kimwipes والقماش الجبن وترك الطعام في درجة حرارة الغرفة لمدة 12-24 ساعة حتى يبرد. الحفاظ على المواد الغذائية في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون 3-4 أسابيع. الاحماء الطعام إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام لعمل الطاير.

2. إعداد قوارير الزجاج

  1. إعداد الطعام وفقا لبروتوكول المذكورة في الخطوة 1. قسامة 5 مل من الطعام في كل ضيقة، قارورة الزجاج، والذي هو الحجم الصحيح للمراقبين السكان. يجب أن تكون هذه الكمية من الأغذية منخفضة بما يكفي لتكون دون أدنى حلقة من الشاشة السكان.
  2. بعد الطعام يبرد إلى درجة حرارة الغرفة تغطية قوارير مع المقابس الاسفنج والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. لأن كمية الطعام في قارورة منخفضة نوعا ما، فمن الأفضل لاستخدام الغذاء في غضون أسبوع أو اثنين لمنع أي التجفيف.
  3. الاحماء قارورة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

3. صيانة الذباب الأبوية

  1. تنمو الذباب في قوارير بلاستيكية واسعة مع الطعام المختبر القياسية والحفاظ على قارورة في، غرفة ترطيب البيئية التي تسيطر عليها درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية على 12 ساعة ضوء / دورة الظلام. يبدأ فترة النهار في الساعة 6:00 صباحا في هذا المختبر.
  2. في الصباح الذباب الكبار واضحا من قارورة من خلالها سيتم جمع الذباب الوالدين.
  3. جمع flie eclosed حديثاق وفصلها حسب نوع الجنس على وسادة CO 2 في غضون 8 ساعة بعد eclosion للتأكد من أن الذباب الإناث العذارى. بدء الذباب للتزاوج 8 ساعة بعد eclosion.
  4. عند الذكور والإناث الذباب عذراء ما بين 5 و 10 يوما من العمر، وضعت 10 ذكور و 10 إناث الذباب في قارورة مع الغذاء القياسية والعديد من الحبوب من الخميرة النشطة على القمة.
    ملاحظة: التحكم في كثافة اليرقات باستخدام نفس العدد من الذباب وابقائها في قارورة لمدة يومين. إضافة الخميرة النشطة يعزز إنتاج البيض.
  5. الحفاظ على الذباب للتزاوج ووضع البيض في غرفة التحكم في درجة حرارته البيئية عند 25 درجة مئوية مع 12 ساعة ضوء / دورة الظلام لمدة 2 ايام. انشاء 5-10 قارورة من الذباب الوالدين.
  6. تمرير الذباب إلى قارورة بلاستيكية جديدة كل يوم والحفاظ على قارورة مع البيض في حاضنة عند 25 درجة مئوية.

4. جمع الذباب التجريبية

  1. بعد 9 أيام الذباب سوف تبدأ في eclose من قوارير حيث parentaالذباب ل ضعت البيض (موضح في الخطوة 3.6). واضحة وتجاهل الذباب الذي eclosed خلال اليوم الأول والعودة إلى الحاضنة قارورة. معظم الذباب eclosed في يوم 1 من الإناث. وهناك المزيد من السكان متزامنة من الذباب eclose في يوم 2.
  2. في غضون 24 ساعة مكان الذباب eclosed حديثا على CO 2 منصات وجمع 25 من الذكور و 25 من الإناث الذباب في قارورة مع الفرشاة أو ملعقة معدنية. الحفاظ على الذباب CO 2 منصات لفترة قصيرة من الوقت للحد من أي آثار CO 2. أكتب اليوم من eclosion على القارورة. التجمع لا يقل عن 5 قنينات تكرار لالتجريبية والمجموعة الضابطة.
  3. الحفاظ على قارورة في غرف البيئية التي تسيطر عليها درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية مع 12 ساعة ضوء / دورة الظلام.
  4. تمرير الذباب إلى قارورة بلاستيكية جديدة كل يوم باستخدام القمع.
  5. العمر الذباب حتى يتم الوصول إلى سن المطلوب للتجريب.

5. إعداد شاشات التنقل

  1. وضعيراقب السكان في حاضنة التحكم في درجة حرارته.
  2. ربط كل جهاز مع كابل الهاتف 4 أسلاك إلى وحدة واجهة التيار الكهربائي (PSIU) عبر 5 في اتجاه شق (متعدد الخطوط)، والتي يمكن توصيل ما يصل إلى 5 مراقبين الفردية لافتتاح واحد في PSIU. أنظر الشكلين 1A 2B و.
  3. ربط PSIU إلى التيار الكهربائي خط (100-240 V). سد الموصل الانتاج امدادات الطاقة في واحدة من 2 التزاوج الرافعات PSIU. الضوء الأخضر المتاخمة تضيء باللون الأخضر عند توصيله بشكل صحيح.
  4. ربط PSIU إلى الناقل التسلسلي العالمي (USB) الأجهزة. قم بتوصيل كابل USB بين أجهزة USB مع ماكنتوش أو جهاز كمبيوتر ويندوز لتسجيل البيانات. سيكون من الأفضل أن يكون جهاز كمبيوتر مخصص فقط لجمع البيانات منذ جمع يمتد لأيام في كل مرة.
  5. تحميل برنامج USB (PSIUdrivers.zip). يستخدم برنامج تشغيل USB من قبل واجهة التيار الكهربائي ويحتاج ليتم تحميلها مرة واحدة فقط. فإنه يجمع لوصلة البيانات بين برنامج الكمبيوتر وشاشات PSIU / النشاط. لاستخدام الكمبيوتر منفذ COM وماكنتوش استخدام منفذ تسلسلي بسيط.
  6. تحميل برنامج كمبيوتر لماكنتوش OSX (إنتل) أو Windows PC (XP/Vista/7 و) برامج باتباع الإرشادات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة ملاحظات 308.pdf.
  7. بدء برنامج الكمبيوتر وإعداد البرنامج من خلال النقر على تفضيلات، أنوار أو شاشات. سيتم تشغيل البرنامج حتى يقوم المستخدم بتحديد "إنهاء" لوقف البرنامج. إذا تم إيقاف برنامج كمبيوتر أو جهاز الكمبيوتر أسفل ستواصل المراقبين إلى الاعتماد انقطاع شعاع، ولكن لن يتم تسجيل التهم حتى يتم إعادة إطلاق البرنامج. في هذه الحالة سوف تشمل القراءة الأولى كل التهم منذ آخر مرة أرسلت PSIU البيانات إلى الكمبيوتر.
  8. حدد علامة التبويب تفضيلات واختيار المنفذ التسلسلي، PSIU لماكنتوش وCOM لجهاز الكمبيوتر.
  9. حدد الفاصل القراءة التي تتراوح من ثوان، دقائق، أو ساعة.
    10. <لى> حدد المراقبين: كل جهاز لديه عدد الفريد الذي يعطى من قبل الشركة المصنعة. حدد نطاق مراقب الذي يتوافق مع الأرقام المعطاة للمراقبين من قبل الشركة المصنعة.
  10. مربع الأنوار: تأكد من أن كافة المراقبين ترتبط بشكل صحيح، والتي تميزت الضوء الأخضر بجانب عدد الشاشة على البرنامج. ضوء أحمر يشير إلى أن فقد الاتصال، ويشير إلى وجود الصندوق الأسود أن النظام هو خارج أو بشكل غير صحيح اقامة.

6. إعداد التجربة

  1. إزالة قارورة زجاجية تحتوي على المواد الغذائية من 4 درجة مئوية، والسماح لهم الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. الذباب الذكور والإناث منفصلة من نفس الفئة العمرية في CO 2 وسادة. للدراسات الشيخوخة أنه من الممكن لبدء الدراسات التنقل في أقرب وقت 3 أيام من العمر.
  3. وضع 10 من الذكور أو الإناث 10 الذباب في كل قارورة زجاجية تحتوي على المواد الغذائية. استخدام ثلاثة على الأقل قارورة لكل خط التجريبية والضابطة من الذباب ولكل الجنسين.
  4. الحفاظ على السادسالمرض الى جانبهم حتى استرداد الذباب من CO 2 لضمان الذباب لا تتعثر في الطعام. الذباب منفصلة فى حوالى الساعة 8:00 صباحا وتركها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة للتعافي من CO 2.
  5. ضع قارورة داخل مراقبين السكان يضم في حاضنات.
  6. تجاهل البيانات التي تم جمعها في ساعة الأولى بعد 24 يتم وضع الذباب في حاضنة للسماح لهم التكيف مع البيئة الجديدة.
  7. تمرير الذباب بعد 3 أو 4 أيام لقارورة جديدة لتجنب جفاف الطعام. إذا الذباب عرضة للموت أو هي سن 40 يوما أو أكثر، وتمرير الذباب 2 بعد أيام واستخدام البيانات التي تم جمعها ليوم 2. أيضا، استخدام أكثر من ثلاث قوارير لكل مجموعة لضمان مكررات كافية. يجب أن يتم تجاهله البيانات من قارورة مع الذباب الميت وغير المدرجة في التحليل.

7. تشغيل شاشات آخر واحتساب إجمالي النشاط العفوي

  1. حدد تفضيلات - الفاصل الزمني لجمع البيانات <.ر /> ملاحظة: يسمح برنامج كمبيوتر جمع البيانات على فترات تتراوح من 1 في الثانية إلى 60 دقيقة. تم العثور على فترات 10 و 30 دقيقة لتقديم معلومات وافية عن التنقل دون وجود عدد هائل من النقاط الزمنية. في الفترة الزمنية المحددة، سيقوم البرنامج بإرسال العدد الإجمالي الحالي للكل جهاز إلى جهاز الكمبيوتر والبدء بالعد مرة أخرى من الصفر. برنامج الكمبيوتر بتخزين البيانات في مجلد الجديدة التي تم إنشاؤها من قبل نظام بيانات الكمبيوتر. يتم تخزين البيانات التي تم جمعها في كل جهاز على حدة، ويتم إنشاء المستندات النصية الفردية لكل قنينة. البيانات يتم جمعها بشكل مستمر ما دام يعمل البرنامج.
  2. في نهاية التجربة، مسح البيانات باستخدام FileScan110X لماكنتوش OSX (إنتل) أو SystemMB108 لبرنامج Windows PC (XP/Vista/7 و).
    ملاحظة: برنامج المسح الضوئي يلغي قراءات مكررة ويتأكد أن التسجيلات كاملة.
  3. حفظ البيانات التي تم جمعها في غضون فترة زمنية محددة وعeriod أيام. اختيار اسم التجريبية ونسخ الملفات من مجلد بيانات الكمبيوتر لتحليلها.
    ملاحظة: في هذا الوقت، فترات النشاط يمكن تغييرها وتحويلها إلى مختلف منها. سوف البقاء على تخزين البيانات الأصلية في مجلد بيانات الكمبيوتر ويمكن استرجاعها طالما لم يتم حذفها.

8. تحليل البيانات

  1. نسخ البيانات التي تم جمعها في ملفات النص إلى أعمدة من جداول البيانات إكسل لتحليل البيانات. البيانات التي تم جمعها بواسطة هذا البرنامج هي في الأعمدة، والتي تحتوي على أرقام تمثل مجموع النشاط في جهاز واحد على مدى فترة زمنية محددة من قبل المحقق.
    ملاحظة: البيانات التي تم جمعها عن كل جهاز في ملفات نصية منفصلة. هناك 32 الأعمدة لكل جهاز. الأعمدة الستة الأولى فارغة وتحتوي فقط 0؛ يحتوي الثلاث المقبلة البيانات التي تم جمعها في حلقة القاع، في الوسط، وعلى الحلبة أعلى. بقية قنوات يمكن حذف لأنها لا تحتوي على أية بيانات. كل حلقة إخراجقيمة واحدة لكل مرة. انظر الشاشة النار من البيانات الخام في الشكل 2.
  2. حساب النشاط الإجمالي في غضون فترة من الوقت المطلوب لكل جهاز العرض الذي يمثل مجموع النشاط جمعها في ثلاثة مستويات مختلفة من الحزم الأشعة تحت الحمراء.
    ملاحظة: الفترة الزمنية يمكن أن تتراوح من عدة ساعات، 24 ساعة أو عدة أيام.
  3. تحديد متوسط ​​النشاط الحركي والانحراف المعياري بين 3 شاشات التي تمثل 3 مكررات البيولوجية.
    ملاحظة: يمكن تحليل البيانات إحصائيا باستخدام عدد من الاختبارات. اختبار t والطلاب ثنائي الطرف، وهو تحليل في اتجاه واحد من التباين (ANOVA)، واختبار توكي بعد مخصصة HSD يمكن أن تستخدم لتحديد الآثار البيئية للعديد من التلاعب أو وراثية في 24 ساعة من النشاط الحركي العفوي 16. هناك عدد من البرامج الأخرى التي يمكن استخدامها ونشرت سابقا 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النشاط الحركي العفوي في ذبابة الفاكهة يعتمد على ذبابة الجنسين (الشكل 3A)، والمحتوى من السعرات الحرارية من الطعام (الشكل 3B) وضوء / دورة الظلام. مرة واحدة يتم فيها تشغيل ضوء قبالة النشاط ذبابة يقلل بشكل كبير. يوضح الشكل 3A 24 ساعة من التسجيلات النشاط الحركي من الذباب الذكور والإناث. نجمية على محور س هي المرة عندما تم تشغيل ضوء قبالة والانتقال إلى دورة الظلام. يوضح الشكل 3B الانحراف المعياري بين متوسط ​​النشاط الحركي العفوي التي تم جمعها في ثلاثة مراقبين السكان للذكور الذباب سن 3 أيام على الذرة الغذاء. يمكن التعبير أيضا البيانات التي تم جمعها عن النشاط البدني عفوية خلال 24 ساعة كما في النشاط الكلي في الطيران خلال فترة 24 ساعة، الشكل 3C.

_upload/51449/51449fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51449/51449fig1.jpg "/>
الشكل 1:. السكان الإعداد رصد لرصد النشاط الحركي العفوي من الذباب A) وترتبط العديد من المراقبين السكان مع كابل الهاتف 4 أسلاك إلى 5 في اتجاه شق وضعت في حاضنة التحكم في درجة حرارته ب) التكبير العالي من اثنين من السكان وترصد، والتي تظهر وضع قارورة داخل مراقبين السكان وثلاث حلقات مع عوارض الأشعة تحت الحمراء المتمركزة على ثلاثة ارتفاعات مختلفة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2: لقطة الشاشة من البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة ذلكftware يظهر التاريخ والوقت والبيانات التي تم جمعها في خواتم 1، 2، و 3. R لتقف على الدائري. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
يطير A) متوسط ​​النشاط الحركي العفوي الذكور (أسود) والإناث (أرجواني) خلال 24 ساعة على نظام غذائي المختبر القياسية: الرقم 3. يتم جمع البيانات في 10 دقيقة وصناديق تمثل متوسط ​​النشاط في ذبابة يحسب كمتوسط ​​النشاط بين ثلاثة قارورة تحتوي كل منها على 10 الذباب. B) متوسط ​​النشاط الحركي العفوي من الذكور الذباب خلال 24 ساعة على نظام غذائي المختبرية القياسية. يتم جمع البيانات في 10 دقيقة وصناديق تمثل متوسط ​​النشاط في ذبابة يحسب كمتوسط ​​النشاط بين القارورة ري. وتتميز الانحرافات المعيارية باللون الأخضر. C) إجمالي النشاط من الذكور 20 يوما القديمة الذباب على منخفض السعرات الحرارية (0.5X) (الأخضر) وذات السعرات الحرارية العالية (1.5X) (براون) المواد الغذائية أكثر من 24 ساعة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتأثر النشاط الحركي العفوي من الذباب من قبل العديد من العوامل مثل العمر والخلفية الوراثية، والمساواة بين الجنسين 2،13،18،19. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن العوامل البيئية مثل المحتوى من السعرات الحرارية من المواد الغذائية، درجة حرارة البيئة، بالإضافة إلى ذلك من الأدوية المختلفة، ودورة ضوء النهار / الليل تؤثر على نشاط الطاير. على سبيل المثال، الذباب الذكور من نفس الفئة العمرية لديها النشاط البدني العالي عفوية مقارنة بالإناث (الشكل 1). لذلك، ينبغي مقارنة الذباب من نفس العمر والجنس مع بعضهم البعض. عند دراسة تأثير التلاعب الجيني في ذبابة النشاط، مثل من overexpression أو فقدان وظيفة جين معين، يجب أن يكون الذباب التجريبية والضابطة في نفس الخلفية الوراثية لإزالة أي آثار محتملة من خلفية وراثية أو الموقع الثاني المعدلات المختلفة. ويمكن تحقيق هذا عن طريق الذباب الإناث backcrossing التجريبية لث 1118 أو اذا ستشغل الذكور لمدة 10 أجيال. بعد 10أجيال من backcrossing، ث 1118 أو الذباب اذا ستشغل يمكن استخدامها كعنصر تحكم الوراثية. طريقة أخرى للسيطرة على الخلفية الوراثية هي استخدام GAL4 GeneSwitch محرض (GAL4-GS) UAS النظام الثنائي، والذي يسمح من overexpression أو أسفل تنظيم (رني) من هذا الجين من الفائدة في وقت واحد وبطريقة الأنسجة محددة في الذباب تغذية الغذاء مع إضافة الميفيبريستون (RU486) 20،21. RU486 ضروري لGAL4 لdimerize وربط تسلسل UAS. أبقى الذباب الضوابط الوراثية والأخوة على الغذاء مع إضافة ETOH (RU486 مخفف).

وقد استخدمت أساليب مختلفة لتسجيل ذبابة الفاكهة التنقل. الطريقة الموضحة هنا هي بسيطة وموثوق بها، وأكثر بالمعلومات، وإمكانات أقل من التحيز بالمقارنة مع الطرق الأخرى المستخدمة لتحديد ذبابة الفاكهة التنقل، مثل انجذاب بالجاذبية السلبية. فمن لديه ميزة الهدف في وقت واحد تسجيل السكان متعددة من الذباب لفترة طويلة من الزمن فيشروط الثقافة القياسية. يمكن قياس النشاط الحركي باستخدام شاشات السكان أن تكون مفيدة لدراسة كيفية محتويات السعرات الحرارية مختلفة من الطعام قد يؤثر على نشاط ذبابة أو لدراسة الآليات الوراثية الكامنة وراء زيادة النشاط من الذباب على CR 16. وبالمثل، تم استخدام هذا النظام لدراسة آثار الطفرات الجينية المختلفة، والشيخوخة، أو إضافة أدوية مختلفة على ذبابة النشاط البدني عفوية. استخدام أنابيب الفردية بدلا من شاشات السكان يسمح قياس H 2 O 2 المقاومة في المورثات مختلفة من الذباب، ودراسة ايقاعات كل يوم في الجسم الحي، وتحليل سلوك النوم، وغيرها 17،22-24.

مثل أي وسيلة، وهناك قيود على هذا النظام مراقبة. عند رصد الذباب لفترة طويلة من الزمن، وهناك احتمال موت ذبابة، وخاصة إذا باستخدام الذباب العمر. وسوف تستخدم فقط الذباب صحية تساعد على منع هذا. نحن أيضا محاولة استخدام أكثر من 3 مكررات البيولوجية فيالمجموعة إذا الذباب لكبار السن أو عرضة للموت. حل واحد هو الحفاظ على الذباب فقط لمدة 2 أيام في شاشات التنقل واستخدام البيانات التي تم جمعها خلال اليوم 2، بعد عدلت الذباب على البيئة. إذا تحدث الوفاة لا نستخدم البيانات التي تم جمعها عن القارورة في العمليات الحسابية. على الرغم من أننا قد تستخدم القنينات وضعه عموديا فقط في شاشات النشاط Trikinetics، هناك إمكانية لوضع قارورة أفقيا. نختار لوضع قارورة عموديا لأن الطعام في الجزء السفلي من القارورة، والتي هي مماثلة لظروف ثقافة حاضنة القياسية. وهذا يسمح الذباب لديك مساحة أكبر على المشي صعودا وهبوطا في قارورة، وأنه هو أكثر مماثلة لانجذاب بالجاذبية التجارب السلبية. كما ينبغي مراقبة نسبة الرطوبة في الحاضنة إذا أصبح تجفيف الغذاء مشكلة 24. ويوفر هذا النظام بيانات من حيث متوسط ​​النشاط، ولا يقدم تفاصيل محددة حول طبيعة هذا النشاط. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان اثنان الذباب عبور شعاع في نفس الوقت، فإنه وايليرة لبنانية فقط يتم تسجيلها كما توقف واحد. بروتوكول الموصوفة هنا هو مفيد لقياس النشاط الكلي، ولكن يمكن أن البروتوكولات الأخرى توفير بيانات مفيدة إذا كانت المعلومات أكثر دقة مثل مسار الرحلة أو سرعة والمطلوب 12،14،25.

بعد هذه التجربة، سوف تكون معروفة الاختلافات في النشاط الحركي العفوي بسبب التلاعب وراثية أو بيئية. وهناك تعديل في المستقبل من هذا البروتوكول يمكن أن يكون لتحليل مستويات مختلفة من النشاط من الذباب في الجزء العلوي، والمتوسطة، وحلقات الجزء السفلي من المراقبين السكان. وهذا من شأنه تحديد ما إذا كان السكان ذبابة يقضون معظم وقتهم في الجزء السفلي من القارورة بالقرب من الطعام أو في الجزء العلوي. بروتوكول بشكله الحالي يسمح للدقيقة، الكمي في وقت واحد من النشاط الحركي العفوي من ذبابة الفاكهة السكان التجريبية والضابطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (AG023088 إلى BR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25 x 95 mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
Name Company Catalog Number Comments
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
  2. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
  3. Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p, Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  5. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
  6. Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
  7. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
  8. Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
  9. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
  10. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
  11. Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
  12. Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  13. Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
  14. Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
  15. Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
  16. Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
  17. Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
  18. Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
  19. Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
  20. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
  21. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  22. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
  23. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
  24. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, Cold Spring Harbor. (2010).
  25. Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 86، تقنيات التحقيق، العلوم الحياتية (العامة)، العلوم السلوكية،
تحديد العفوي الحركي آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina,… More

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter