Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51449
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

Summary

Drosophila melanogaster zijn nuttig bij het ​​bestuderen van genetische of ecologische manipulaties die gedrag zoals spontane motorische activiteit beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol dat monitoren met infrarood stralen en data analyse software om spontane bewegingsactiviteit kwantificeren gebruikt.

Abstract

Drosophila melanogaster is gebruikt als een uitstekend modelorganisme milieu en genetische manipulaties die beïnvloedende bestuderen. Een dergelijk gedrag is spontaan bewegingsactiviteit. Hier beschrijven we ons protocol dat Drosophila bevolking monitoren en een tracking systeem dat continue monitoring van de spontane bewegingsactiviteit van vliegen zorgt voor meerdere dagen tegelijk gebruikt. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar en objectieve kunnen worden gebruikt om de effecten van veroudering, geslacht, veranderingen in calorische voedsel toevoeging van drugs, of genetische manipulaties die menselijke ziekten nabootsen onderzoeken.

Introduction

Fruitvliegen, Drosophila melanogaster, zijn gebruikt als een waardevol model organisme om onderliggende mechanismen van complexe gedragingen, zoals leren en geheugen, sociale interactie, agressie, druggebruik, slaap, sensorische functies, verkering, en paring 1,2 bestuderen. Een gedrag dat is onderzocht door middel van meerdere protocollen is spontane bewegingsactiviteit. Negatieve geotaxis was een van de eerste methoden ontwikkeld voor het meten Drosophila activiteit en dit protocol omvat het meten van het percentage van vliegen die een bepaalde hoogte van de flacon bereiken na vliegen werden geschud om de bodem van de houder 1,3. Deze methode heeft voordelen dat ze eenvoudig, goedkoop, en omdat het geen speciale apparatuur kan in elk laboratorium worden verricht. Het is gebruikt als een waardevolle screening instrument om de effecten van verschillende genetische manipulaties op vlieg mobiliteit 3 bestuderen. Het is echter tijd en arbeidsintensief eennd de mogelijkheid van vertekening door variabele schudden van de flesjes en menselijke opnamen.

De negatieve geotaxis methode werd verbeterd door de ontwikkeling van de negatieve methode Rapid Iterative geotaxis (RING) 4,5, die foto's van de vlieg flesjes na het schudden van de vliegen naar de bodem neemt. Het voordeel van dit protocol is de gevoeligheid en de mogelijkheid van het testen van een groot aantal vliegen flacons tegelijkertijd. Echter, dit protocol heeft nog steeds het potentieel voor menselijke fouten, en alleen meet negatieve geotaxis. Andere laboratoria hebben eenvoudige observatie gebruikt in cultuur flesjes om bewegingsactiviteit 6 bepalen.

Recent zijn ontwikkeld verschillende video-opname systemen voor het meten van fly bewegingsactiviteit. Een video-monitoring protocol voorziet tijd voor aanpassing voor de opname 7. De methode beschreven door Slawson et al.. Maakt ook gebruik van een lucht-puls naar movemen stoppent tot de start van de opname, die mogelijk een stressor de dieren 7 zijn. Deze methode geeft informatie over gemiddelde snelheid, maximum snelheid, tijd doorbrengen in beweging, enz. Een andere driedimensionale tracking systeem meet de maximale snelheid van individuele vliegen tijdens ~ 0.2 seconden van de vrije vlucht opstijgen 8. Een drie-dimensionale videobewaking protocol gebruikt vliegen die GFP en meerdere camera's uitgerust met filters waardoor detectie van fluorescentie te vliegen mobiliteit 9 bepalen. Vliegen in dit protocol meestal cilindrisch vluchtpatronen, die potentieel vertonen door de vorm van Drosophila cultuur flacons 10. Deze werkwijze werd verbeterd door een koepel, waardoor metingen spontane beweging van twee vliegen 11. Een high-throughput werkwijze die een camera gebruikt om automatisch volgen en kwantificeren individuele en sociale gedrag van Drosophila is ook beschreven 12. Zou etal.. ontwikkelde een gedrags-monitor systeem (BMS) dat twee computerondersteunde camera's gebruikt om de levensduur gedrag en bewegingen zoals rust nemen, bewegen, vliegen, eten, drinken, of dood van individuele Tephritid fruitvliegen 13. Verscheidene andere video systemen zijn ontwikkeld om fly gedragsactiviteit 14,15 bewaken.

Hier beschrijven we een methode voor het kwantificeren van Drosophila activiteit die bevolking monitoren gebruikt. Deze monitors zijn gehuisvest in temperatuur en vochtigheid gecontroleerde incubator bij 25 ° C op een 12 uur dag-nacht lichtcyclus. Elke populatie monitor heeft infraroodstralen geplaatst in ringen zich op drie verschillende hoogtes. Telkens een vlieg beweegt over de ringen onderbreekt de infraroodstraal die wordt geregistreerd door een microprocessor die onafhankelijk platen en telt de activiteit van vliegen in de flacon. Een microprocessor uploadt de totale activiteit in de flacon om de computer op door de gebruiker gedefinieerde intervaIs dat kan variëren van 1 seconde tot 60 minuten. De hier beschreven methode biedt voldoende tijd voor vliegen te passen aan de nieuwe omgeving en toelaten om gelijktijdig meten van de spontane bewegingsactiviteit van wel 120 populaties vliegen. Daarnaast beschrijven we de bereiding van het eten, vliegen onderhoud, het opzetten van de mobiliteit van de bevolking monitoren in temperatuur gecontroleerde incubators, en mogelijke factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden. Deze methode kan worden gebruikt om te bestuderen hoe verschillende modificaties milieu of genetische invloed spontane locomotorische activiteit van de vliegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het kanton-S stam is de standaard wild-type achtergrond lijn verkregen uit de Bloomington Stock Center.

1. Voedselbereiding en Recept voor 1000 ml of Food

Opmerking: Dit hoofdstuk beschrijft het protocol voor voedselbereiding. Grote metalen potten worden gebruikt voor de bereiding ongeveer 18 L voedsel tegelijk. De hier beschreven protocol wordt verkleind en gebruikt 1000 ml H2O Voedsel tweemaal geautoclaveerd.

  1. Meng 113 g sucrose en 28 g gist in 643 ml water. Verlaat ingrediënten op een hete plaat ingesteld op 25 ° C met een roerstaafje te mengen gedurende 15 minuten.
  2. Autoclaaf voedsel oplossing gedurende 20 minuten.
  3. Meng 49 g maïsmeel en 8,1 g agar in 268 ml water en voeg toe aan de geautoclaveerde voedsel mengsel in punt 1.2 beschreven. Meng goed met een grote lepel of een garde.
  4. Autoclaaf voedsel mengsel nog eens 20 minuten.
  5. Zet het gerecht op een bord en laat afkoelen met constante menging met een roerstaafje. Ikf aanvullende oplossingen moeten worden toegevoegd aan levensmiddelen, zoals mifepriston (RU486), houdt het eten op een hete plaat ingesteld op 60 ° C en voeg oplossing wanneer het voedsel de gewenste temperatuur bereikt.
  6. Los op 2,4 g tegosept in 10,7 ml 100% EtOH en houden op een koude plaat met een roerder om volledig op te lossen en meng gedurende ongeveer 15 minuten.
  7. Voeg tegosept oplossing voedsel wanneer de temperatuur van het voedsel is 60 ° C en meng.
  8. Gebruik een pomp of een snackautomaat te gieten ongeveer 10 ml van voedsel in een grote flacon. Door een voedseldispenser kan eten gelijktijdig gieten in 100 breed, kunststof flesjes (1 tray) tegelijkertijd.
  9. Bedek de flesjes met Kimwipes en kaasdoek en laat voedsel bij kamertemperatuur gedurende 12-24 uur afkoelen. Houd het voedsel bij 4 ° C en binnen 3-4 weken. Warm het voedsel tot kamertemperatuur vóór gebruik voor vlieg werk.

2. Voorbereiding van de glazen flesjes

  1. Bereid voedsel volgens het protocol in stap 1 genoemde. Aliquot 5 ml van voedsel in elke smalle, glazen flesje, dat is de juiste maat voor de bevolking te monitoren. Deze hoeveelheid voedsel moet laag genoeg om onder de laagste ring van de bevolking monitor.
  2. Na het eten afkoelt tot kamertemperatuur bedekken de vaatjes met spons pluggen en houden bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. Omdat de hoeveelheid voedsel in een flacon is vrij laag, is het het beste om het voedsel te gebruiken binnen een week of twee aan een uitdroging te voorkomen.
  3. Warm de injectieflacons op kamertemperatuur voor gebruik.

3. Onderhoud van de Parental Flies

  1. Groeien de vliegen in grote plastic flesjes met standaard laboratorium voedsel en houden de flesjes in een vochtige, temperatuur-gecontroleerde klimaatkamer bij 25 ° C op een 12 uur licht / donker-cyclus. De daglicht periode begint om 06:00 in dit laboratorium.
  2. In de ochtend vliegt duidelijk volwassen uit de flesjes van het ouderschapsverlof vliegen zullen worden verzameld.
  3. Verzamel nieuw eclosed flies in en scheid ze door het geslacht op een CO 2 pad binnen 8 uur na verpopping om ervoor te zorgen dat de vrouwelijke vliegen zijn maagden. Vliegen beginnen 8 uur na verpopping paren.
  4. Toen de maagd mannelijke en vrouwelijke vliegen zijn tussen de 5 en 10 dagen oud, zet 10 mannetjes en 10 vrouwtjes in een flacon met standaard eten en enkele korrels van actieve gist bovenop.
    Opmerking: Regel de dichtheid van de larven met hetzelfde aantal vliegen en te houden in een flacon twee dagen. Toevoeging van actieve gist bevordert eiproductie.
  5. Houd de vliegen om te paren en eieren leggen in een temperatuur-gecontroleerde klimaatkamer bij 25 ° C met een 12 uur licht / donker cyclus voor 2 dagen. Opgezet 5-10 flesjes ouderlijke vliegen.
  6. Passeer de vliegen in nieuw plastic flacon om de andere dag en houden de vaatjes met de eieren in een incubator bij 25 ° C.

4. Collectie Experimentele Flies

  1. Na 9 dagen vliegen begint te ESluit de flacons waar Parental vliegen eieren gelegd (beschreven in stap 3.6.). Duidelijke en gooi de vliegen die eclosed tijdens de eerste dag en de terugkeer van de flesjes te incubator. Het merendeel van de vliegen eclosed op dag 1 zijn vrouwtjes. Een gesynchroniseerde bevolking van vliegen zal ESluit op dag 2.
  2. Binnen 24 uur plaats nieuw eclosed vliegen op de CO 2-pads en verzamel 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen per flacons met een penseel of een metalen lepel. Blijf vliegen op de CO 2-pads voor een korte periode van tijd om eventuele effecten van CO 2 te beperken. Noteer de dag van eclosion op de flacon. Monteer ten minste 5 repliceren flacons voor experimentele en de controle groepen.
  3. De injectieflacons in temperatuurgecontroleerde klimaatkamers bij 25 ° C met een 12 uur licht / donker-cyclus.
  4. Passeren de vliegen naar een nieuwe plastic flacon om de andere dag met behulp van een trechter.
  5. De leeftijd van de vliegen tot de gewenste leeftijd voor experimenten is bereikt.

5. Instellen van de Mobiliteit Monitoren

  1. Plaats debevolking bewaakt in een temperatuur gecontroleerde incubator.
  2. Sluit elke monitor met een 4-aderige telefoonkabel aan op de Power Supply Interface Unit (PSIU) via 5-weg splitters (meerdere lijnen), die kunt maximaal 5 individuele monitoren om een opening in de PSIU. Zie de figuren 1A en 2B.
  3. Sluit de PSIU om een ​​lijn stopcontact (100-240 V). Steek de voeding uitgang connector in een van de 2 paring PSIU jacks. De aangrenzende groen licht groen als goed aangesloten.
  4. Sluit de PSIU naar de Universal Serial Bus (USB)-hardware. Sluit de USB-kabel aan tussen de USB-hardware met een Macintosh of een Windows-pc voor gegevensregistratie. Het beste zou zijn om een ​​computer die uitsluitend voor het verzamelen van gegevens zijn sindsdien collectie loopt dagen per keer.
  5. Download de USB-software (PSIUdrivers.zip). USB driver software wordt gebruikt door de voeding interface en moet slechts een keer worden gedownload. Synthetiseert eendataverbinding tussen het computerprogramma en de PSIU / activiteit monitoren. Voor een pc gebruik van een COM-poort en voor een Macintosh gebruiken een eenvoudige seriële poort.
  6. Download het computerprogramma voor Macintosh OSX (Intel) of voor Windows PC (XP/Vista/7) programma's door de instructies die door de fabrikant Notes 308.pdf.
  7. Start de computer programma en het opzetten van het programma door te klikken op de Voorkeuren, Lights of monitoren. Het programma loopt tot de gebruiker selecteert "quit" om het programma te stoppen. Als de computer programma of de computer is uitgeschakeld de monitoren zal blijven straal onderbrekingen tellen, maar de tellingen zullen niet worden opgenomen totdat het programma wordt opnieuw gelanceerd. In dat geval zal de eerste lezing omvatten alle tellingen sinds de laatste keer dat de PSIU stuurde de gegevens op een computer.
  8. Selecteer het tabblad Voorkeuren en kies de seriële poort, PSIU voor Macintosh en COM voor de PC.
  9. Selecteer het lezen interval dat varieert van seconden, minuten of een uur.
    10. <li> Selecteer de monitoren: Elke monitor heeft een uniek nummer, dat wordt gegeven door de fabrikant. Selecteer de monitor bereik dat overeenkomt met de nummers aan de monitoren van de fabrikant.
  10. The Lights doos: Zorg ervoor dat alle monitoren correct zijn aangesloten, die wordt gekenmerkt door een groen lampje naast de monitor nummer op de software. Een rood lampje geeft aan dat de verbinding verbroken wordt, en een zwart vakje geeft aan dat het systeem is uitgeschakeld of onjuiste plaatsing.

6. Instellen van de Experiment

  1. Verwijder de glazen flacons met voedsel van 4 ° C en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur.
  2. Aparte mannelijke en vrouwelijke vliegen van dezelfde leeftijd op de CO 2-pad. Voor veroudering studies is het mogelijk om mobiliteitsstudies zo vroeg als 3 dagen oud.
  3. Zet 10 man of 10 vrouwtjes in elk glas flacon met voedsel. Gebruik ten minste drie flesjes voor alle behandelde en controle lijn van vliegen en voor elk geslacht.
  4. Houd de viALS aan hun kant totdat de vliegen te herstellen van CO 2 naar de vliegen zorgen niet vast komen te zitten in het voedsel. Afzonderlijke vliegen rond 08:00 en laat ze gedurende 2 uur bij kamertemperatuur te herstellen van CO2.
  5. Plaats de vaatjes in de bevolking monitoren gehuisvest in de incubators.
  6. Gooi de binnen de eerste 24 uur verzamelde gegevens na de vliegen in de incubator gezet te laten aanpassen aan de nieuwe omgeving.
  7. Passeer de vliegen na 3 of 4 dagen nieuwe flesjes om uitdroging van het voedsel. Als vliegen zijn gevoelig voor de dood of zijn leeftijd van 40 dagen of ouder, passeren de vliegen na 2 dagen en het gebruik van gegevens verzameld voor dag 2. Gebruik ook meer dan drie flesjes per groep voldoende herhalingen te garanderen. Moet worden genegeerd gegevens van flacons met dode vliegen en niet opgenomen in de analyse.

7. Het uitvoeren van de activiteit monitoren en berekening van de totale spontane activiteit

  1. Selecteer voorkeuren - het interval voor het verzamelen van gegevens <.br /> Opmerking: De computer programma kunt verzamelen van de gegevens met tussenpozen van 1 seconde tot 60 minuten. 10 en 30 minuten perioden zijn gevonden om goede informatie over mobiliteit te bieden, zonder dat een overweldigend aantal tijdstippen. Op de geselecteerde periode, zal het programma de huidige totale telling voor elke monitor naar de computer en opnieuw te beginnen tellen van nul. De computer programma slaat de gegevens op in een nieuwe map gecreëerd door de computer datasysteem. De in elke monitor verzamelde gegevens worden apart opgeslagen, en individuele tekstdocumenten zijn gemaakt voor elke flacon. De gegevens worden continu zolang het programma werkt verzameld.
  2. Aan het einde van het experiment, scan de gegevens met behulp van de FileScan110X voor Macintosh OSX (Intel) of SystemMB108 voor Windows PC-programma (XP/Vista/7).
    Opmerking: De Scan programma elimineert dubbele lezingen en zorgt ervoor dat de opnames zijn voltooid.
  3. Sla het binnen een bepaalde tijd en p verzamelde gegevenseriod dagen. Kies een experimentele naam en kopieer de bestanden van de computer map data voor analyse.
    NB: Op dit moment kan de activiteit intervallen worden veranderd en omgezet in verschillende. De oorspronkelijke gegevens blijven opgeslagen in de computer gegevens en kan zolang ze niet verwijderd worden opgehaald.

8. Data Analysis

  1. Kopieer de in de tekstbestanden verzamelde gegevens in kolommen van Excel-spreadsheets voor data-analyse. Gegevens door deze software verzameld zijn in de kolommen, welke nummers ofwel een totale activiteit in een enkele monitor over een periode van tijd door de onderzoeker geselecteerde bevatten.
    Opmerking: Gegevens verzameld voor elke monitor zijn in aparte tekstbestanden. Er zijn 32 kolommen voor elke monitor. De eerste zes kolommen leeg en moet bestaan ​​uit 0; drie volgende bevatten verzameld op de onderste ring gegevens, in het midden en aan de bovenste ring. De rest van de kanalen kan worden verwijderd omdat ze geen gegevens bevatten. Elke ring voert eenenkele waarde per keer. Zie screenshot van de ruwe gegevens in figuur 2.
  2. Bereken de totale activiteit binnen een gewenste tijdsperiode voor elke monitor die de som van de activiteit verzameld op drie verschillende hoogtes van infraroodstralen vertegenwoordigt.
    Opmerking: De periode kan variëren van een paar uur, 24 uur of meerdere dagen.
  3. Bepaal de gemiddelde bewegingsactiviteit en de standaardafwijking tussen de 3 monitoren die 3 biologische herhalingen vertegenwoordigen.
    Opmerking: De gegevens kunnen worden geanalyseerd op statistische significantie door een aantal tests. Een tweezijdige Students t-test, een variantieanalyse (ANOVA) en Tukey HSD post hoc test kan worden gebruikt om de effecten van verschillende milieu-of genetische manipulaties op 24 uur spontane locomotorische activiteit 16 bepalen. Er zijn een aantal andere programma's die kunnen worden gebruikt en zijn eerder gepubliceerd 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De spontane bewegingsactiviteit in Drosophila hangt af fly geslacht (figuur 3A), calorie-inhoud van het voedsel (Figuur 3B) en de licht / donker-cyclus. Zodra het licht wordt uitgeschakeld fly activiteit drastisch afneemt. Figuur 3A toont 24 uur van bewegingsactiviteit opnames van mannelijke en vrouwelijke vliegen. Een sterretje op de x-as geeft de tijd dat het licht werd uitgeschakeld en de overgang naar donker cyclus. Figuur 3B illustreert de standaardafwijking tussen de gemiddelde spontane locomotorische activiteit in drie populatie monitoren verzameld mannelijke vliegen vanaf 3 dagen op graan. De gegevens die voor de spontane fysieke activiteit tijdens de 24 uren gegevens kunnen ook worden uitgedrukt als de totale activiteit per fly gedurende een periode van 24 uur, figuur 3C.

_upload/51449/51449fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51449/51449fig1.jpg "/>
Figuur 1:.. Bevolking monitor opstelling voor de monitoring van spontane bewegingsactiviteit van vliegen A) Verscheidene bevolking monitoren worden aangesloten met een 4-aderige telefoonkabel aan 5-weg splitters en geplaatst in een temperatuur-gecontroleerde incubator B) Hogere vergroting van twee bevolking monitoren, die de plaatsing van de flesjes binnen de populatie monitors en drie ringen met infrarood stralen zich op drie verschillende hoogtes laten zien. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2: Scherm schot van de ruwe data gegenereerd door de zogenaamdeftware tonen Datum, tijd en data in ringen 1, 2 verzameld, en 3. R staat voor de Ring. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3: A) Gemiddeld spontane locomotorische activiteit van mannen (zwart) en vrouwelijke (magenta) vliegen gedurende 24 uur op standaard laboratorium dieet. De gegevens worden verzameld in 10 minuten bakken en vertegenwoordigen gemiddelde activiteit per fly berekend als gemiddelde activiteit tussen drie injectieflacons met 10 vliegen. B) Gemiddeld spontane bewegingsactiviteit van mannelijke vliegt gedurende 24 uur op een standaard laboratorium dieet. De gegevens worden verzameld in 10 minuten bakken en vertegenwoordigen gemiddelde activiteit per fly berekend als gemiddelde activiteit tussen three flesjes. Standaarddeviaties zijn groen gemarkeerd. C) Totale activiteit van 20 dagen oude mannelijke vliegt op caloriearme (0.5X) (Groen) en hoogcalorische (1.5X) (Bruin) voedsel over 24 uur. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spontane bewegingsactiviteit van vliegen wordt beïnvloed door vele factoren, zoals leeftijd, genetische achtergrond, 2,13,18,19 en geslacht. Daarnaast kunnen omgevingsfactoren zoals calorie-inhoud van het voedsel, de temperatuur van de omgeving, toevoeging van verschillende drugs, en dag / nacht licht cyclus fly activiteit beïnvloeden. Zo mannelijke vliegen van dezelfde leeftijd een hogere spontane fysieke activiteit dan bij vrouwen (figuur 1). Daarom moet vliegen van dezelfde leeftijd en geslacht worden met elkaar vergeleken. Bij het onderzoek van het effect van genetische manipulaties op vlieg activiteit, zoals overexpressie of verlies van functie van een bepaald gen, moeten de experimentele en controle vliegen in dezelfde genetische achtergrond om mogelijke effecten van verschillende genetische achtergrond of tweede locatie modifiers verwijderen. Dit kan worden bereikt door terugkruisen experimentele vrouwelijke vliegt naar w 1118 of yw mannetjes gedurende 10 generaties. Na 10generaties terugkruising, w 1118 of yw vliegt kan worden gebruikt als genetische controle. Een andere manier om te controleren voor de genetische achtergrond is de induceerbare GAL4 GeneSwitch (GAL4-GS)-UAS binaire systeem, waardoor gebruik overexpressie of neerwaartse regulatie (RNAi) van het gen van belang in een tijd-en weefselspecifieke wijze vliegen gevoed voedsel met de toevoeging van mifepriston (RU486) 20,21. RU486 is nodig GAL4 dimeriseren en binden aan de UAS sequentie. Genetische controles zijn broers en zussen vliegen bleef eten met de toevoeging van EtOH (RU486 verdunner).

Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om Drosophila mobiliteit nemen. De hier beschreven methode is eenvoudig, betrouwbaar, informatiever en minder potentieel bias vergeleken met andere methoden voor Drosophila mobiliteit te bepalen, zoals negatieve geotaxis. Het voordeel van objectieve gelijktijdige opname van meerdere populaties vliegen gedurende een lange periode instandaard kweekomstandigheden. Het meten van de bewegingsactiviteit met behulp bevolking monitors kan nuttig zijn om te bestuderen hoe verschillende inhoud calorie van het voedsel beïnvloeden fly activiteit of om genetische mechanismen ten grondslag liggen aan een verhoogde activiteit van het vliegen op CR 16 te bestuderen. Ook is dit systeem gebruikt om de effecten van verschillende genetische mutaties, veroudering, of de toevoeging van verschillende geneesmiddelen op vlieg spontane fysieke activiteit te bestuderen. Gebruik van individuele buizen in plaats van de bevolking monitoren maakt het meten van H 2 O 2 weerstand in verschillende genotypen van vliegen, het bestuderen van circadiane ritmen in vivo, het analyseren van slaapgedrag, en anderen 17,22-24.

Zoals elke methode, zijn er beperkingen aan deze monitoring systeem. Bij controle vliegen gedurende langere tijd, is er een potentieel voor vlieg dood, vooral bij gebruik van verouderde vliegen. Met alleen gezond vliegen zal helpen dit te voorkomen. We proberen ook om meer dan 3 biologische herhalingen per gebruikengroep als de vliegen zijn oude of gevoelig voor te sterven. Een oplossing is om vliegen houden slechts 2 dagen in de mobiliteit monitors en gebruiksgegevens verzameld gedurende dag 2 na vliegen hebben aangepast aan de omgeving. Indien dood we niet de verzamelde voor de flacon in berekeningen gegevens gebruiken. Hoewel we hebben gebruikt flacons verticaal in de Trikinetics activiteitsmonitoren, is er een mogelijkheid om de flesjes horizontaal plaatsen. We kiezen flesjes verticaal te plaatsen omdat het eten is onderin de flacon, die vergelijkbaar is met standaard incubator kweekomstandigheden. Hierdoor kunnen vliegen om meer ruimte te boven en beneden de flesjes lopen hebben, en het is meer vergelijkbaar met negatieve geotaxis experimenten. De vochtigheid van de incubator moet ook worden bewaakt als voedsel verdroging wordt een probleem 24. Dit systeem geeft de gegevens in termen van gemiddelde activiteit, en geen specifieke details over de aard van de activiteit. Bovendien, als twee vliegen kruisen de bundel tegelijkertijd, het will alleen worden opgetekend als een onderbreking. De hier beschreven protocol is handig voor het kwantificeren van de totale activiteit, maar andere protocollen kunnen nuttige gegevens te verstrekken als er meer gedetailleerde informatie, zoals de vlucht traject of snelheid gewenst 12,14,25.

Naar aanleiding van dit experiment, zal verschillen in spontane motorische activiteit als gevolg van genetische of ecologische manipulaties bekend zijn. Een toekomstige wijzigingen van dit protocol kunnen zijn voor de verschillende activiteiten van vliegen geanalyseerd op de bovenste, middelste en onderste ringen van de bevolking monitoren. Dit zou bepalen of de fly populaties grootste deel van hun tijd op de bodem van de flacon nabij de voeding of aan de bovenkant. Het protocol in zijn huidige vorm zorgt voor nauwkeurige, gelijktijdige kwantificering van spontane bewegingsactiviteit van Drosophila experimentele en controle populaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (AG023088 naar BR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25 x 95 mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
Name Company Catalog Number Comments
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
  2. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
  3. Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p, Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
  4. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  5. Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
  6. Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
  7. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
  8. Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
  9. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
  10. Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
  11. Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
  12. Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  13. Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
  14. Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
  15. Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
  16. Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
  17. Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
  18. Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
  19. Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
  20. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
  21. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  22. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
  23. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
  24. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, Cold Spring Harbor. (2010).
  25. Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).

Tags

Neurowetenschappen onderzoekstechnieken Life Sciences (Algemeen) Gedragswetenschappen, Fruitvliegen Spontane lichamelijke activiteit mobiliteit Fly gedrag bewegingsactiviteit
Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina,… More

Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter