ניטור Juxtacellular והלוקליזציה של Single נוירונים בתוך מבנים מוחיים תת-קליפת המוח של התראה, חולדות-מרוסן ראש
Summary
This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.
Abstract
There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.
Introduction
ניטור פעילות עצבית בבעלי חיים ערניים המעורבים באופן פעיל במשימה התנהגותית הוא קריטי להבנת התפקוד והארגון של מערכת העצבים. הקלטה תאית של הפעילות החשמלית מיחידות עצביות אחת כבר זמן רב כלי עיקרי של מדעי מוח ומערכות עדיין נרחב בשימוש כיום. מגוון רחב של סוגי אלקטרודה ותצורות זמינים בהתאם לדרישות המדעיות וטכניות של ניסוי מסוים. כרוני מושתל microdrives או מערכי אלקטרודה משמשים לעתים קרובות בבעלי חיים לנוע בחופשיות, כוללים ציפורים, מכרסמים, ופרימטים שאינם בני אדם 1-4. לחלופין, חדירות חריפות עם microelectrodes מתכת או זכוכית באמצעות micromanipulator חיצוני משמשות לעתים קרובות כדי להקליט מבעלי חיים מורדמים או-מרוסן ראש. יש לי אלקטרודות micropipette זכוכית היתרון שהם יכולים לשמש בjuxtacellular או "תא מצורף" תצורה לבודד באופן חד משמעיפעילות של נוירונים בודדים ללא סיבוכים של ספייק פוסט הוק-מיון 5. אלקטרודות אלה נוספים מאפשרות הקלטה מהתאים או במקומות אנטומית-מזוהים, כפי שהם יכולים להשתמש בהם כדי להזריק פיקדונות קטנים של קליעים נותבים צבע או neuroanatomical, או אפילו כדי למלא את הפרט נרשם תא. תצורה זו יושמה בהצלחה בחולדות, עכברים וציפורים 6-10. הטכניקה המתוארת כיום מתמקדת בניטור juxtacellular ופיקדונות צבע תאיים בכוננות, חולדות-מרוסן ראש. שים לב שתא בודד בניגוד juxtacellular ממלא, פיקדונות צבע אלה אינם מספקים מידע על מורפולוגיה של תאים או תחזיות axonal 11, אבל הם מאפשרים לוקליזציה אנטומי מדויקת לכ -50 מיקרומטר ו, ביקורתי, בעלי תשואה גבוהה באופן משמעותי בבעלי חיים ערניים. מידע בדבר תא בודד juxtacellular ממלא מסופק בכל זאת כאסטרטגיה חלופית לתיוג אנטומיים.
בקיצור,פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. בשלב הראשון, החולדה התאקלמה לריסון גוף בגרב בד (איור 1) על פני תקופה של 6 ימים. בשלב השני, מנגנון משענת ראש (איור 2) ותא הקלטה מושתל בניתוח כזה שהחולדה יכולה להישמר במטוס stereotaxic במהלך פגישות מרובות שלאחר מכן הקלטה (איור 3); הליך זה מאפשר הנסיין למקד אזורים תת-קליפת המוח מסוימים של המוח למחקר אלקטרו מבוסס על התייחסות סטנדרטית קואורדינטות 12. השלב השלישי כולל הצבת העכברוש בלנענע מתאים לביצוע ניסויים התנהגותיים ואלקטרו (איור 4), בניית האלקטרודה מצינור נימי קוורץ (איור 5), מה שהופך את הקלטות עצביות juxtacellular שבאופן חד משמעי לבודד יחידות בודדות 6-9, ו סימון locati אנטומייםבאתר ההקלטה עם צבע שיקגו סקיי בלו (איורים 6 ו -7). ההקלטות מבוצעות עם ניטור התנהגות בו-זמנית; עם זאת, לפרטים הטכניים של ההתנהגות יהיו תלויים במטרות המדעיות של כל ניסוי ולכן הם מעבר להיקף של פרוטוקול יחיד. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, שניתן לחזור על ימים מרובים, החיה מורדמים. המוח מופק ומעובד על פי טכניקות neuroanatomical סטנדרטיים או באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנייה לנענע הניסיוני
התיאור של החלקים מכאניים המשמשים לבנייה לנענע הניסוי (איור 4) מושמט מן הפרוטוקול, כפי שהוא יכול להיות בנוי במגוון דרכים. בהפגנה זו סטנדרטית אופטו-מכאני חלקים ומהדק תמיכה משמש להר בר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
| Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
| Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
| Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20-40 cp cyanoacrylate |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
| Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
| Silicone Gel | Dow Corning | Mar-80 | |
| Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
| Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
| Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
| Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining (Figure 7) |
| Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining (Figure 7) |
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
| PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
| Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
| Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
| Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
| Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
| Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
| ½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
| Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
| Stainless steel 0-80 1/8” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
| 0.2mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
| Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2, 3, 4 |
| Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figure 2, 3, 4 |
| Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
| 8-32 3/4” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
| 4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
| Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
| Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
| Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
| Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion |
| Figure 6A | |||
| Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
| Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
| Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |
References
- Fee, M. S., Leonardo, A. Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals. Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).
- Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex. Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).
- Szuts, T. A. A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals. Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).
- Roy, S., Wang, X. Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates. Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).
- Person, A. L., Perkel, D. J. Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning. The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).
- Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 10481061 (2010).
- Hellon, R. The marking of electrode tip positions in nervous tissue. The Journal of physiology. 214, 12P (1971).
- Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels. The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).
- Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats. Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).
- Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats. Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).
- Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales. Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).
- Moore, J. D. Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing. Nature. 497, 205-210 (2013).
- Duque, A., Zaborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing 3. , 197-236 (2006).
- . . Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , .
- . . Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , .
- Urbain, N., Deschênes, M. Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation). Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).
